寄生性雜草列當?shù)姆N類調(diào)查及鑒定

王亞嬌， 紀莉景， 栗秋生， 王連生， 潘進紅， 孔令曉

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所/河北省有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部華北北部作物

有害生物綜合治理重點實驗室，河北保定 071000； 2.河北省張家口蔚縣農(nóng)牧局，河北張家口 075000)

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寄生性雜草列當?shù)姆N類調(diào)查及鑒定

王亞嬌1， 紀莉景1， 栗秋生1， 王連生1， 潘進紅2， 孔令曉1

(1.河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護研究所/河北省有害生物綜合防治工程技術(shù)研究中心/農(nóng)業(yè)部華北北部作物

有害生物綜合治理重點實驗室，河北保定 071000； 2.河北省張家口蔚縣農(nóng)牧局，河北張家口 075000)

摘要：列當是一類難以防治的惡性根寄生雜草，目前在番茄、向日葵、煙草和瓜類上危害日益嚴重。列當?shù)姆N類多且難以區(qū)分，明確列當?shù)姆N類對制定有效防治措施具有重要意義。從新疆維吾爾自治區(qū)、河北省、內(nèi)蒙古自治區(qū)和吉林省4個地區(qū)采集了19份列當樣品，通過形態(tài)觀察和DNA條形碼技術(shù)進行種類鑒定并對其親緣關(guān)系進行討論。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，寄生于新疆番茄上的列當樣品為分枝列當，寄生于河北煙草、河北向日葵和吉林向日葵上的列當樣品為彎管列當；在系統(tǒng)發(fā)育樹中分枝列當與彎管列當有明顯的系統(tǒng)進化差異性，彎管列當被分為2個大類群，地理區(qū)劃明顯而與寄主植物無關(guān)，采集自河北省的7個樣品為1個類群，采自吉林省、新疆維吾爾自治區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)的8個樣品為第2個類群，其中第2類群中采自吉林省的4個樣品親緣關(guān)系最近。

關(guān)鍵詞：寄生性雜草；列當；形態(tài)鑒定；DNA條形碼；系統(tǒng)進化

列當屬(Orobanche)隸屬列當科(Orobanchaceae)，是一類惡性寄生雜草[1-2]，由于沒有葉綠素，其生長所需的水分和養(yǎng)分需要用吸盤從寄主根部吸收[3]。寄主被寄生后，植株生長緩慢，矮化、黃化萎蔫或枯死，造成農(nóng)作物產(chǎn)量降低和品質(zhì)下降，嚴重時可導(dǎo)致農(nóng)作物絕收[4]。列當屬在全世界約有100多種，主要分布于地中海沿岸、亞洲西部地區(qū)、東歐、中美洲南部及大洋洲、非洲東部和北部等地區(qū)[5-6]。列當于1963年在我國新疆首次被報道出現(xiàn)[7]，到目前為止，我國報道的列當約有23種，主要分布在新疆、甘肅、河北、山東、山西、遼寧、內(nèi)蒙古等十幾個省(區(qū))[8]。列當寄主范圍廣泛，可寄生在菊科、豆科、茄科、葫蘆科、十字花科、大麻科、亞麻科、傘形科、禾本科等植物根上[9]。

列當?shù)姆N類繁多，一種寄主可以被寄生不同種類的列當，同種列當又可以寄生不同種類的植物，并且當同種列當寄生于不同的寄主上時，它們的形態(tài)和生活史具有差異性，極易被人們認定為2種不同的列當，因此明確寄主上寄生列當?shù)姆N類能夠使防治工作更有針對性和高效性。傳統(tǒng)的列當鑒定方法為形態(tài)學(xué)鑒定，這種方法的準確性和效率極大地依賴于分類學(xué)家的經(jīng)驗，因此不可避免地會遇到人為的錯誤以及其他無法克服的困難。DNA條形碼技術(shù)是通過對1段標準化基因序列進行分析來實現(xiàn)對生物物種準確快速鑒定的技術(shù)[10]。自2003年提出以來，DNA條形碼技術(shù)被廣泛地應(yīng)用于生物分類學(xué)研究。高等植物的核rRNA中的18S、5.8S、26S為1個轉(zhuǎn)錄單位，位于18S與5.8S、5.8S與26S基因之間的間隔區(qū)被稱為內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internally transcribed spacer，ITS)[11]，該區(qū)域具有較高的保守性，被廣泛地用于植物和真菌種類鑒定。劉珉璐等基于ITS基因的DNA條形碼技術(shù)進行了馬先蒿屬植物種類的快速鑒定[12]。ITS基因被應(yīng)用于列當科的分類鑒定和遺傳進化分析中，2003年Schneeweiss等通過ITS構(gòu)建了列當屬的系統(tǒng)進化樹[13]。國內(nèi)尚無有關(guān)列當種類分子鑒定的報道，本研究從新疆維吾爾自治區(qū)、河北省、內(nèi)蒙古自治區(qū)和吉林省4個地區(qū)采集了19份列當樣品，通過形態(tài)學(xué)鑒定和基于ITS基因的DNA條形碼技術(shù)對列當樣品進行了種類鑒定和遺傳進化分析，旨在為今后列當?shù)姆植嘉：η闆r調(diào)查及開展防治工作提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1列當采集來源

