一株亞硝化細(xì)菌的分離鑒定及其發(fā)酵工藝優(yōu)化

趙彭年, 楊德玉, 王加友, 丁一凡, 安 鵬, 王 遠(yuǎn)

沈陽(yáng)化工研究院有限公司生物與醫(yī)藥研究所, 沈陽(yáng) 110021

亞硝化細(xì)菌(又稱氨氧化菌)在自然界中分布十分普遍，其在土壤、淡水及海洋中都有存在。亞硝化細(xì)菌對(duì)環(huán)境的變化等較為敏感[1]，其通過(guò)氧化水中的氨氮作為唯一能量來(lái)源以維持自身生長(zhǎng)需要，以碳酸鹽為碳源、以氨氮為氮源來(lái)合成細(xì)胞所需物質(zhì)，是典型的自養(yǎng)型細(xì)菌。其代謝氨氮氧化反應(yīng)式為2NH3+3O2=2HNO2+2H2O[2,3]。亞硝化細(xì)菌生長(zhǎng)緩慢，平均生長(zhǎng)代時(shí)在10 h以上[4]，且其不能在有機(jī)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，對(duì)營(yíng)養(yǎng)的專一性較強(qiáng)，從而使得其分離和擴(kuò)大培養(yǎng)較為困難。

亞硝化細(xì)菌在污水氨氮降解過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，是脫氮過(guò)程中的限速反應(yīng)步驟，在污水處理研究中，利用亞硝化細(xì)菌進(jìn)行氨氮去除及氨氮短程硝化的應(yīng)用越來(lái)越多[5,6]，但多數(shù)停留在菌株分離、搖瓶培養(yǎng)的階段，而在發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵的研究報(bào)道相對(duì)較少。此外，在污水處理前期需要投加較多的亞硝化細(xì)菌進(jìn)行氨氮的有效降解，然而由于亞硝化細(xì)菌的高密度發(fā)酵較為困難，且產(chǎn)量較少，目前只有少數(shù)外資企業(yè)掌握相關(guān)技術(shù)，使得亞硝化細(xì)菌菌劑的市場(chǎng)價(jià)格較高，嚴(yán)重影響了亞硝化細(xì)菌在污水處理過(guò)程中的應(yīng)用?；诖?，本研究將沿海污泥富集培養(yǎng)后，通過(guò)硅膠平板和水洗瓊脂平板分離得到1株亞硝化細(xì)菌并命名為Sys NC-02，通過(guò)搖瓶培養(yǎng)、正交試驗(yàn)對(duì)其培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基組分進(jìn)行優(yōu)化，利用10 L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵并進(jìn)一步優(yōu)化發(fā)酵工藝，以期對(duì)其后續(xù)工業(yè)化生產(chǎn)起到重要的指導(dǎo)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1培養(yǎng)基 亞硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基：0.5% Na2CO3、0.4% (NH4)2SO4、0.1% K2HPO4、0.005% MgSO4、0.2% NaCl，加蒸餾水至1 L，混勻溶解，調(diào)節(jié)pH至8.0。

亞硝化細(xì)菌硅膠平板分離培養(yǎng)基：在亞硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入硅膠[7]。

亞硝化細(xì)菌水洗瓊脂平板分離培養(yǎng)基：在亞硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入水洗瓊脂[7]。

1.1.2主要儀器設(shè)備 ZWYR-D2402型搖床(上海智城分析儀器制造有限公司)、T100型PCR擴(kuò)增儀(Bio-RAD)、BIOTECH-10BGZA型發(fā)酵罐(上海保興生物設(shè)備有限公司)、Cleverchem380型水質(zhì)分析儀(德國(guó)DeChem-Tech公司)、HQ30d型便攜式溶氧測(cè)定儀(美國(guó)HACH公司)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1氨氮的測(cè)定方法 水楊酸比色法[8]。

