3種不同方法檢測艱難梭菌芽孢率的比較

徐　蓉,　葛　平,　陳　蓉,　劉學(xué)杰

(上海市臨床檢驗中心，上海 200126)

3種不同方法檢測艱難梭菌芽孢率的比較

徐蓉,葛平,陳蓉,劉學(xué)杰

(上海市臨床檢驗中心，上海 200126)

摘要：目的了解艱難梭菌檢測的芽孢率并進行比較。方法采用平板涂布法、相差顯微鏡計數(shù)法和孔雀綠染色法3種檢測方法對艱難梭菌ATCC 43596和VPI 10463經(jīng)培養(yǎng)96 h和120 h 后的芽孢率進行了比較分析。結(jié)果顯示平板涂布法芽孢檢出率最高為(25.3%、15.6%)，變異較大(SD=7.1%，4.3%)；相差顯微鏡計數(shù)法和孔雀綠染色法結(jié)果相近分別為(13.3%、9.4%)、(13.4%、9.8%)，變異較小(SD=1.9%、0.8%)、(SD=1.4%、0.9%)。結(jié)論在選用平板涂布法檢測芽孢率時，建議聯(lián)合相差顯微鏡法或者孔雀綠染色法以減少偏移。

關(guān)鍵詞：芽孢；艱難梭菌；檢測

中圖分類號：

文章編號：1673-8640(2015)02-0201-03R446.5

文獻標(biāo)志碼：碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.02.023

作者簡介：徐蓉，女，1973年生，本科，主要從事微生物檢驗工作。

收稿日期：(2014-12-25)

艱難梭菌(Clostridiumdifficile)為革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，是醫(yī)院感染的主要病原菌之一，約25%～33%的抗菌藥物相關(guān)性腹瀉以及90%的偽膜性腸炎都是由艱難梭菌所致[1]。芽孢是艱難梭菌傳播的主要形式，具有感染性，耐熱、耐干燥，對許多消毒劑和抗菌藥物高度耐藥。因此，芽孢在宿主體外的有氧環(huán)境中可長期存在，體內(nèi)則可能與艱難梭菌感染治療停藥后復(fù)發(fā)相關(guān)[2]。

文獻報道的艱難梭菌產(chǎn)芽孢率有較大差異，其原因可能與菌株之間的差異和樣本量的大小有關(guān)，亦可能與研究者們所用方法不同相關(guān)[3-5]。本實驗對平板涂布法、相差顯微鏡計數(shù)法和孔雀綠染色后計數(shù)法檢測艱難梭菌產(chǎn)芽孢率進行了比較分析。

材料和方法

一、材料

1. 實驗菌株采用國際標(biāo)準(zhǔn)菌株艱難梭菌ATCC 43596和VPI 10463。

2. 培養(yǎng)基和試劑Brucella瓊脂和厭氧發(fā)生袋為美國BBL Microbiology Systems公司產(chǎn)品；血紅素(5 mg/L)，維生素K1(5 mg/L)與?；悄懰徕c鹽為美國Sigma公司產(chǎn)品；脫纖維羊血為上海閔行區(qū)諸翟無菌動物血試劑供應(yīng)站產(chǎn)品。0.01 M磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)為德國Merck公司產(chǎn)品。

二、方法

1. 厭氧菌培養(yǎng)冰凍菌株在布氏血平板上復(fù)蘇并傳代2次(37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h)，再次傳代，將平板上過夜培養(yǎng)的艱難梭菌用PBS制成麥?zhǔn)?.5的菌懸液，取10 μL菌懸液分別涂布于布氏血平板上，37 ℃厭氧培養(yǎng)96 h和120 h。

2. 平板涂布法將平板上菌落全部刮入PBS懸液，將該菌懸液等量分裝成2管，一管直接用生理鹽水10倍系列稀釋，取0.1 mL菌液均勻涂布在添加牛磺膽酸鹽的布氏血平板，菌落計數(shù)(a：營養(yǎng)細(xì)胞和芽孢)；另一管65 ℃水浴20 min以殺死營養(yǎng)細(xì)胞，再用生理鹽水進行系列稀釋，取0.1 mL均勻涂布相同平板，厭氧培養(yǎng)48 h后菌落計數(shù)(b：芽孢)。產(chǎn)芽孢率=b/a×100%。

3. 相差顯微鏡計數(shù)法挑一個純菌落入4.5 mL PBS緩沖液混勻(或直接從菌液中取樣，必要時1∶10稀釋成合適濃度)，取7 μL加入Burker載玻片。置于相差顯微鏡下，菌液流動靜止后觀察。任取Burker載玻片上3個大區(qū)，共48個小區(qū)即48個視野進行計數(shù)。取10 μL加入產(chǎn)芽孢率 =芽孢數(shù)/(芽孢數(shù)+營養(yǎng)細(xì)胞數(shù))×100%。

4. 孔雀綠染色后顯微鏡計數(shù)法將培養(yǎng)96 h的艱難梭菌作涂片、干燥、固定；然后滴加3～5滴孔雀綠染液于已固定的涂片上，并用木夾夾住載玻片在火焰上加熱，使染液冒蒸汽但勿沸騰或蒸干，加熱時間從染液冒蒸汽時開始計算約4~5 min；傾去染液，待玻片冷卻后水洗至孔雀綠不再褪色為止；用番紅水溶液復(fù)染1 min，水洗；待干燥后，置油鏡觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。觀察10個視野的營養(yǎng)細(xì)菌與芽孢數(shù)。產(chǎn)芽孢率 =芽孢數(shù)/(芽孢數(shù)+營養(yǎng)細(xì)胞數(shù))×100%。

