• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    自制5’-核苷酸酶試劑在生化檢驗中的應(yīng)用

    2016-01-21 03:11:07景晟上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司上海200444
    上海醫(yī)藥 2015年1期
    關(guān)鍵詞:復(fù)星核苷酸長征

    景晟(上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司 上海 200444)

    自制5’-核苷酸酶試劑在生化檢驗中的應(yīng)用

    景晟*
    (上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司 上海 200444)

    摘 要目的:評價自主研發(fā)的5’-核苷酸酶試劑(速率法)在自動化檢測血清或血漿中5’-核苷酸酶活性的應(yīng)用。方法:采用奧林巴斯AU680全自動生化分析儀,通過重復(fù)性、線性試驗、測定血清或血漿中5’-核苷酸酶活性,進(jìn)行方法學(xué)評價并與美國Diazyme 5’-核苷酸酶試劑(速率法)比較。結(jié)果:兩個水平質(zhì)控中酶活性的變異系數(shù)(CV)分別為2.83% 和1.96%,在 5~200 U/L酶活范圍內(nèi),線性良好。兩種試劑測定血清5’-核苷酸酶活性的相關(guān)系數(shù)較好,相關(guān)系數(shù)r 為0.995。結(jié)論:自主研發(fā)的5’- 核苷酸酶試劑盒操作簡便、快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定,結(jié)果準(zhǔn)確,可滿足大批量臨床樣本的常規(guī)和自動化分析,是一種值得推廣的方法。

    關(guān)鍵詞5’-核苷酸酶 診斷試劑 臨床研究

    The application of the homemade 5’-nucleotidase reagent in biochemical analysis

    JING Sheng*
    (Shanghai Fosun Long March Medical Science Co. Ltd., Shanghai 200444,China)

    ABSTRACTObjective: To evaluate the application of the independent innovation reagent in the automatic determination of 5’-nucleotidase (5’-NT) activity in the clinical serum or plasma samples. Methods: 5’-NT activities were determined with Olympus AU680 automatic biochemical analyzer by repeatability and linearity tests, the evaluation of methodology was carried out and the results were compared with those determined by the reagent of Diazyme Laboratories. Results: The coefficients of variation (CV) of the enzyme activity at two levels of quality control were 2.83% and 1.96%. The determination of enzyme activity showed a good linearity over the range of 5~200 U/L. There was a good correlation between two reagents (r=0.995). Conclusion: The 5’-nucleotidase reagent made by our company can provide a simple, quick, accurate and stable method for the determination of 5′-NT activity in the clinical serum or plasma samples and meet the requirement of the automated analysis of mass clinical samples. This method may be worthy of promotion.

    KEY WORDS5’-nucleotidase; clinical research; diagnostic reagent

    1934年Reis第一次描述了心臟和骨骼肌中5′-核苷酸酶(EC3.1.3.5)的活性[1]。它的主要功能是將核苷酸5′-C上連接的磷酸催化水解生成核苷和正磷酸,其在細(xì)胞生長發(fā)育、運(yùn)動、纖維蛋白合成、神經(jīng)傳遞、淋巴細(xì)胞的黏附、再循環(huán)、免疫應(yīng)答等方面發(fā)揮重要作用及在缺血性心臟病、缺血性腎臟病、白血病、腫瘤等疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中的作用越來越受到人們的重視[2-4]。目前測定5′-核苷酸酶活性的方法有很多,包括鉬藍(lán)顯色法[5]、Kalckar 氏法[6]、改進(jìn)的Kalckar 氏法[7]、酶法[8]和速率法[5]。其中鉬藍(lán)顯色法和速率法是最常用的方法,但是鉬藍(lán)顯色法所需試劑種類多,操作繁瑣、費(fèi)時,不適宜自動化分析;速率法通常須采用昂貴的進(jìn)口試劑,而大部分國產(chǎn)5′-NT試劑只能用于血清樣本的檢測。本文采用復(fù)星長征試劑測定血清或血漿中5′-核苷酸酶的活性,并對其進(jìn)行方法學(xué)評價。

