股骨頭壞死患者壞死骨組織中miRNA表達(dá)譜變化

楊玉寶，劉洪亞，闞金慶，高忠禮，李林(山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院，山東臨沂76000;臨沂市人民醫(yī)院;吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院;延邊大學(xué)附屬醫(yī)院)

股骨頭壞死患者壞死骨組織中miRNA表達(dá)譜變化

楊玉寶1，劉洪亞1，闞金慶2，高忠禮3，李林4
(1山東醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院，山東臨沂276000;
2臨沂市人民醫(yī)院;
3吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院;4延邊大學(xué)附屬醫(yī)院)

摘要:目的觀察股骨頭壞死患者壞死骨組織中miRNA表達(dá)譜變化，探討miRNA在股骨頭壞死發(fā)生發(fā)展中的作用。方法選擇正常股骨粗隆間骨折(對(duì)照組)、股骨頭壞死(觀察組)患者各4例，分別取正常及壞死股骨頭骨組織，采用基因芯片技術(shù)檢測miRNA表達(dá)譜變化;經(jīng)聚類分析尋找明顯上調(diào)和下調(diào)的基因，以RT-PCR法檢測其表達(dá)量。結(jié)果兩組采用miRNA芯片檢測426個(gè)miRNA，上調(diào)比例≥2的有2條(hsa-miR-494-st和hsa-miR-29a-st)，下調(diào)比例≤0.5的有1條(hsa-miR-486-5p-st)。觀察組hsa-miR-29a-st的相對(duì)表達(dá)量為3.56±5.02，對(duì)照組為1.16 ±0.15，兩組比較，P＜0.05;觀察組hsa-miR-494-st、hsa-miR-486-5p-st的相對(duì)表達(dá)量分別為2.32±1.42、1.85± 1.24，對(duì)照組分別為4.13±3.18、3.78±2.69，兩組比較，P均＞0.05。結(jié)論股骨頭壞死患者壞死骨組織中存在miRNA表達(dá)譜變化，其中hsa-miR-29a-st可能在股骨頭壞死發(fā)生、發(fā)展過程中起調(diào)控作用。

關(guān)鍵詞:缺血壞死性股骨頭;microRNA;聚合酶鏈反應(yīng);基因芯片

股骨頭壞死是一種難治性疾病，其發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。股骨頭壞死一般自死骨邊緣和周圍活組織結(jié)合部開始修復(fù)，表現(xiàn)為血管再生、新骨形成和死骨吸收;隨著修復(fù)向死骨中央推進(jìn)，死骨吸收增強(qiáng)，而血管再生和新骨形成明顯減弱。研究證實(shí)，miRNA在基因調(diào)控血管生成過程中發(fā)揮重要作用。目前，關(guān)于miRNA在股骨頭壞死發(fā)生、發(fā)展過程中的作用少見報(bào)道。2011年11月～2013年6月，我們采用基因芯片檢測股骨頭壞死患者的壞死骨組織中miRNA表達(dá)譜，并對(duì)有顯著變化的miRNA進(jìn)行RT-PCR定量分析?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1臨床資料選擇臨沂市人民醫(yī)院收治的正常粗隆間骨折患者4例(對(duì)照組)、股骨頭壞死需人工股骨頭或全髖人工關(guān)節(jié)置換患者4例(觀察組)，男7例、女1例，年齡55～76歲。排除糖尿病、免疫系統(tǒng)慢性疾病。術(shù)中留取負(fù)重區(qū)軟骨下骨組織2～5 g裝入凍存管，置液氮中，1 h內(nèi)轉(zhuǎn)入超低溫冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.2miRNA檢測方法取兩組骨組織標(biāo)本，加入Trizol試劑提取總RNA。將1 μg總RNA加入1.5mL EP管，加入500 μL 1mmol/L Tris-Cl緩沖液，再加入1 μL ATP充分混勻;離心后收集管底溶液，放置于冰上。取0.2mL EP管，加入1 μg總RNA。如樣品體積超過8 μL，使用真空濃縮儀濃縮至8 μL以下，置于冰上。再根據(jù)制備poly(A)加尾及生物素標(biāo)記miRNA和miRNA基因芯片雜交，通過聚類分析從基因芯片結(jié)果中尋找與對(duì)照組相比上調(diào)比例≥2和下調(diào)比例≤0.5的miRNA。對(duì)明顯變化的miRNA進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，以2－ΔΔCt計(jì)算其表達(dá)量。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。所得數(shù)據(jù)以珋x±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

兩組采用miRNA芯片檢測426個(gè)miRNA，上調(diào)比例≥2的有2條(hsa-miR-494-st和hsa-miR-29ast)，下調(diào)比例≤0.5有1條(hsa-miR-486-5p-st)。兩組差異miRNA相對(duì)表達(dá)量比較見表1。

表1　兩組差異miRNA相對(duì)表達(dá)量比較()