5. 重復(fù)性實驗2株標(biāo)準(zhǔn)菌株艱難梭菌ATCC 43596和VPI 10463分別在96 h和120 h培養(yǎng)后檢測芽孢率，同樣條件重復(fù)實驗3次。

三、統(tǒng)計學(xué)方法

采用Excel 2007計算百分比進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

結(jié)果

一、3種不同方法檢測艱難梭菌芽孢率結(jié)果比較

ATCC 43596、VIP 10463培養(yǎng)96 h，用平板涂布法檢測芽孢率最高(平均檢出率為25.3%、15.6%)，培養(yǎng)120 h(平均檢出率為43.0%、35.4%)，但變異較大；相差顯微鏡計數(shù)法(平均檢出率為13.3%、9.4%)，培養(yǎng)120 h(平均檢出率為35.0%、27.8%)和孔雀綠染色法(平均檢出率為13.4%、9.8%)，培養(yǎng)120 h(平均檢出率為32.7%、28.2%)結(jié)果相近且變異較小，結(jié)果見表1。

表1　3種不同方法對培養(yǎng)96 h、120 h艱難梭菌芽孢檢測率的比較　(%)

討論

平板涂布法是最為常用的檢測芽孢率的方法。該方法原理為在65 ℃水浴20 min或100%乙醇共同孵育后，營養(yǎng)細(xì)胞被殺死，僅芽孢能存活。經(jīng)過上述處理后在平板上生長的克隆數(shù)量就可代表芽孢數(shù)量。但是，雖然經(jīng)過水浴或者乙醇處理，仍有可能少部分對熱/化學(xué)抗性強的營養(yǎng)細(xì)胞遺留下來，也可能有少許芽孢并沒有轉(zhuǎn)化為營養(yǎng)細(xì)胞。因此，在研究不同菌株芽孢率的時候需考慮細(xì)菌生長情況，芽孢抗性以及芽孢的萌發(fā)能力。因此，用平板計數(shù)法時建議使用營養(yǎng)條件好的培養(yǎng)基，在艱難梭菌芽孢率檢測時可在培養(yǎng)基中加用含有促芽孢萌發(fā)的?；悄懰猁}[6]。

芽孢與營養(yǎng)細(xì)胞相比化學(xué)組成存在較大差異，容易在相差顯微鏡下觀察，但對技術(shù)人員的經(jīng)驗要求非常高。因為觀察的是在PBS懸液中的活細(xì)胞，所以首先必須速度快，否則液體干掉后就不能再進行觀察；其次因為是活細(xì)胞，在液體中會以不同面顯示，粗看可能是營養(yǎng)細(xì)胞，但翻個面其實有芽孢，因此，技術(shù)人員的經(jīng)驗非常重要。

孔雀綠染色法也是觀察芽孢常用的方法。其原理為芽孢壁厚、透性低，著色、脫色均較困難。因此，用著色力強的染色劑(如孔雀石綠)在加熱條件下進行染色時，染料不僅可以進入菌體，而且也可以進入芽孢，進入菌體的染料可經(jīng)水洗脫色，而進入芽孢的染色的染料則難以透出，若再用復(fù)染液(如沙黃水溶液)染色后，芽孢仍然保留初染劑的顏色，而菌體被染成復(fù)染劑的顏色，即菌體和芽孢分別染成紅色和綠色易于區(qū)分。但缺點也很明顯，芽孢壁厚染色困難，所以有時會有染色失敗[7]。而且孔雀綠染色只能檢測芽孢率，不能計數(shù)營養(yǎng)細(xì)胞或芽孢的數(shù)量。

3種檢測艱難梭菌芽胞方法都有明顯的優(yōu)缺點。其中平板涂布法結(jié)果變異較大，相差顯微鏡法和孔雀綠染色法結(jié)果差異相對較小且較為接近。因此，建議在做艱難梭菌的芽孢率研究時至少同時采用2種方法以減少結(jié)果的偏移。今后應(yīng)考慮研發(fā)新的檢測方法或者對現(xiàn)有方法進行改進，使得結(jié)果更為穩(wěn)定可靠、且簡便易操作。

參考文獻

[1]FREEMAN J, BAUER MP, BAINES SD, et al. The changing epidemiology of Clostridium difficile infections[J]. Clin Microbiol Rev,2010,23:529-549.

[2]孫靜,陳建華.枯草芽孢桿菌形成芽孢時母細(xì)胞中基因表達(dá)的調(diào)控[J].生物技術(shù)，2007，17:79-83.

[3]MERRIGAN M, VENUGOPA A, MALLOZZI M, et al. Human Hypervirulent Clostridium difficile Strains Exhibit Increased Sporulation as Well as Robust Toxin Production[J]. J Bacteriol, 2010,192:4904-4911.

[4]VOHRA P, POXTON I. Comparison of toxin and spore production in clinically relevant strains of Clostridium difficile[J]. Microbiology, 2011,157：1343-1353.

[5]BURNS DA, HEAP JT, MINTON NP. The diverse sporulation characteristics of Clostridium difficile clinical isolates are not associated with type[J]. Anaerobe,2010,16:618-622.

[6]SORG JA, SONENSHEIN AL. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid[J]. J Bacteriol, 2010,192：4983-4990.

[7]宋淑賢，聶清.微生物學(xué)常用細(xì)菌染色方法的改進[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2001，24：36.

(本文編輯：儲怡星)