    1 材料與方法

    1.1 儀器

    日本 Olympus AU680 全自動生化分析儀。

    1.2 試劑、校準(zhǔn)品和質(zhì)控品

    復(fù)星長征自主研發(fā)5'-NT試劑(批號為D20130703,簡稱復(fù)星長征試劑);對照試劑(批號為 8746)、校準(zhǔn)品(批號為NTS001120)、配套質(zhì)控品1(批號為NTC101310)和配套質(zhì)控品2(批號為NTC201310)均購自美國Diazyme公司。

    1.3 標(biāo)本

    本研究收集的標(biāo)本為上海復(fù)星長征公司醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司員工的100人,靜脈采血,樣本新鮮無溶血、無黃疸。同一份樣本各采兩管血,一份血清樣本一份肝素血漿樣本。

    1.4 測定方法及條件

    按照以下參數(shù)來設(shè)置奧林巴斯AU680全自動生化分析儀:

    速率法:溫度37 ℃,主波長546 nm,副波長800 nm,吸光度范圍0~2 A,比色杯光徑1.0 cm,反應(yīng)方向為吸光度上升的反應(yīng),樣本用量6 μl,復(fù)星長征試劑和Diazyme試劑均為液體雙試劑,分別由試劑1(R1)和試劑2(R2)組成。R1用量225 μl,孵育時間5 min;R2用量75 μl,延遲時間120 s,測定時間120 s,校準(zhǔn)模式為兩點定標(biāo)。

    1.5 空白吸光度

    用試劑(盒)測試生理鹽水,記錄試劑(盒)參數(shù)規(guī)定讀數(shù)點546 nm下的吸光度值(A),重復(fù)兩次。

    1.6 重復(fù)性

    在重復(fù)條件下,測試5′-NT活性標(biāo)示值分別為28.3 U/L和141.2 U/L的控制血清,將這兩水平控制血清分別測試10次,計算測量值的平均值(x)、標(biāo)準(zhǔn)差(s)和變異系數(shù)(CV)。

    1.7 線性試驗

    用接近線性范圍下限的低活性樣品與接近線性范圍上限的高活性樣品混合配制成5、12.5、25、50、100、200 U/L的6個樣品(xi),分別用測試試劑(盒)對各樣品進(jìn)行測試,每個樣品測試3 次,分別求出每個活性濃度樣品檢測結(jié)果的均值(yi)。以6個濃度(xi)為自變量,以檢測結(jié)果均值(yi)為因變量作線性回歸。

    1.8 血清和血漿測定結(jié)果比較

    100人份的血漿和血清樣本同時檢測5’-NT活性,并比較測定結(jié)果。

    1.9 復(fù)星長征試劑與Diazyme試劑的對比試驗

    隨機(jī)選擇50份樣本,每份樣本作雙份測定,取均值,按NCCLS EP9[9]的評價方案統(tǒng)計結(jié)果。

    2 結(jié)果

    2.1 空白吸光度

    三次試劑空白的檢測結(jié)果分為0.016 7,0.017 2,0.015 9,試劑的空白變化率的檢測結(jié)果分別為0.001,0.000 8,0.000 9,結(jié)果表明試劑空白小于0.5,試劑的空白變化率小于0.005,檢測結(jié)果符合產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn),試劑性能可控。

    2.2 重復(fù)性

    低、高活性兩個水平質(zhì)控中酶活性的平均值分別為27.8 U/L和139.6 U/L,變異系數(shù)(CV)分別為2.83% 和1.96%,均小于5%。試劑的重復(fù)性檢測結(jié)果符合產(chǎn)品注冊標(biāo)準(zhǔn),試劑性能可控。

    2.3 線性試驗理論值(x)與測定值(Y)之間的線性回歸

    所得數(shù)據(jù)的線性回歸方程為Y=0.987 6 X-0.746 2,R=0.999 9,5′-NT酶活濃性在5~200 U/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

    2.4 血清與血漿標(biāo)本5′-NT測定結(jié)果比較

    復(fù)星長征公司試劑對血清和血漿中5′-NT活性的檢測結(jié)果的均值為3.85 U/L和3.81 U/L,兩者差異無顯著意義(t=0.23,P>0.05),血清和血漿測定結(jié)果之間具有良好的相關(guān)性(r=0.999,圖1)。

