預防靜脈橋再狹窄的基因治療研究現(xiàn)狀

張華鋒 高榮

綜述

預防靜脈橋再狹窄的基因治療研究現(xiàn)狀

張華鋒 高榮

基因治療；內膜增生；動脈粥樣硬化；靜脈橋再狹窄

動脈粥樣硬化導致的冠狀動脈疾病是全世界疾病死亡的一個主要原因。對于輕度至中度或慢性穩(wěn)定的冠狀動脈疾病而言，藥物療法有助于控制癥狀并延緩疾病進展，但經(jīng)皮介入治療和冠狀動脈旁路移植手術（coronary artery bypass graft，CABG）在急性或嚴重的情況下是必要的。雖然近年來經(jīng)皮介入治療有了快速的發(fā)展，但不可否認的是CABG仍然是非常有效的方法，并且有證據(jù)表明對某些患者來說是一種最佳的治療[1，2]。由于大隱靜脈取材方便且長度充足等原因，使其成為最常用的血管橋材料來源。有文獻報道，在所有靜脈移植中，自體隱靜脈移植術達70%以上[3]。

術后1年有15%～20%的靜脈橋血管發(fā)生再狹窄或閉塞，術后10年達50%以上[2-4]。近年來，手術技術的提高、抗血小板藥物和他汀類藥物等的應用已經(jīng)有效地減少了靜脈橋再狹窄及主要不良心血管事件的發(fā)生率。但從1968年CABG應用以來，整體靜脈移植失敗率一直保持相對恒定[5]，而基因治療作為潛在的治療方法得以發(fā)展。

1 靜脈移植的病理生理學

阻斷靜脈的血液供應，將導致缺血和細胞缺氧，術后容易受到缺血再灌注（IR）損傷。CABG術后，移植靜脈發(fā)生“動脈化”，突然增加的血管壓力及剪切力加重了內皮細胞的損傷，在某些情況下甚至導致細胞死亡。這種血流動力學的改變導致細胞基因表達的改變，并且促進炎癥反應和細胞增殖，進而導致血小板的黏附、活化和聚集，白細胞募集及體內凝血系統(tǒng)的激活，產生一系列級聯(lián)反應。血管損傷后，局部生長因子和激素刺激血管壁平滑肌細胞表型發(fā)生改變。靜脈移植術后24小時內，血管平滑肌細胞經(jīng)歷了靜止、增殖、合成和運動等一系列過程；術后7天，平滑肌細胞遷移進入內膜并開始表達細胞外基質基因[6]。內膜增生（IH）被認為是靜脈橋再狹窄的標志。

2 基因載體

2.1 非病毒載體

2.1.1 裸質粒、脫氧核苷酸（ODN）、小干擾RNA（siRNA） 上述各載體能有效轉染內皮細胞和平滑肌細胞，影響轉基因的表達。Santel等[7]證明，對小鼠內皮細胞siRNA進行熒光標記20分鐘后就可在全身系統(tǒng)中觀察到。除了針對靜脈橋再狹窄的早期階段，非病毒載體在兔靜脈移植模型中用來觀察術后8周的誘導轉基因表達情況。SiRNA和shRNA在靜脈壁內可以用來靶基因的沉默表達，ODN是基因治療的獨特方法。這些基因靶向工具在基因組中通常由具有轉錄因子結合位點的短雙鏈DNA序列組成，并且在細胞增殖階段誘導基因轉錄的終止。重要的是，ODN和siRNA的體外傳遞已被實驗和臨床證明是安全的[8]。

2.1.2 納米顆粒 納米粒子（NPs）是亞微米聚合物膠體粒子，可以影響基因的持續(xù)傳遞，并具有良好的安全性。持續(xù)基因傳遞在抑制SMC增殖方面是特別有幫助的。雖然目前尚無研究用聚合物納米粒子防止靜脈橋再狹窄的基因傳遞，但研究人員證實了平滑肌細胞和內皮細胞能高效吸收聚合物納米粒子[9]?？傊{米粒子作為一種防止靜脈橋再狹窄的基因傳遞方法有其發(fā)展價值。

2.2 病毒載體

2.2.1 腺病毒載體 腺病毒（Ad）是無包膜的雙鏈DNA病毒，腺病毒載體具有較大的裝載能力，能有效地轉染分裂和靜止的細胞，并在感染后數(shù)小時內就可表達轉基因。它們具有廣泛的細胞嗜性和轉基因表達，約60%的人對腺病毒抗體的反應是陽性[10]，因此，腺病毒在人類系統(tǒng)傳遞其感染效率將被保證。第一代腺病毒由于其大的基因組（約30 kb）和在感染細胞中病毒基因的共同表達使其免疫原性也相當大。體內腺病毒載體的基因表達通常在7天達到高峰，28天消失[11]。腺病毒介導的β-ARKct轉染抑制移植靜脈內膜增生的發(fā)展[12]。