1.2.2亞硝態(tài)氮(即亞硝酸鹽)的測(cè)定方法 N-(1-萘基)-二乙胺光度法[8]。

1.2.3亞硝化速率測(cè)定的方法 在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，亞硝化細(xì)菌在靜止的發(fā)酵液中沉降速度較快，若利用分光光度計(jì)測(cè)量其OD值，結(jié)果重現(xiàn)性較差；而采用MPN計(jì)數(shù)法[9]則存在計(jì)數(shù)時(shí)間長(zhǎng)、計(jì)數(shù)干擾因素多等問(wèn)題，不利于試驗(yàn)的快速進(jìn)行?；陉惤鹇暫褪芳伊篬10]的亞硝化速率測(cè)定方法、陳捷音[11]的亞硝化細(xì)菌檢測(cè)方法，以及亞硝化細(xì)菌氧化氨氮為零級(jí)反應(yīng)[12]的理論依據(jù)，選擇通過(guò)測(cè)定發(fā)酵液的亞硝化速率來(lái)表示發(fā)酵液中的亞硝化細(xì)菌的數(shù)量及活性。

①用單位時(shí)間生成亞硝態(tài)氮的量測(cè)定亞硝化速率。取某發(fā)酵時(shí)段發(fā)酵液10 mL加入裝有190 mL的亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基的1 L三角搖瓶中，于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，每隔0.5 h取樣，以開(kāi)始培養(yǎng)的時(shí)間點(diǎn)作為零點(diǎn)，利用Cleverchem 380分析儀測(cè)量亞硝態(tài)氮的濃度，以亞硝態(tài)氮的濃度為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，得到的斜率乘以稀釋倍數(shù)(20倍)就是此時(shí)段的亞硝化速率。

②用單位時(shí)間消耗氨氮的量測(cè)定亞硝化速率。取某發(fā)酵時(shí)段發(fā)酵液10 mL加入裝有190 mL的亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基的1 L三角搖瓶中，于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，每隔0.5 h取樣，以開(kāi)始培養(yǎng)的時(shí)間點(diǎn)作為零點(diǎn)，利用Cleverchem 380分析儀測(cè)量氨氮的濃度，以氨氮的濃度為縱坐標(biāo)、培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)作圖，得到的斜率乘以稀釋倍數(shù)(20倍)就是此時(shí)段的氨氮氧化速率。由于單位時(shí)間內(nèi)的氨氮大多數(shù)被轉(zhuǎn)化為亞硝態(tài)氮，所以可以用此方法間接計(jì)算亞硝化速率。

1.3 亞硝化細(xì)菌的分離鑒定

1.3.1亞硝化細(xì)菌的分離 將取自大連海水灣的污泥樣品加入含有200 mL富集培養(yǎng)基的1 L三角揺瓶中，于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，直到體系中氨氮全部降解并有亞硝態(tài)氮累積。

吸取0.5 mL富集培養(yǎng)液，均勻涂布在硅膠平板上，于30℃恒溫培養(yǎng)。待硅膠平板上長(zhǎng)出針尖大小的菌落后，挑取硅膠平板上多個(gè)單菌落并分別在瓊脂平板上劃線，于30℃恒溫培養(yǎng)。再挑取瓊脂平板上的菌體分別接入含有20 mL亞硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基的100 mL三角揺瓶中，于30℃、180 r/min搖床培養(yǎng)，并于培養(yǎng)過(guò)程中檢測(cè)發(fā)酵液中的亞硝態(tài)氮濃度，選取可不斷生成亞硝態(tài)氮的菌株繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)亞硝化細(xì)菌在揺瓶中生長(zhǎng)到一定濃度后靜置沉降，向濃縮的菌液加入等體積的50%甘油，分裝于菌種管內(nèi)于-70℃保存。

1.3.2亞硝化細(xì)菌的鑒定 利用收集的亞硝化細(xì)菌菌體提取菌株基因組DNA，以提取的DNA為模版，以5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAACG-3′、5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系(50 μL)：DNA 模板1 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，1 mmol/L引物各1 μL，10×Loading Buffer 5 μL，5 U/μLTaq酶0.5 μL，ddH2O 37.5 μL。擴(kuò)增程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，52℃ 60 s， 72℃ 2 min，共30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物交至蘇州金唯智生物科技有限公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST中進(jìn)行序列對(duì)比，利用MEGA 7.0軟件以Neighborjoining法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并將菌株命名為Sys NC-02。