    圖1 復(fù)星長征試劑測定血清和血漿中5′-NT活性

    2.5 復(fù)星長征試劑(速率法)與Diazyme試劑的比對以及偏倚評估

    Diazyme公司試劑和復(fù)星長征試劑對100例血清5′-NT活性檢測的均值分別為3.97 U/L和3.85 U/L,兩者無顯著差異(t=0.23,P>0.05),所測5′-NT活性具有良好的相關(guān)性(r=0.995,圖2)。兩方法均值相對偏差的偏置曲線圖可以看出兩種試劑檢測同一樣本的相對偏差結(jié)果良好,部分樣本的相對偏差絕對值雖然超過15%,但都集中在4 U/L以下,這可能是由于樣本濃度極低、試劑以及機(jī)器的系統(tǒng)偏差所致;另一方面,參考值為0~11 U/L,低于該值的樣本不影響結(jié)果的判斷。顯示兩種試劑測定單個樣本偏差較小,分布較合理。

    圖2 Diazyme試劑和復(fù)星長征試劑測定血清樣本中5′-NT活性

    3 討論

    5′-NT廣泛存在于肝臟和各種組織中。血清中5′-NT活性增高主要見于肝膽系統(tǒng)疾病,如阻塞性黃疸、原發(fā)及繼發(fā)性肝癌等,通常酶活性變化與堿性磷酸酶(ALP)活性變化相平行。但在骨骼系統(tǒng)疾病中,如腫瘤骨轉(zhuǎn)移、畸形性骨炎等疾病中ALP活性增高,而5′-NT活性正常。所以,對ALP活性增高的患者,測定5′-NT活性有助于臨床判斷ALP活性增高原因是肝膽系統(tǒng)疾病,還是骨骼系統(tǒng)疾病[5]。

    周永年等[10]研究發(fā)現(xiàn)在肝膽發(fā)生病變時其釋放的5′-NT經(jīng)膽汁酸作用后進(jìn)入血液循環(huán),使血清中的5′-NT活性升高。故血清中5′-NT活性的變化較少受到肝外其他疾病的影響,有助于臨床鑒別診斷。劉新等[11]研究表明,當(dāng)肝膽疾病發(fā)生時,5′-NT活性升高的同時丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷氨酸轉(zhuǎn)肽酶(GGT)、ALP活性亦見增高,其增高程度與病情的嚴(yán)重度密切相關(guān)。

    復(fù)星長征試劑可檢測血清和血漿樣本的5′-NT活性,并且血清和血漿測定結(jié)果之間具有良好線性相關(guān)性;與Diazyme公司試劑所測5′-NT活性也具有良好的線性相關(guān)性。表明采用我公司自制試劑進(jìn)行5′-NT活性測定的方法操作簡單、線性范圍寬、重復(fù)性好、結(jié)果準(zhǔn)確,完全可以替代美國Diazyme公司的5′-NT試劑應(yīng)用于血漿和血清中5′-NT活性測定。

    參考文獻(xiàn)

    [1] Reis MJ. Nucleotidase and its relation to the deamination of nucleotides in the heart and the muscles[J]. Bull Soc Chim Biol, 1934, 16: 385-399.

    [2] Airas L, Niemel? J, Salmi M, et al. Differential regulation and function of CD73, a glycosyl-phosphatidylinositol-linked 70-kD adhesion molecule, on lymphocytes and endothelial cells[J]. J Cell Biol, 1997, 136(2): 421-431.

    [3] Resta R, Yamashita Y, Thompson LF. Ecto-enzyme and signaling functions of lymphocyte CD73[J]. Immunol Rev, 1998, 161: 95-109.

    [4] Moriwaki Y, Yamamoto T, Higashino K. Enzymes involved in purine metabolism-a review of histochemical localization and functional implications[J]. Histol Histopathol, 1999, 14(4): 1321-1340.