2005—2014年在河北省、新疆維吾爾自治區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)和吉林省4個地區(qū)采集19份列當植株樣品，樣品采集信息見表1。

表1　供試列當植株信息

1.2試驗試劑

主要試驗試劑：DNA提取試劑盒Nuclean platGen DNA Kit(北京康為世紀生物科技有限公司)，PCR所用試劑：2×TaqPCR Master Mix、DL 2000 DNA(北京天根生化科技公司)，TS特異性引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

1.3試驗方法

1.3.1列當?shù)男螒B(tài)觀察從不同的寄主植物上采集典型的列當植株，解剖觀察列當植株的形態(tài)特征，在顯微鏡下觀察列當種子的特征，并拍照進行描述，根據(jù)《中國植物志》鑒定到種。

1.3.2ITS基因擴增與測序根據(jù)DNA提取試劑盒Nuclear PlantGen DNA Kit說明書分別提取列當樣品種子的基因組DNA。利用ITS特異性引物(F：5′-AAAGCAGACCGTGAACATGT-3′； R：5′-CGCCTATTACCGGAGGGCAC-3′)擴增ITS目的基因。PCR的反應(yīng)體系為50 μL，其中模板DNA 2 μL，上下游引物各2 μL，PCR Master Mix 25 μL，無菌水 19 μL。擴增反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR的產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送生工生物工程(上海)股份有限公司測序部測序。

1.3.3序列比對和分析利用NCBI的BLAST程序進行序列同源性分析；通過MEGA 5.0軟件構(gòu)建UPGMA樹(unweighted pair-group method with arithmetic means)分析進化關(guān)系。

2結(jié)果與分析

2.1形態(tài)描述

采集自新疆庫爾勒的寄生于番茄上的1—4號列當形態(tài)(圖1)為：一年生寄生草本，高15～50 cm，全株被腺毛，褐色或淺黃色；不含葉綠素，無真根，有短須狀吸盤；莖自基部或中部分枝具條紋；葉片為鱗片或瓦狀披針形，小而無柄，螺旋狀排列在莖稈上；穗狀花序，長8～15 cm，花的基部生有1張苞片，卵狀披針形；小苞片2枚，線形，與苞片近等長；下部花有 1～2 μm 長的短梗，向上梗逐漸變短直至無梗；花萼短鐘狀，4裂達近中部，披針形；花冠為藍紫色，近直立，長2.0～3.5 cm，向上逐漸膨大，筒部漏斗狀，在花絲著生處縊縮；花冠合瓣，呈二唇形，上唇為2裂，下唇為3裂，下唇長于上唇，所有裂片均被長柔毛；4枚雄蕊，2長2短，花絲基部疏被短柔毛，向上逐漸變?yōu)闊o毛，花藥為卵形，沿縫線密疏被白色長柔毛；1枚雌蕊，子房為橢圓形，上位，1室，側(cè)膜胎座4個，胚珠倒生，柱頭膨大且具2淺裂，裂片半圓形；種子為卵圓形，長0.4～0.6 μm，直徑約 0.25 μm，種皮具網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)眼底部具網(wǎng)狀紋飾。 通過觀察發(fā)現(xiàn)與《中國植物志》報道的分枝列當形態(tài)特征值一致，初步鑒定為分枝列當。