1.4 亞硝化細(xì)菌氨氮去除能力考察

將新分離獲得的亞硝化細(xì)菌Sys NC-02與本實(shí)驗(yàn)室原有的1株亞硝化細(xì)菌Nitrosomonassp. HPC101進(jìn)行對(duì)比，以考察Sys NC-02的氨氮去除能力。

分別吸取Sys NC-02和HPC101的培養(yǎng)液接種于含有亞硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基的揺瓶中，通過(guò)調(diào)整接種體積使2種亞硝化細(xì)菌在揺瓶?jī)?nèi)的亞硝化速率相同，同時(shí)放入搖床中培養(yǎng)(30℃、180 r/min)。每隔0.5 h取樣，48 h后，檢測(cè)發(fā)酵液中氨氮含量并計(jì)算氨氮去除率，同時(shí)通過(guò)測(cè)定亞硝態(tài)氮濃度來(lái)計(jì)算亞硝化速率，進(jìn)而考察2種亞硝化細(xì)菌的氨氮去除能力及生長(zhǎng)能力。

1.5 亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1.5.1溫度、pH、溶解氧濃度對(duì)亞硝化細(xì)菌的影響 最適溫度確定：將Sys NC-02菌液分別接種于6個(gè)含有亞硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基(pH 8.0)的1 L三角瓶中，分別在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃條件下，180 r/min搖床培養(yǎng)。最適pH確定：分別向pH為6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的5個(gè)含有亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基的1 L三角瓶中接種Sys NC-02菌液，于最適溫度、180 r/min搖床培養(yǎng)。最適溶解氧濃度確定：將Sys NC-02菌液分別接種于7個(gè)含有亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)基(最適pH)的1 L三角瓶中，在最適溫度下，分別以80 r/min、100 r/min、120 r/min、140 r/min、160 r/min、180 r/min、200 r/min進(jìn)行搖床培養(yǎng)，并用溶氧儀測(cè)量發(fā)酵液的溶解氧濃度。上述處理均需每隔0.5 h取樣，測(cè)量發(fā)酵液中的亞硝態(tài)氮的濃度，通過(guò)比較計(jì)算得到的亞硝化速率大小來(lái)確定培養(yǎng)亞硝化細(xì)菌Sys NC-02的最適溫度、pH和溶解氧濃度。

1.5.2亞硝態(tài)氮濃度對(duì)亞硝化細(xì)菌的影響 分別向含有亞硝態(tài)氮濃度為50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、500 mg/L、1 000 mg/L、1 500 mg/L、2 000 mg/L的亞硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基(最適pH)的1 L三角揺瓶中接種Sys NC-02菌液，在最適溫度下，于120 r/min搖床培養(yǎng)。每隔0.5 h取樣，測(cè)量發(fā)酵液中氨氮的濃度，通過(guò)計(jì)算得到的氨氮氧化速率大小確定發(fā)酵過(guò)程中亞硝態(tài)氮(即亞硝酸鹽)累積對(duì)亞硝化細(xì)菌Sys NC-02的影響。

1.6 亞硝化細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

1.6.1培養(yǎng)基組分單因素實(shí)驗(yàn) 最適碳源篩選：在不含Na2CO3的亞硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基中分別加入0.5%的Na2CO3、NaHCO3、CaCO3，每個(gè)處理3次重復(fù)，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，考察不同碳源對(duì)Sys NC-02生長(zhǎng)的影響。最適碳源作為下一步實(shí)驗(yàn)用碳源。最適氮源篩選：在不含(NH4)2SO4的亞硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基中分別加入0.4%的(NH4)2SO4、NH4NO3、NH4Cl，每個(gè)處理3次重復(fù)，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，考察不同氮源對(duì)Sys NC-02生長(zhǎng)的影響。最適氮源作為下一步實(shí)驗(yàn)用氮源。最適磷酸鹽篩選：在不含K2HPO4的亞硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基中分別加入0.1%的K2HPO4、KH2PO4、NaH2PO4，每個(gè)處理3次重復(fù)，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定不同磷酸鹽對(duì)Sys NC-02生長(zhǎng)的影響。最適磷酸鹽作為下一步實(shí)驗(yàn)用磷酸鹽。最適微量元素篩選：在不含MgSO4的亞硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基中分別加入0.005%的MnSO4、FeSO4、MgSO4，每個(gè)處理3次重復(fù)，在最優(yōu)培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，測(cè)定不同微量元素對(duì)Sys NC-02生長(zhǎng)的影響。

