氨基肽酶與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎

趙　琴，許夏雨，丁界先，張　燕，沈海麗

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕科，蘭州 730030)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)主要是因?yàn)樾?yīng)T細(xì)胞和抑制性T細(xì)胞比例失衡主導(dǎo)的、由腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-17(interleukin-17，IL-17)等多種細(xì)胞因子引起的以滑膜炎為主要病理改變的自身免疫性疾病，具體病因及發(fā)病機(jī)制沒有統(tǒng)一定論[1]。氨基肽酶(Aminopeptidase N，APN)廣泛表達(dá)于腎臟細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、滑膜細(xì)胞等多種細(xì)胞表面，又名為CD13[2]；使用ELISA方法在血清中也能檢測到APN[2]。腫瘤轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、γ干擾素(interferon-γ，IFN-γ)能上調(diào)APN的表達(dá)[2]。血管生成因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)也可通過絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)通路誘導(dǎo)APN的轉(zhuǎn)錄[3]。APN能移除多肽如趨化因子CXCL11、Ⅳ型膠原、胞外基質(zhì)酶等N端的中性氨基酸，從而對多肽進(jìn)行翻譯后修飾調(diào)節(jié)[2]。APN還是冠狀病毒、人巨細(xì)胞病毒等多種病毒的受體[2]，可增加滑膜細(xì)胞對病毒的易感性。RA的病因不明確，可能因冠狀病毒等病毒感染后產(chǎn)生多種病毒蛋白通過分子模擬引發(fā)自身免疫反應(yīng)，滑膜細(xì)胞表面上調(diào)的CD13分子為病毒的感染提供了組織特異性靶點(diǎn)，加重了關(guān)節(jié)的損傷。此外APN還參與了細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，它參與細(xì)胞的凋亡、T淋巴細(xì)胞的趨化、毛細(xì)血管形成、腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移、攝取膽固醇以及調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能[4]。推測APN可能在RA病變進(jìn)展過程中有重要作用。

APN的結(jié)構(gòu)

APN的編碼基因在15號染色體(q25-q26)，分子量150 kD，包含三個(gè)特征性的結(jié)構(gòu)域，即HEXXH序列、GXMEN基序以及鋅原子結(jié)合區(qū)，屬于鋅金屬蛋白酶M1家族[4]。由于APN的胞內(nèi)段較短并且不含已發(fā)現(xiàn)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基序，故APN不能直接引發(fā)下游信號通路，需要借助與APN胞內(nèi)段結(jié)合的一些小分子蛋白來傳遞信號。這些小分子蛋白是目前研究的熱點(diǎn)，已報(bào)道的小分子蛋白包括半乳凝集素-3(galectin-3)、半乳凝集素- 4(galectin- 4)、逆轉(zhuǎn)誘導(dǎo)富含半胱氨酸的蛋白質(zhì)(reverse the induced protein rich in cysteine，RECK)以及腫瘤相關(guān)抗原- 6(tumor-associated antigen- 6，TAA- 6)。

APN在RA的病程進(jìn)展中的作用

將RA患者的關(guān)節(jié)滑膜進(jìn)行組織染色并與骨關(guān)節(jié)炎患者及正常人的滑膜組織對比，發(fā)現(xiàn)RA患者的關(guān)節(jié)滑膜中APN的表達(dá)較正常人增高，并且也高于骨關(guān)節(jié)炎患者滑膜中APN的表達(dá)水平[5]。進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀和RT-PCR技術(shù)分析RA患者關(guān)節(jié)滑膜的成纖維樣細(xì)胞表面APN的表達(dá)明顯升高，APN的mRNA表達(dá)量增加[6]。推測APN可能在RA的病理改變過程中發(fā)揮重要作用。