    [5] 王毓三, 王繼貴. 第四篇臨床化學(xué)檢驗[M]//葉應(yīng)嫵, 王毓三, 申子瑜. 全國臨床檢驗操作規(guī)程. 3版. 無錫: 東南大學(xué)出版社, 2006: 436-438.

    [6] Kim NK, Yasmineh WG, Freier EF, et al. Value of alkaline phosphatase, 5’-nucleotidase, gamma-glutamyltransferase, and glutamate dehydrogenase activity measurements (single and combined) in serum in diagnosis of metastasis to the liver[J]. Clin Chem, 1977, 23(11): 2034-2038.

    [7] Amici A, Natalini P, Ruggieri S, et al. A spectrophotometric method for the assay of pyrimidine 5’-nucleotidase in human erythrocytes[J]. Br J Haematol, 1989, 73(3): 392-395.

    [8] 張晉會. 血清5'-核苷酸酶測定方法的建立和臨床應(yīng)用[J].醫(yī)學(xué)信息, 2011, 24(5): 276.

    [9] Krouwer JS, Tholen DW, Garber CC, et al. Method Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples Approved Guideline-Second Edition[EB/ OL]. [2014-12-20]. http://yeec.com/uploadimages1/ forum/2009-7/20097251016576037.pdf.

    [10] 周永年, 李晉. 5'-核苷酸酶在肝膽系統(tǒng)疾病中的應(yīng)用[J].山西醫(yī)藥雜志: 下半月, 2010, 39(11): 1109-1110.

    [11] 劉新, 傳良敏, 鄧君, 等. 5'-核苷酸酶在肝臟疾病診斷中的應(yīng)用[J]. 淮海醫(yī)藥, 2006, 24(2): 98-99.

    收稿日期:(2014-07-30)

    作者簡介:*景晟(1980-),男,工程師,生化研發(fā)經(jīng)理,從事于體外診斷試劑生化試劑的研發(fā)。E-mail: jingsh@ fosunpharma.com