1.6.2培養(yǎng)基組分正交試驗(yàn) 根據(jù)1.6.1的結(jié)果，選定培養(yǎng)基中4個(gè)營(yíng)養(yǎng)組分，設(shè)計(jì)4因素3水平試驗(yàn)，各因素的試驗(yàn)水平見(jiàn)表1。在最優(yōu)培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，通過(guò)比較不同處理的亞硝化速率大小來(lái)對(duì)培養(yǎng)基中各成分的含量進(jìn)行調(diào)整。

1.6.3污水處理效果對(duì)比 分別向優(yōu)化培養(yǎng)基和原培養(yǎng)基中接種相同體積的Sys NC-02菌液，于最優(yōu)培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后將2種培養(yǎng)基中的Sys NC-02菌液以相同的接種量分別接種至含有氨氮污水的三角揺瓶中，于30℃、180 r/min搖床中培養(yǎng)。每12 h取樣，檢測(cè)污水中氨氮含量并計(jì)算氨氮去除率，進(jìn)而驗(yàn)證培養(yǎng)基優(yōu)化后亞硝化細(xì)菌對(duì)污水的處理效果。

表1 正交設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test.

1.7 亞硝化細(xì)菌10 L發(fā)酵罐小試生產(chǎn)條件優(yōu)化

利用10 L發(fā)酵罐進(jìn)行高密度發(fā)酵，以優(yōu)化小試生產(chǎn)條件。利用亞硝化細(xì)菌在發(fā)酵液中靜止后易沉降及其在發(fā)酵過(guò)程中不需要絕對(duì)無(wú)菌的特點(diǎn)，以新鮮培養(yǎng)基對(duì)亞硝化細(xì)菌發(fā)酵過(guò)程中的發(fā)酵液進(jìn)行置換，以降低發(fā)酵液中亞硝態(tài)氮(即亞硝酸鹽)的濃度，從而大幅降低亞硝酸鹽對(duì)亞硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)抑制作用以實(shí)現(xiàn)亞硝化細(xì)菌的高密度發(fā)酵。

在亞硝化細(xì)菌發(fā)酵后期，亞硝態(tài)氮濃度累積到抑制濃度(即該濃度對(duì)亞硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用)之前，停止攪拌和通氣，使亞硝化細(xì)菌沉降30 min，然后吸走發(fā)酵上清液，保留的發(fā)酵液體積為原體積的1/3，再補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基至原體積，開(kāi)啟攪拌及通氣繼續(xù)發(fā)酵。當(dāng)亞硝態(tài)氮濃度再次累積到抑制濃度時(shí)繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵液置換，置換的次數(shù)由發(fā)酵罐的供氧能力和亞硝態(tài)氮再次到達(dá)抑制濃度的時(shí)間來(lái)決定。

1.8 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2013軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行處理與作圖，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

然后我發(fā)現(xiàn)他們誰(shuí)也沒(méi)有把我這句話聽(tīng)進(jìn)去，我把這句話說(shuō)了好幾遍，到頭來(lái)只有我一個(gè)人聽(tīng)進(jìn)去了。這時(shí)候我打算離開(kāi)了，我心想不能再這么混下去了，我們從原先那個(gè)家搬到這個(gè)新的家里來(lái)，都有一個(gè)星期了，我每天都在這里整理、整理的，滿屋子都是油漆味和灰塵在揚(yáng)起來(lái)。我才二十四歲，可我這一個(gè)星期過(guò)得像個(gè)忙忙碌碌的中年人一樣，我不能和自己的青春分開(kāi)得太久了，于是我就站到廚房和書(shū)房的中間，我對(duì)我的父母說(shuō)：“我不能幫你們了，我有事要出去一下?！?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株分離鑒定