表1　兩組差異miRNA相對(duì)表達(dá)量比較()

注:與對(duì)照組比較，*P＜0.05。

組別　hsa-miR-494-st　hsa-miR-29a-st hsa-miR-486-5p-st觀察組　2.32±1.42　3.56±5.02*1.85±1.24對(duì)照組4.13±3.18　1.16±0.15　3.78±2.69

3　討論

miRNA是一類長18～25 nt的內(nèi)源性非編碼小RNA，由一段具有發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)、長70～80 nt的單鏈RNA前體剪切后形成［1］。miRNA廣泛存在于真核

生物中，具有高度保守性、時(shí)序性和組織特異性，對(duì)細(xì)胞組織的功能及生命活動(dòng)起重要調(diào)控作用。由于其高度的時(shí)空特異性及類似于RNA干擾的特殊機(jī)制，使其在腫瘤的發(fā)病機(jī)制中廣受關(guān)注。miRNA的表達(dá)受到血流量的調(diào)控［2］。研究顯示，特異性miRNA可能與股骨頭壞死有關(guān)。Wang等［3］對(duì)壞死股骨頭患者血清miRNA進(jìn)行深度測序，發(fā)現(xiàn)股骨頭壞死患者血清中存在異常表達(dá)的miRNA。王義生等［4］用靶向特異性基因小干擾RNA(siRNA)預(yù)防酒精性股骨頭壞死，發(fā)現(xiàn)利用siRNA腺病毒載體能夠阻斷MSCs和PPAR-γ基因表達(dá)，阻止其成脂分化，保持其成骨分化，促進(jìn)骨修復(fù)，能在一定程度上預(yù)防酒精性股骨頭壞死。目前己知的作用于成骨細(xì)胞生成和分化相關(guān)通路的miRNA有miRNA-208［5］、miRNA-141和miRNA-200a［6］，它們通過調(diào)控BMP-2通路發(fā)揮作用，具有很強(qiáng)的促成骨分化能力;此外，miRNA-210可通過抑制AcvR1b抑制TGF-β/activin信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化［7］。Suzuki等［8］觀察了miRNA-210在股骨頭壞死患者血漿中的表達(dá)，認(rèn)為miRNA-210在股骨頭壞死過程可能起調(diào)控作用。

本研究對(duì)正常股骨頭和壞死股骨頭骨組織進(jìn)行miRNA芯片檢測，共檢測426個(gè)miRNA;經(jīng)聚類分析發(fā)現(xiàn)，上調(diào)比例≥2的有2條(hsa-miR-494-st和hsa-miR-29a-st)，下調(diào)比例≤0.5有1條(hsa-miR-486-5p-st)。RT-PCR檢測顯示，hsa-miR-494-st、hsamiR-486-5p-st的相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，hsa-miR-29a-st的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著升高。hsa-miR-29a-st是一種在非編碼區(qū)小的調(diào)節(jié)基因，主要功能表現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄與翻譯的水平上［9］。hsa-miR-29a-st是miRNA-29家族中的一個(gè)亞型［10～13］，其主要包括miRNA-29a、miRNA-29b、miRNA-29c，對(duì)人類腫瘤的發(fā)病起重要的調(diào)控作用。人類血液供應(yīng)豐富的骨肉瘤中miRNA-29a、miRNA-29b較正常骨組織有顯著變化，主要表現(xiàn)為下調(diào)基因;其與直腸癌的發(fā)病率也有明顯的相關(guān)性。新近研究證實(shí)，miRNA通過靶基因E2Fs來參與調(diào)節(jié)細(xì)胞反應(yīng)性缺氧缺血的各種生理病理過程［14］。因此推測，在正常股骨頭骨組織向股骨頭壞死組織轉(zhuǎn)化的過程中，上調(diào)基因hsa-miR-494-st、hsa-miR-29a-st及下調(diào)基因hsa-miR-486-5p-st可能通過某些靶基因的調(diào)控作用來完成，尤其是hsa-miR-29a-st在正常與缺血壞死性骨組織中存在明顯差異，其可能是加速股骨頭壞死的重要調(diào)控基因。

綜上所述，正常股骨頭骨組織與股骨頭缺血壞死性骨組織之間存在miRNA基因的變化，存在明顯上調(diào)與下調(diào)基因，這些miRNA可能引起調(diào)控血管靶基因受體的改變，使股骨頭骨組織血流受到影響，進(jìn)一步加速股骨頭壞死。在股骨頭骨組織發(fā)生壞死的整個(gè)過程中，miRNA可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。

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收稿日期:( 2015-05-08)

通信作者:李林

基金項(xiàng)目:吉林省教育廳十一五科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(2010-280)。

文章編號(hào):1002-266X(2015)34-0074-02

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

中圖分類號(hào):R681.8

doi:10.3969/j.issn.1002-266X.2015.34.033