    中圖分類號:R981; R446.112

    文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A

    文章編號:1006-1533(2015)01-0030-03

    猜你喜歡
    復(fù)星核苷酸長征
    我們?yōu)閰⒓印捌叽蟆弊吡艘淮巍靶¢L征”
    單核苷酸多態(tài)性與中醫(yī)證候相關(guān)性研究進(jìn)展
    徐長風(fēng):核苷酸類似物的副作用
    肝博士(2022年3期)2022-06-30 02:48:28
    Acknowledgment to reviewers—November 2018 to September 2019
    辭離復(fù)星
    商周刊(2017年8期)2017-08-22 12:10:06
    復(fù)盤復(fù)星路
    商周刊(2017年8期)2017-08-22 12:10:05
    長征五號首飛成功
    太空探索(2016年12期)2016-07-18 11:13:43
    “翱翔之星”搭長征七號順利入軌
    太空探索(2016年7期)2016-07-10 12:10:15
    長征六號為何能快速發(fā)射?
    太空探索(2015年11期)2015-07-18 10:59:33
    廣東人群8q24rs1530300單核苷酸多態(tài)性與非綜合征性唇腭裂的相關(guān)性研究
    非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩免费av在线播放| 久久狼人影院| 国产伦人伦偷精品视频| 久久久国产成人精品二区| 麻豆一二三区av精品| 亚洲欧美激情在线| 久久中文看片网| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 久久精品国产亚洲av高清一级| 极品人妻少妇av视频| 免费在线观看日本一区| 999精品在线视频| 国产不卡一卡二| 日本免费a在线| 黄色片一级片一级黄色片| 久久午夜综合久久蜜桃| 一二三四在线观看免费中文在| 搡老岳熟女国产| 99国产综合亚洲精品| 一进一出抽搐动态| 久久国产亚洲av麻豆专区| 妹子高潮喷水视频| 日韩三级视频一区二区三区| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲午夜理论影院| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲av电影在线进入| 精品熟女少妇八av免费久了| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲 国产 在线| 在线天堂中文资源库| 后天国语完整版免费观看| 日本三级黄在线观看| 欧美性长视频在线观看| 欧美日本中文国产一区发布| 亚洲av片天天在线观看| 国产精品野战在线观看| 成人永久免费在线观看视频| 黑人操中国人逼视频| 超碰成人久久| 精品福利观看| 国产一区二区三区视频了| 免费在线观看影片大全网站| 午夜视频精品福利| 日本五十路高清| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产av在哪里看| 久久婷婷人人爽人人干人人爱 | 搡老熟女国产l中国老女人| 国产精品影院久久| 成在线人永久免费视频| 性少妇av在线| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 亚洲第一青青草原| 日韩有码中文字幕| 国产成+人综合+亚洲专区| 国产男靠女视频免费网站| 成人免费观看视频高清| 很黄的视频免费| 无人区码免费观看不卡| 国产精品二区激情视频| 久久香蕉国产精品| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 免费看十八禁软件| 久久这里只有精品19| 亚洲第一电影网av| 精品国产乱子伦一区二区三区| 一区二区三区激情视频| av有码第一页| 热99re8久久精品国产| 午夜日韩欧美国产| 色在线成人网| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲一区高清亚洲精品| 黄色成人免费大全| 午夜福利一区二区在线看| 最近最新免费中文字幕在线| 在线播放国产精品三级| 成人特级黄色片久久久久久久| 亚洲成人国产一区在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲精品av麻豆狂野| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美日韩乱码在线| 精品欧美一区二区三区在线| 久久精品91蜜桃| 99国产精品免费福利视频| 中文字幕人妻熟女乱码| 757午夜福利合集在线观看| 国产主播在线观看一区二区| 99香蕉大伊视频| 丝袜美足系列| 国产亚洲精品第一综合不卡| 午夜福利在线观看吧| 亚洲精品国产色婷婷电影| 日韩精品中文字幕看吧| av免费在线观看网站| 精品久久蜜臀av无| 亚洲精品国产色婷婷电影| 91精品国产国语对白视频| 欧美日韩精品网址| 亚洲成人久久性| 亚洲片人在线观看| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 精品国产一区二区久久| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美绝顶高潮抽搐喷水| 日韩免费av在线播放| 亚洲激情在线av| 免费搜索国产男女视频| 在线观看免费午夜福利视频| 久久人妻av系列| 国产成人免费无遮挡视频| 亚洲色图av天堂| 1024香蕉在线观看| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 超碰成人久久| 午夜福利,免费看| 久9热在线精品视频| 真人做人爱边吃奶动态| 亚洲自拍偷在线| av视频在线观看入口| 日本三级黄在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 国产亚洲欧美在线一区二区| 色av中文字幕| 国产成人欧美| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 