將海洋污泥富集培養(yǎng)后，經(jīng)硅膠平板和水洗瓊脂平板分離得到單菌落的亞硝化細(xì)菌，其在水洗瓊脂平板培養(yǎng)基上形成的菌落較小、呈圓形、周邊光滑、油狀、半透明。生物顯微觀察顯示其細(xì)胞體呈短桿狀、表面光滑，革蘭氏染色為陰性。

將測(cè)得的16S rDNA基因序列通過(guò)GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)，利用MEGA 7.0軟件以Neighborjoining法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。如圖1所示，菌株Sys NC-02與Nitrosomonaseuropaeastrain C-31菌株的同源性為100%，初步確定Sys NC-02屬于亞硝化單胞菌Nitrosomonassp.。

2.2 菌株氨氮去除能力

將Sys NC-02菌株與本實(shí)驗(yàn)室原有的1株亞硝化細(xì)菌Nitrosomonassp. HPC101進(jìn)行對(duì)比，由表2可知，新分離得到的亞硝化細(xì)菌Sys NC-02的氨氮去除率和生長(zhǎng)能力都具有較為明顯的優(yōu)勢(shì)，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。

圖1 亞硝化細(xì)菌的同源性分析Fig.1 Homology analysis of nitrite bacteria.

菌株初始亞硝化速率[mg(N-NO-2)/L·h]最終亞硝化速率[mg(N-NO-2)/L·h]氨氮去除率Sys NC-023.25.878.2%Nitrosomonas sp.HPC1013.24.353.5%

2.3 亞硝化細(xì)菌培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.3.1最適溫度 在不同溫度條件下培養(yǎng)Sys NC-02，并測(cè)量發(fā)酵液中亞硝態(tài)氮的濃度，進(jìn)而計(jì)算相應(yīng)的亞硝化速率。由圖2可知，15℃時(shí)，亞硝化速率幾乎為零；隨著溫度升高，亞硝化速率逐漸升高，30℃時(shí)，亞硝化速率達(dá)到最大值；而后，隨著溫度升高，亞硝化速率逐漸降低。由此可推測(cè)，溫度過(guò)高或過(guò)低時(shí)都會(huì)影響亞硝化細(xì)菌氨氧化酶的活性，從而影響亞硝化速率的大小。因此，培養(yǎng)亞硝化細(xì)菌Sys NC-02的最適溫度為30℃。

圖2 溫度對(duì)亞硝化細(xì)菌的影響Fig.2 The effect of temperature on nitrite bacteria.

2.3.2最適pH 在不同pH條件下培養(yǎng)Sys NC-02，并測(cè)量發(fā)酵液中亞硝態(tài)氮的濃度，進(jìn)而計(jì)算相應(yīng)的亞硝化速率。一般認(rèn)為亞硝化細(xì)菌的最適pH為7.5～8.5。從圖3可以看出，pH為8.0時(shí)，亞硝化速率最大；pH低于8.0時(shí)，亞硝化速率呈遞減趨勢(shì)；pH高于8.0時(shí)，亞硝化速率急劇下降，這可能是在pH為8.5時(shí)，游離氨濃度的增加抑制了亞硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)代謝[13,14]。由此可知，培養(yǎng)亞硝化細(xì)菌Sys NC-02的最適pH為8.0。

2.3.3最適溶解氧濃度 亞硝化細(xì)菌屬于好氧菌，發(fā)酵液中的溶解氧在其生長(zhǎng)過(guò)程中起著重要作用。在30℃、pH 8.0的條件下，將Sys NC-02置于不同轉(zhuǎn)速的搖床中進(jìn)行培養(yǎng)，用溶氧儀測(cè)量發(fā)酵液中的溶解氧濃度，同時(shí)，測(cè)量發(fā)酵液中亞硝態(tài)氮的濃度，進(jìn)而計(jì)算相應(yīng)的亞硝化速率。

圖3 pH對(duì)亞硝化細(xì)菌的影響Fig.3 The effect of pH on nitrite bacteria.