2.2.2 腺相關病毒載體 腺相關病毒是細小病毒家族的單鏈DNA病毒。腺相關病毒載體（AAV）的幾個特點表明，它是一種很有前途的基因轉移載體，它比腺病毒更適合于血管基因的治療[13]。AAV影響長期的基因表達（數(shù)月至數(shù)年），尤其是在對SMC增殖方面尤為顯著。持續(xù)的AAV介導的轉基因表達、SMC增殖和遷移的抑制可能有助于防止晚期移植失敗，并在基因傳遞時提供被感染的靶細胞。重組腺病毒相關載體是刪除所有病毒基因，因此相比腺病毒而言大大降低了免疫原性，并且在實驗和臨床中顯示出了良好的安全性[14]。AdCMVCD在兔靜外靜脈實驗中表明，其自殺基因系統(tǒng)對CABG術后再狹窄有明顯的治療作用[15]。

2.2.3 慢病毒載體 慢病毒是來自逆轉錄病毒家族。慢病毒載體能高效轉染血管組織，具有低免疫原性，并產生持久的轉基因表達[16]。然而，潛在的插入突變是一個重要的安全問題，從而降低了慢病毒載體用于人類的熱情。另外，非整合載體已被開發(fā)，但它們的安全性和有效性還沒有得到完全的肯定。

3 分子靶向治療策略

3.1 內皮損傷和內皮血管保護因子損失 一氧化氮（NO）在舒張血管、調節(jié)血流、抑制血管平滑肌細胞增殖、抑制血小板聚集和白細胞黏附方面發(fā)揮著重要的生理功能。冠心病的發(fā)生、發(fā)展與內皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因密切相關，eNOS是NO合成的限速酶。Marsden等首先報道了這一基因，詳細闡述了該基因的結構和染色體定位，并發(fā)現(xiàn)人類eNOS基因存在多態(tài)性[17]。用腺病毒介導的eNOS治療大隱靜脈證明其增加了NO的釋放并提高了血管的功能。在同一組另一項研究對人取材的大隱靜脈進行體外培養(yǎng)，并對內膜增生與對照組相比進行了組織學評估，表明用腺病毒介導的eNOS處理過的靜脈段內膜增生明顯減少[18]。在犬和高膽固醇血癥兔的移植模型中將牛eNOS cDNA封裝在日本凝血病毒（HVJ）中并行脂質轉染，在術后4周觀察到內膜增生明顯減少[19]。王曉明等[20]的研究表明，取山羊頸靜脈作血管橋，移植到頸動脈上，術后30天免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)eNOS基因轉移可以有效抑制移植血管新生內膜的增生，對預防移植血管的狹窄有一定作用。但由于eNOS基因多態(tài)性的存在，這也給臨床進一步研究冠心病的治療策略帶來了些許難點。

PGI2由正常的內皮細胞產生，能抑制血小板聚集、白細胞黏附及平滑肌細胞增殖。環(huán)氧合酶-1（COX-1）是PGI2合成的限速酶。有實驗表明，在豬的頸動脈血管移植模型上COX-1的腺病毒過度表達增加了PGI2的產生并防止動脈血栓形成。在完整的內皮細胞，由于移植物再灌注后活性氧的產生會使內皮功能受到影響，在這種情況下研究出了超氧陰離子（O2-），其與NO反應形成弱血管擴張劑過氧亞硝基陰離子（ONOO-）。超氧化物歧化酶（SOD）催化O2-在過氧化氫酶的作用下轉化為過氧化氫（H2O2）。在小鼠缺血再灌注損傷模型中過氧化氫酶基因治療能改善其肝功能，但尚未被應用到靜脈橋再狹窄模型中[21]。

3.2 血栓形成 在術后早期血栓形成是導致移植靜脈失敗的主要原因，雖然抗凝可降低早期移植血栓形成的風險，但不能避免。此外，全身抗凝治療有一定的副作用，主要是出血并發(fā)癥，這在術后是特別危險的。抑制靜脈移植血栓形成的基因治療將繞過這些系統(tǒng)性的副作用。抗栓治療的基因策略包括抑制凝血因子、抗凝因子的過度表達，或內皮細胞生物學功能的調節(jié)。兩個主要目標是血栓調節(jié)蛋白（TM）和組織型纖溶酶原激活物（tPA）。阿司匹林在小鼠模型中局部應用減少了靜脈移植物的血栓形成。在臨床試驗中阿司匹林的應用雖然術后1年減少了靜脈橋再狹窄的概率，但其遠期效果仍需進一步證實[22]。在移植術后，TM、tPA表達減少，然而tPA對內膜增生的作用尚不清楚。在兔動脈損傷模型，Ad-tPA促進了內膜增生，可能是由于TPA對ECM的降解[23]。相反，在兔移植靜脈模型中，4周后Ad-tPA降低減少了內膜增生。這些結果也許可以用內膜增生在動脈和靜脈中的發(fā)病機制不同來解釋，還需要進一步的研究來確定在靜脈橋移植模型中tPA的過度表達對內膜增生沒有不利的影響。另外，在動脈損傷模型上，組織因子途徑抑制物（TFPI）基因轉移和截斷PDGF-β受體基因用來防止血栓形成和抑制新生內膜形成[24]。