久久伊人香网站| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美激情极品国产一区二区三区| 亚洲欧美精品综合久久99| 精品少妇一区二区三区视频日本电影| 国产精品日韩av在线免费观看 | 日本免费一区二区三区高清不卡 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产精品九九99| 成人国语在线视频| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 色综合站精品国产| 成熟少妇高潮喷水视频| 久久婷婷成人综合色麻豆| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 亚洲男人的天堂狠狠| 精品国产超薄肉色丝袜足j| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲成人免费电影在线观看| 99在线人妻在线中文字幕| 女人精品久久久久毛片| 亚洲电影在线观看av| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 欧美丝袜亚洲另类 | 精品熟女少妇八av免费久了| 色综合婷婷激情| www日本在线高清视频| 国产成人av教育| www.精华液| 精品高清国产在线一区| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 91精品三级在线观看| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 女性被躁到高潮视频| 午夜免费观看网址| 桃色一区二区三区在线观看| 中文亚洲av片在线观看爽| 色综合站精品国产| av天堂久久9| 亚洲 国产 在线| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国内精品久久久久精免费| 男女午夜视频在线观看| 激情视频va一区二区三区| 午夜影院日韩av| 电影成人av| 国产精品电影一区二区三区| 国产又色又爽无遮挡免费看| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产精品1区2区在线观看.| 日韩三级视频一区二区三区| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久人人97超碰香蕉20202| 51午夜福利影视在线观看| 最新美女视频免费是黄的| 日本免费一区二区三区高清不卡 | 91九色精品人成在线观看| 男女做爰动态图高潮gif福利片 | 日本免费一区二区三区高清不卡 | 丝袜在线中文字幕| 18美女黄网站色大片免费观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久人人精品亚洲av| 麻豆av在线久日| 色综合婷婷激情| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 手机成人av网站| 黄色视频不卡| 九色国产91popny在线| 欧美+亚洲+日韩+国产| 电影成人av| 亚洲中文日韩欧美视频| 国产精品二区激情视频| svipshipincom国产片| 午夜精品国产一区二区电影| 在线观看午夜福利视频| 亚洲最大成人中文| 久久久精品欧美日韩精品| 久久久久精品国产欧美久久久| 波多野结衣高清无吗| 18美女黄网站色大片免费观看| 午夜日韩欧美国产| 长腿黑丝高跟| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看| 午夜视频精品福利| 久久亚洲真实| 亚洲一区二区三区不卡视频| 变态另类丝袜制服| 伦理电影免费视频| 日韩精品免费视频一区二区三区| x7x7x7水蜜桃| 精品国产亚洲在线| 日本 欧美在线| 亚洲午夜理论影院| 国产黄a三级三级三级人| 校园春色视频在线观看| 亚洲自拍偷在线| 香蕉国产在线看| 中文字幕精品免费在线观看视频| 色综合站精品国产| 中文字幕久久专区| 在线观看免费视频网站a站| 欧美日韩一级在线毛片| 黄网站色视频无遮挡免费观看| 久久中文字幕人妻熟女| 国产精品电影一区二区三区| 亚洲男人天堂网一区| 亚洲成国产人片在线观看| 亚洲一区二区三区色噜噜| 男女之事视频高清在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 一级毛片精品| 久久中文看片网| 性欧美人与动物交配| 欧美亚洲日本最大视频资源| 午夜免费激情av| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 久久久久久大精品| 日韩大尺度精品在线看网址 | 免费在线观看日本一区| 一进一出好大好爽视频| 美女扒开内裤让男人捅视频| 国产精品久久久av美女十八| 热99re8久久精品国产| 亚洲成人免费电影在线观看| 99国产精品一区二区蜜桃av| 99久久99久久久精品蜜桃| 18禁国产床啪视频网站| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 国产亚洲精品第一综合不卡| 精品无人区乱码1区二区| 久久精品91蜜桃| 日韩av在线大香蕉| 无限看片的www在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久久久精品国产欧美久久久| 精品久久久久久,| 欧美日韩一级在线毛片| 国产成人欧美| tocl精华| 日韩中文字幕欧美一区二区| 18美女黄网站色大片免费观看| 熟妇人妻久久中文字幕3abv| 俄罗斯特黄特色一大片| 男男h啪啪无遮挡| 欧美激情 高清一区二区三区| 人妻久久中文字幕网| 99国产极品粉嫩在线观看| tocl精华| 不卡一级毛片| 国产亚洲av嫩草精品影院| 老司机深夜福利视频在线观看| 国产午夜福利久久久久久| 欧美乱色亚洲激情| 老熟妇仑乱视频hdxx| 久久久久久久午夜电影| 99久久综合精品五月天人人| 曰老女人黄片| 欧美日本中文国产一区发布| 可以在线观看的亚洲视频| 日日夜夜操网爽| 波多野结衣高清无吗| 国产成人精品久久二区二区91| 国产av一区在线观看免费| 午夜两性在线视频| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 老司机午夜福利在线观看视频| 精品福利观看| АⅤ资源中文在线天堂| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 在线国产一区二区在线| 国产一区在线观看成人免费| 电影成人av| 在线播放国产精品三级| 少妇粗大呻吟视频| 一夜夜www| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 欧美另类亚洲清纯唯美| 在线观看66精品国产| 国产精品九九99| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 国产精品1区2区在线观看.