由圖4可知，最初亞硝化細(xì)菌的亞硝化速率隨著溶解氧濃度的升高而增大；當(dāng)轉(zhuǎn)速大于120 r/min、溶解氧濃度高于1.8 mg/L時(shí)，亞硝化速率趨于穩(wěn)定，不再隨溶解氧濃度的升高而增大。這說(shuō)明溶解氧濃度≥1.8 mg/L時(shí)即可滿足亞硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)需求。因而，從經(jīng)濟(jì)方面考慮，在發(fā)酵過(guò)程中保持溶解氧濃度≥1.8 mg/L是較為合適的。

圖4 溶解氧濃度對(duì)亞硝化細(xì)菌的影響Fig.4 The effect of dissolved oxygen concertration on nitrite bacteria.

圖5 亞硝態(tài)氮濃度對(duì)亞硝化細(xì)菌的影響Fig.5 The effect of nitrite concentration on nitrite bacteria.

2.4 亞硝化細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.4.1單因素實(shí)驗(yàn) 以亞硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，利用不同的碳源、氮源、磷酸鹽和微量元素，考察不同組分對(duì)亞硝化細(xì)菌生長(zhǎng)的影響。由圖6可知，通過(guò)4組單因素實(shí)驗(yàn)及差異顯著性分析結(jié)果(P<0.05)可以確定，最優(yōu)培養(yǎng)基組合：碳源為NaHCO3、氮源為(NH4)2SO4、磷酸鹽為KH2PO4、微量元素為FeSO4。

2.4.2正交試驗(yàn) 根據(jù)上述單因素實(shí)驗(yàn)篩選結(jié)果，NaHCO3、(NH4)2SO4、KH2PO4、FeSO4分別為最適碳源、氮源、磷酸鹽和微量元素。將各因素做正交試驗(yàn)，選用正交表L9(34)進(jìn)行正交設(shè)計(jì)(表3)，以優(yōu)化亞硝化細(xì)菌發(fā)酵培養(yǎng)基組分。

由表3可知，4種因素對(duì)亞硝化細(xì)菌生長(zhǎng)的影響大?。?NH4)2SO4>NaHCO3>KH2PO4>FeSO4。同時(shí)，發(fā)酵培養(yǎng)基中最佳組合為A2、B3、C2、D2，即亞硝化細(xì)菌最佳培養(yǎng)基組成為0.5% NaHCO3、0.8% (NH4)2SO4、0.1% KH2PO4、0.01% FeSO4。

圖6 不同組分對(duì)亞硝化細(xì)菌亞硝化速率的影響Fig.6 The effects of different media on nitrosation rate of nitrite bacteria.注:不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。

編號(hào)因素A:NaHCO3B:(NH4)2SO4C:KH2PO4D:FeSO4最終亞硝化速率[mg(N-NO-2)/L·h]111114.1212226.8313338.1421235.8522316.36231211.1731324.8832136.19332110.2K16.3334.9007.1006.867K27.7336.4007.6007.567K37.0339.8006.4006.667R1.4004.9001.2000.900

注：R為系列因素的極差，其絕對(duì)值大小代表不同因素對(duì)亞硝化細(xì)菌生長(zhǎng)的影響程度，R越大，影響程度越大，反之亦同。Ki為不同因素不同水平所對(duì)應(yīng)試驗(yàn)指標(biāo)之和的平均值，選擇較大的Ki值所對(duì)應(yīng)的水平作為該因素的最佳水平，即若某因素的K2>K1，則選擇水平2作為該因素的最佳水平。

2.4.3污水處理效果對(duì)比 分別向優(yōu)化培養(yǎng)基和原培養(yǎng)基中接種相同體積的Sys NC-02菌液，于最優(yōu)培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，再以相同的接種量分別接種于含有氨氮污水的三角揺瓶中，以驗(yàn)證培養(yǎng)基優(yōu)化后亞硝化細(xì)菌對(duì)污水的處理效果。由圖7可知，處理36 h后，優(yōu)化培養(yǎng)基組對(duì)氨氮的降解效果顯著優(yōu)于原始培養(yǎng)基組(P<0.05)。說(shuō)明培養(yǎng)基優(yōu)化后，Sys NC-02單位體積的發(fā)酵液活性有了較大提高。

2.5 亞硝化細(xì)菌10 L發(fā)酵罐小試生產(chǎn)條件優(yōu)化

圖8 優(yōu)化條件發(fā)酵數(shù)據(jù)曲線Fig.8 The data curves of optimized fermentation conditions.