3.3 炎癥 在移植術后1周，靜脈壁內皮損傷部位血小板活化，啟動炎癥級聯(lián)反應，促進SMC增殖、內膜增厚，加速動脈粥樣硬化，進而使白細胞活化并遷移，活化的白細胞、內皮細胞、平滑肌細胞分泌大量的細胞因子和生長因子，促進炎癥反應，包括IL-1、IL-6、MCP-1、IL-8及TNF-α。在大鼠靜脈橋移植模型，術后4周巨噬細胞逐漸耗盡，MCP-1和TGF-β的表達減少，內膜厚度變薄，這導致了幾種方法的產生來阻斷巨噬細胞的聚集。MCP-1是其中之一。在大鼠靜脈移植模型術后數(shù)小時內，MCP-1開始上調，在第1周達到高峰，并持續(xù)至少8周[25]。眾多的炎性細胞因子和黏附分子的轉錄由NF-κB上調，壓力介導的靜脈橋管腔和外膜的轉染和NF-κB誘導的ODN，在犬和高膽固醇血癥兔模型中證明減少了內膜厚度及平滑肌細胞增殖[26]。

另一種方法是利用痘苗病毒蛋白35K來廣泛抑制炎癥反應。35K是一種可溶性蛋白，它可以與趨化因子CC結合，進而阻礙其與趨化因子受體的結合，并在體內外影響其生理效應的發(fā)揮。與喂食普通飼料的ApoE-/-小鼠相比，喂食高脂肪飲食的ApoE-/-小鼠靜脈注射腺病毒編碼的35K，可降低全身動脈粥樣硬化，減少移植靜脈血管壁的增厚和巨噬細胞浸潤[27]。

3.4 平滑肌細胞增殖與遷移 平滑肌細胞是內膜病變的優(yōu)勢細胞。平滑肌細胞靶向基因治療的目的是恢復細胞的靜止。隨著SMC激活，細胞外基質被基質金屬蛋白酶（MMPs）降解，進而促進SMC增殖和遷移到內膜。George等[28]發(fā)現(xiàn)，在豬靜脈移植模型中，基質金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMP）-3的過度表達在短期（術后28天）和長期（3個月）都有效降低了內膜的增生。有文獻表明，移植靜脈吻合后，血管壁壓力的增加上調成纖維細胞生長因子（FGF）和血小板衍生生長因子（PDGF），這兩者對于SMC的有絲分裂和趨化都是有效的。Mann等[29]在兔頸靜脈頸總動脈移植模型中針對SMC增殖，利用反義ODN來抑制細胞周期中調控基因細胞增殖核抗原（PCNA）和cdc2激酶的表達。許多有絲分裂原通過G蛋白耦聯(lián)受體（GPCRs）介導SMC增殖。

PI3K可以被許多生長因子受體和G蛋白耦聯(lián)受體所激活，針對PI3K通路的治療效果在西羅莫司（雷帕霉素）洗脫支架的臨床試驗中已被證明，其可有效地抑制內膜增生和經(jīng)皮冠狀動脈介入術后再狹窄[30]。

4 小結

實驗的成功并不代表在臨床上能達到相同的效果，仍需更多的工作來研究人類靜脈橋再狹窄的分子通路，否則一旦用于臨床，這些問題導致的結果可能會令人失望。即使基因療法治療靜脈橋再狹窄成功應用于臨床，也不可能只針對單通道將所有患者治療成功，針對不同的通路和細胞類型聯(lián)合應用可能有協(xié)同作用。同樣的，結合基因治療與其他方法可能會比任何單一方法能得到更令人滿意的結果。

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Research status of gene therapy in preventing restenosis of vein bridge

Gene therapy；Neointimal hyperplasia；Atherosclerosis；Vein graft restenosis

010050 內蒙古自治區(qū)呼和浩特市，內蒙古醫(yī)科大學研究生學院（張華鋒）；內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心臟大血管外科（高榮）

高榮，E-mail：gaorong1002@sina.com

10．3969/j．issn．1672－5301．2016．02．002

R543.6

A

1672-5301（2016）02-0101-05

2015-09-22）