| 国产午夜精品久久久久久| 国产亚洲欧美98| 一二三四在线观看免费中文在| 亚洲精品美女久久av网站| 少妇的丰满在线观看| 国产精品免费视频内射| 黄色视频不卡| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 一级a爱视频在线免费观看| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 一边摸一边做爽爽视频免费| 在线天堂中文资源库| 国产激情久久老熟女| 色综合欧美亚洲国产小说| 午夜福利高清视频| 在线观看免费午夜福利视频| 自线自在国产av| 好男人在线观看高清免费视频 | 人人妻人人澡欧美一区二区 | 久久亚洲精品不卡| 婷婷丁香在线五月| 亚洲国产看品久久| 亚洲国产中文字幕在线视频| 久久狼人影院| 欧美国产日韩亚洲一区| 国产精品久久久久久精品电影 | 一级a爱视频在线免费观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 少妇熟女aⅴ在线视频| 黄色视频,在线免费观看| 男男h啪啪无遮挡| 女性生殖器流出的白浆| 精品高清国产在线一区| 黄色视频,在线免费观看| 99久久99久久久精品蜜桃| 成人亚洲精品一区在线观看| 欧美日本视频| 黄色视频,在线免费观看| 亚洲午夜理论影院| 亚洲av电影在线进入| 丁香六月欧美| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 欧美乱色亚洲激情| 高清黄色对白视频在线免费看| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 欧美激情高清一区二区三区| 天天一区二区日本电影三级 | 国产99白浆流出| 国产色视频综合| 一边摸一边做爽爽视频免费| 欧美成狂野欧美在线观看| 亚洲欧美激情在线| 精品欧美国产一区二区三| 999精品在线视频| 99在线视频只有这里精品首页| 亚洲一区二区三区色噜噜| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 亚洲国产高清在线一区二区三 | 老司机午夜十八禁免费视频| 日韩成人在线观看一区二区三区| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产片内射在线| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 婷婷丁香在线五月| 久热这里只有精品99| www.熟女人妻精品国产| 午夜福利,免费看| 黄色a级毛片大全视频| 欧美黄色片欧美黄色片| 99精品在免费线老司机午夜| 天堂√8在线中文| 一级毛片女人18水好多| 露出奶头的视频| 咕卡用的链子| 国产高清有码在线观看视频 | 在线播放国产精品三级| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 中文字幕av电影在线播放| 久久久国产精品麻豆| 亚洲午夜理论影院| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产亚洲av嫩草精品影院| 久久久久久国产a免费观看| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 丝袜美腿诱惑在线| 欧美不卡视频在线免费观看 | 日日干狠狠操夜夜爽| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 日韩av在线大香蕉| 日韩中文字幕欧美一区二区| 操出白浆在线播放| 久久人人精品亚洲av| 欧美一级毛片孕妇| 色综合亚洲欧美另类图片| 精品第一国产精品| 亚洲中文av在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 日韩欧美免费精品| 亚洲色图av天堂| 丝袜人妻中文字幕| 亚洲成人久久性| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 午夜影院日韩av| 成人三级做爰电影| 免费av毛片视频| 黄色a级毛片大全视频| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 真人做人爱边吃奶动态| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲色图av天堂| 一本久久中文字幕| 大型黄色视频在线免费观看| www国产在线视频色| 日本 av在线| 两个人看的免费小视频| 久久精品人人爽人人爽视色| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 亚洲伊人色综图| 国产成人欧美在线观看| 丰满的人妻完整版| 黑人欧美特级aaaaaa片| 淫秽高清视频在线观看| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 国产又色又爽无遮挡免费看| 最新美女视频免费是黄的| 在线天堂中文资源库| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲专区国产一区二区| 在线观看日韩欧美| 波多野结衣av一区二区av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 丰满的人妻完整版| 国产国语露脸激情在线看| 成人国产一区最新在线观看| 国产单亲对白刺激| 国产91精品成人一区二区三区| 啦啦啦观看免费观看视频高清 | 久热爱精品视频在线9| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 久久人人97超碰香蕉20202| 狂野欧美激情性xxxx| 在线永久观看黄色视频| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 