圖9 進(jìn)行2次發(fā)酵液置換的發(fā)酵曲線Fig.9 The data curves for performed twice fermentation broth replacements.

3 討論

本研究將沿海污泥富集培養(yǎng)后，通過(guò)硅膠平板和水洗瓊脂平板分離得到1株亞硝化細(xì)菌并命名為Sys NC-02，通過(guò)搖瓶培養(yǎng)確定其最優(yōu)培養(yǎng)條件：最適溫度為30℃、最適pH為8.0、最適溶解氧濃度≥1.8 mg/L，與已有研究結(jié)果[17～21]基本一致。并通過(guò)培養(yǎng)基組分的單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定了最佳的培養(yǎng)基組合及濃度：0.5% NaHCO3、0.8% (NH4)2SO4、0.1% KH2PO4、0.01% FeSO4。優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)的Sys NC-02對(duì)污水中氨氮的去除率顯著高于原始培養(yǎng)基，說(shuō)明優(yōu)化培養(yǎng)基可較好的促進(jìn)Sys NC-02的生長(zhǎng)，同時(shí)提高了其單位體積的活性。

為了在微生物發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)控制發(fā)酵液中生成物的濃度，以減少其對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用，常用的可行途徑為2種。一種是以指數(shù)流加為代表的流加方法，通過(guò)控制發(fā)酵過(guò)程中底物的濃度以降低副產(chǎn)物的生成累積對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)的抑制[23]，這種方法比較適用于大腸桿菌、酵母菌等的高密度發(fā)酵，此類生物的共同特性是其獲取能量的反應(yīng)速度與反應(yīng)物的濃度有關(guān)，通常在一定濃度范圍內(nèi)，濃度越大細(xì)菌生長(zhǎng)速度越快，副產(chǎn)物累積也越快，對(duì)微生物生長(zhǎng)的抑制作用也越大。而亞硝化細(xì)菌的代謝屬于生物反應(yīng)中較為特殊的零級(jí)反應(yīng)，亞硝酸鹽的生成速度在一定條件下與氨氮濃度無(wú)關(guān)。因此，流加類方法不適用于亞硝化細(xì)菌的發(fā)酵。

另一種方法是在發(fā)酵過(guò)程中通過(guò)利用新鮮培養(yǎng)基置換一部分發(fā)酵液的方法，將發(fā)酵產(chǎn)物濃度控制在一定范圍內(nèi)，降低發(fā)酵產(chǎn)物的濃度對(duì)生物生長(zhǎng)的抑制作用，從而實(shí)現(xiàn)高密度發(fā)酵，如目前在細(xì)胞培養(yǎng)中較為流行的灌流法[24,25]采用的就是這一原理，此類方法可以保證細(xì)菌或細(xì)胞不隨置換液流失，又可以降低發(fā)酵液中代謝產(chǎn)物的累積，較好的促進(jìn)了微生物或細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)然此類方法只適用于在發(fā)酵液中沉降性較好的微生物和用微載體進(jìn)行培養(yǎng)的貼壁細(xì)胞。

需要注意的是，本研究雖然利用灌流培養(yǎng)的方式實(shí)現(xiàn)了亞硝化細(xì)菌的高密度發(fā)酵，但為了控制亞硝酸鹽濃度，整個(gè)發(fā)酵過(guò)程需要人工長(zhǎng)期值守且需要較為頻繁的檢測(cè)，增加了人力物力成本，所以此發(fā)酵方式還需進(jìn)一步優(yōu)化。今后主要研究方向是通過(guò)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的累積建立氨氮的加入量與亞硝酸鹽生成量的數(shù)據(jù)模型，通過(guò)數(shù)據(jù)模型計(jì)算出亞硝酸鹽的累積濃度，從而減少檢測(cè)頻率；并以數(shù)據(jù)模型為依據(jù)對(duì)發(fā)酵設(shè)備硬件和軟件進(jìn)行改造，爭(zhēng)取實(shí)現(xiàn)亞硝化細(xì)菌在無(wú)人值守下的自動(dòng)發(fā)酵，為亞硝化細(xì)菌工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。