采集自河北省、新疆維吾爾自治區(qū)、內(nèi)蒙古自治區(qū)和吉林省的5—19號列當形態(tài)(圖2)相同：均為一年生寄生草本，高15～35 cm，全株密被白色腺毛；莖為黃褐色，無分枝；葉片為卵形或卵狀披針形，螺旋排列在莖稈上；穗狀花序，長5～20 cm；花的基部有1張苞片，苞片為卵形或卵狀披針形；花萼為鐘狀，2深裂至基部，或前面分裂至基部后面分裂僅至中下部，裂片頂有2淺裂，小裂片線形，后面2枚裂片較長，前面2枚較短；花冠長1.0～2.2 cm，向上縊縮，口部稍膨大，在縊縮處稍扭轉(zhuǎn)向下彎曲；花冠呈二唇形，上唇2淺裂，下唇稍短于上唇為3裂，裂片近圓形，邊緣為不規(guī)則淺波狀或小圓齒；4枚雄蕊，2長2短，花絲基部稍增粗且無毛，花藥卵形，常無毛；1枚雌蕊，子房卵狀長圓形，花柱稍粗壯，無毛，柱頭2淺裂；蒴果為長圓形或橢圓形，干后呈深褐色；種子為長橢圓形，長0.4～0.5 μm，直徑 0.18 μm，表面具網(wǎng)狀紋飾，網(wǎng)眼底部具蜂巢狀凹點。通過觀察發(fā)現(xiàn)與《中國植物志》報道的彎管列當?shù)男螒B(tài)特征一致，初步鑒定為彎管列當。

2.2分子鑒定結(jié)果

提取19個列當樣品種子的DNA，用ITS特異性引物進行PCR擴增，獲得約為400 bp大小的條帶(圖3)，經(jīng)測序比對后發(fā)現(xiàn)1—4號列當種子的DNA與GenBank中KC811199.1分枝列當?shù)南嗨贫葹?7%～100%，5—19號列當種子的DNA與GenBank中AY209230.1彎管列當?shù)南嗨贫葹?7%～100%。分子鑒定的結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相同，認為寄生于番茄的1—4號列當為分枝列當，寄生于向日葵和煙草的5—19號列當為彎管列當。

2.3系統(tǒng)進化分析

從NCBI中下載彎管列當ITS序列KC811199.1和分枝列當?shù)腎TS序列AY209230.1，將其與本試驗中測序的19個列當樣品的ITS基因序列通過MAGE5建立UPGMA樹(圖4)并計算遺傳距離，結(jié)果發(fā)現(xiàn)新疆庫爾勒番茄上寄生的列當XKF-1、XKF-2、XKF-3和XKF-4與NCBI中下載的分枝列當?shù)腎TS序列AY209230.1聚為1個類群，而剩余的15個列當樣品與NCBI中下載的彎管列當ITS序列KC811199.1聚為1個類群，說明該結(jié)果與形態(tài)和分子鑒定的結(jié)果相同，寄生于番茄的列當XKF-1、XKF-2、XKF-3和XKF-4為分枝列當，剩余的15個列當樣品為彎管列當。

分枝列當與彎管列當有明顯的系統(tǒng)進化差異性。彎管列當?shù)姆N內(nèi)差異性較小，彎管列當被分為2個大類群，遺傳距離在0.002～0.043之間，采集自河北的7個樣品為1個類群，采自吉林、新疆和內(nèi)蒙古的8個樣品與NCBI中下載的采集自新疆的彎管列當KC811199.1為第2個類群，其中第2群中采自吉林的4個樣品親緣關(guān)系最近。與彎管列當相比，分枝列當?shù)姆N間差異較大，為0.033～0.083。

3結(jié)論與討論

本研究通過形態(tài)學(xué)和DNA條形碼技術(shù)鑒定了國內(nèi)4個省19個列當樣品的種類。新疆庫爾勒番茄上寄生的列當均為分枝列當，寄生煙草和向日葵的均為彎管列當，與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相同，證明了ITS基因可以用于列當?shù)姆N類鑒定，從而實現(xiàn)了列當物種快速準確的鑒定。