成人特级黄色片久久久久久久| 欧美日韩福利视频一区二区| 亚洲国产精品sss在线观看| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 国产成年人精品一区二区| 久久久久久久久中文| 国产伦人伦偷精品视频| 中文亚洲av片在线观看爽| 一进一出抽搐动态| 国产又色又爽无遮挡免费看| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 亚洲人成77777在线视频| 亚洲一区中文字幕在线| 真人一进一出gif抽搐免费| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲精品国产一区二区精华液| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 午夜福利成人在线免费观看| 精品人妻1区二区| 久久香蕉激情| 激情视频va一区二区三区| 久久精品91无色码中文字幕| 亚洲一区中文字幕在线| 国产亚洲精品久久久久5区| 91在线观看av| 淫秽高清视频在线观看| 国产精品野战在线观看| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 色尼玛亚洲综合影院| 亚洲国产看品久久| 成年女人毛片免费观看观看9| 国产精品影院久久| 三级毛片av免费| 亚洲全国av大片| 在线观看免费午夜福利视频| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 香蕉国产在线看| 在线观看www视频免费| 高清毛片免费观看视频网站| 97人妻天天添夜夜摸| 久久亚洲真实| 成人特级黄色片久久久久久久| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 国产成人系列免费观看| 国产片内射在线| videosex国产| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 丁香欧美五月| 精品一区二区三区av网在线观看| 亚洲av电影在线进入| 一二三四在线观看免费中文在| 操出白浆在线播放| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 99精品在免费线老司机午夜| 国产成人精品久久二区二区91| 999精品在线视频| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 免费在线观看完整版高清| 91九色精品人成在线观看| 日韩高清综合在线| 国产av在哪里看| 日韩欧美国产在线观看| 久久久久久大精品| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产麻豆69| 久热这里只有精品99| 男男h啪啪无遮挡| av超薄肉色丝袜交足视频| 精品电影一区二区在线| 亚洲精品国产一区二区精华液| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 亚洲午夜精品一区,二区,三区| 99在线视频只有这里精品首页| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 怎么达到女性高潮| 99国产精品一区二区蜜桃av| 999久久久国产精品视频| 午夜久久久在线观看| 视频区欧美日本亚洲| 一二三四在线观看免费中文在| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 色综合亚洲欧美另类图片| 9191精品国产免费久久| 男人的好看免费观看在线视频 | 一进一出抽搐gif免费好疼| 成年女人毛片免费观看观看9| 99国产精品免费福利视频| 女性被躁到高潮视频| 亚洲人成电影免费在线| 日韩欧美一区视频在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 嫁个100分男人电影在线观看| 色在线成人网| 国内精品久久久久精免费| 满18在线观看网站| 亚洲全国av大片| 色综合欧美亚洲国产小说| 国产欧美日韩一区二区三| svipshipincom国产片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 亚洲av第一区精品v没综合| 老司机在亚洲福利影院| 国产av又大| 国产三级在线视频| 精品久久蜜臀av无| 久久亚洲精品不卡| 国内久久婷婷六月综合欲色啪| 精品一品国产午夜福利视频| www.熟女人妻精品国产| 黄片小视频在线播放| 亚洲色图综合在线观看| 日韩视频一区二区在线观看| 亚洲最大成人中文| 日韩高清综合在线| 12—13女人毛片做爰片一| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 97人妻精品一区二区三区麻豆 | av在线天堂中文字幕| 女性被躁到高潮视频| 在线观看午夜福利视频| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲欧美日韩无卡精品| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 国产av一区二区精品久久| 国产精品一区二区免费欧美| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 中文字幕精品免费在线观看视频| 夜夜爽天天搞| 亚洲熟女毛片儿| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 亚洲成人久久性| 国产97色在线日韩免费| 国产主播在线观看一区二区| 淫妇啪啪啪对白视频| 亚洲无线在线观看| 757午夜福利合集在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 久久久国产欧美日韩av| 我的亚洲天堂| 99国产精品一区二区蜜桃av| 久久久久亚洲av毛片大全| 两个人看的免费小视频| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产精品1区2区在线观看.| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 黑人操中国人逼视频| 久久久久九九精品影院| 久久久久亚洲av毛片大全| 国产成人啪精品午夜网站| videosex国产|