從構(gòu)建的UPGMA樹可以看出，分枝列當和彎管列當之間具有明顯的種間差異性。與分枝列當相比，彎管列當?shù)姆N內(nèi)差異性較小。15個彎管列當樣品中采集自河北的7個樣品為1個類群，采自吉林、新疆和內(nèi)蒙古的8個樣品與NCBI中下載的采集自新疆的彎管列當KC811199.1為第2個類群，其中第2類群中采自吉林的4個樣品親緣關(guān)系最近。說明彎管列當?shù)姆N內(nèi)遺傳差異性與區(qū)域相關(guān)，而采集自河北的7株樣品中，寄主為煙草的HXY和HGY與寄主為向日葵的HXX、HYX、HSX、HHX和HCX沒有明顯的遺傳規(guī)律，說明彎管列當?shù)姆N內(nèi)遺傳差異性與區(qū)域相關(guān)與寄主種類無關(guān)。

列當為惡性寄生雜草，難以防治，許多國家將其列為檢疫對象[14-16]，我國將其列為進境植物檢疫對象和內(nèi)檢對象，并已列入我國農(nóng)業(yè)部頒布的《危險性病、蟲、雜草名錄》[17]。為防止列當隨作物種子入侵和傳播，常需要對作物種子樣品進行檢測和鑒定，目前常用的方法為顯微鏡檢驗[18]，費時費工，且漏檢率高，而本研究中的DNA條形碼技術(shù)可以替代常規(guī)的檢疫方法，這將大大降低實際工作中的檢疫難度，對進一步開展植物檢疫工作的積極作用。為了評估列當發(fā)生區(qū)域寄主作物種植的安全性，需要對土壤中的列當種子、種類進行檢測，避免在已受列當侵染的大田中種植可能的寄主作物，利用分子檢測技術(shù)對指導(dǎo)列當防治也具有重要意義。

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Survey and Species Identification of Parasitic Weed Broomrape

WANG Ya-jiao1， JI Li-jing1， LI Qiu-sheng1， WANG Lian-sheng1， PAN Jin-hong2， KONG Ling-xiao1

(1.Institute of Plant Protection，Hebei Academy of Agricultural and Forestry Sciences/IPM Technology Research Center of

Hebei Province/Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Northern Region of North China，Ministry of

Agriculture，Baoding 071000，China； 2.Agriculture and Animal Husbandry Bureau in Yu County of Zhangjiakou

City in Hebei Province，Zhangjiakou 075000，China)

Abstract:As noxious root parasitic weeds，species of Orobanche (broomrape) are hard to control and cause serious losses in many subtropical crops such as tomato，sunflower，tobacco and melon. It is difficult to distinguish the numerous broomrapes yet it is of great importance to correctly identify them to design effective control measures. Nineteen types of broomrapes were collected from Xinjiang Uyghur Autonomous Region，Hebei Province，Inner Mongolia Autonomous Region and Jilin Province. Species were identified by morphologic observation and DNA bar code technology，and their genetic relationships were investigated. Broomrape parasitizing tomato in Xinjiang was Orobanche aegyptiaca Pers.；those parasitizing tobacco and sunflower in Hebei Province and sunflower in Jilin Province corresponded to Orobanche cernua Loefling. There are obvious system evolutionary differences between O. aegyptiaca and O. cernua in the phylogenetic tree. O. cernua was divided into two taxonomical groups with obvious geographical zoning differentiation unrelated to the host plant. Seven types of broomrapes collected from Hebei Province belonged to a group，eight types from Jilin Province，Xinjiang

Uyghur Autonomous Region and inner Mongolia autonomous region belonged to the second group. In the second group，four broomrapes collected from Jilin Province have the closest genetic relationship.

Key words:parasitic weed；broomrape；morphological character identification；DNA bar code；phylogeny

通信作者：孔令曉，碩士，研究員，研究方向為植物病害。E-mail：konglingxiao163@163.com。

作者簡介：王亞嬌(1988—)，女，河北保定人，碩士，研究實習(xí)員，主要從事植物病害和列當綜合防治研究。E-mail：yajiaowang515@163.com。

基金項目：河北省財政項目(編號：F13R10001)；河北省財政基本科研業(yè)務(wù)費(編號：494-0401-JBN-6440)。

收稿日期：2015-04-13

中圖分類號：S451

文獻標志碼：A

文章編號：1003-935X(2015)03-0006-05