APN對RA細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用

RA被普遍認(rèn)為是細(xì)胞免疫引發(fā)的系統(tǒng)性自身免疫性疾病。樹突狀細(xì)胞在細(xì)胞免疫中起重要作用，樹突狀細(xì)胞表面的APN上調(diào)后通過磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)通路促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的活化和分化，從而向T細(xì)胞和B細(xì)胞遞呈自身抗原，啟動(dòng)細(xì)胞免疫和體液免疫[7-8]。APN一方面能使TNF-α受體脫落，TNF-α受體脫落后與TNF-α結(jié)合，從而減少了TNF-α與中性粒細(xì)胞的結(jié)合，調(diào)節(jié)中性粒細(xì)胞脫顆粒、呼吸爆發(fā)引起的組織細(xì)胞損傷[9]。另一方面TNF-α受體脫落后與TNF-α結(jié)合，保護(hù)TNF-α不被血清中的酶降解，也能使TNF-α不斷結(jié)合到巨噬細(xì)胞表面使之活化，活化后的巨噬細(xì)胞趨化更多的T淋巴細(xì)胞，分泌更多的TNF-α，持續(xù)造成關(guān)節(jié)軟骨的破壞。這可能是RA病程慢性進(jìn)展的原因之一。除了調(diào)節(jié)TNF-α的作用以外，APN也能調(diào)節(jié)同RA發(fā)病密切相關(guān)的細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17和TNF-α的產(chǎn)生。取脾細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，抑制APN作用之后，脾臟特異T淋巴細(xì)胞的復(fù)制以及細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17 和TNF-α的產(chǎn)生也受到抑制[10]。然而這種抑制現(xiàn)象是通過什么機(jī)制發(fā)揮作用的尚不清楚。用脂多糖刺激巨噬細(xì)胞分泌TNF-α，通過蛋白免疫印跡Western-blot方法檢測發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)信號蛋白分子核轉(zhuǎn)錄因子(NF-kappaB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)、應(yīng)激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，SAPK/JNK)的表達(dá)量增加；而抑制NF-kappaB活化和MAPK、JNK磷酸化，則會(huì)抑制TNF-α的產(chǎn)生[11]。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子NF-kappaB、MAPK、JNK可能參與TNF-α的產(chǎn)生。有研究發(fā)現(xiàn)抑制磷脂酰肌醇3激酶通路(PI3K/Akt)和NF-kappaB會(huì)抑制IL-17的產(chǎn)生[12]，細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子PI3K/Akt、NF-kappaB可能參與IL-17的產(chǎn)生。APN信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游能引發(fā)信號分子NF-kappaB、MAPK、JNK、PI3K活化[13]，推測RA患者滑膜細(xì)胞表面上調(diào)的APN也能促進(jìn)IFN-γ，IL-17和TNF-α的產(chǎn)生。

抑制APN可能減緩關(guān)節(jié)軟骨的破壞

應(yīng)用ELISA方法檢測發(fā)現(xiàn)RA患者血清明膠酶A(matrix metalloproteinases-2，MMP-2)和明膠酶B(matrix metalloproteinases-9，MMP-9)的水平升高[14]。它們參與基質(zhì)的降解、骨質(zhì)破壞以及調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖。分離RA患者的成纖維樣滑膜細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，抑制MMP-2和MMP-9會(huì)抑制RA成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖[15]。MMP-2和MMP-9除參與成纖維細(xì)胞的增殖以外，還會(huì)促進(jìn)IL-1β、白細(xì)胞介素- 6(interleukin- 6，IL- 6)、TNF-α產(chǎn)生，促進(jìn)成纖維樣滑膜細(xì)胞的存活、遷移和浸潤和加劇軟骨的破壞[15]。因此MMP在RA患者的關(guān)節(jié)軟骨破壞過程中起關(guān)鍵作用。應(yīng)用Western-blot方法檢測發(fā)現(xiàn)MMP-2和MMP-9的水平升高之后，細(xì)胞內(nèi)的信號蛋白分子MAPK、JNK、NF-kappaB的水平隨之升高[13]。推測MAPK、JNK、NF-kappaB可能是MMP活化后下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的信號分子。反之，在骨肉瘤細(xì)胞中抑制MMP-2和MMP-9的活性或減少它們的表達(dá)量，通過Western-blot方法檢測發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子MAPK家族成員p38、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases1/2，ERK1/2)、JNK以及PI3K、NF-kappaB水平均下降[13]。利用IL- 6刺激APN的表達(dá)后，瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移增加、MMP活性增強(qiáng)、MAPK、PI3K、NF-kappaB的含量均增加[13]。因此APN可能位于細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游，促進(jìn)MMP-2、MMP-9的產(chǎn)生，MMP-2、MMP-9可能通過胞內(nèi)信號蛋白分子MAPK、JNK、NF-kappaB促進(jìn)軟骨破壞。抑制APN的作用，可能會(huì)從細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生，抑制骨質(zhì)破壞。

APN參與T淋巴細(xì)胞的趨化，促進(jìn)RA關(guān)節(jié)破壞

用IL-17誘導(dǎo)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型的滑膜纖維樣細(xì)胞表達(dá)APN，T細(xì)胞數(shù)目增加[5]。并且抑氨肽酶素(bestatin)抑制APN的作用后會(huì)明顯抑制淋巴細(xì)胞的趨化能力[6]。此外下調(diào)APN的表達(dá)能抑制放線酰胺素、肝素引起的趨化CD4+T細(xì)胞的遷移效應(yīng)[10]。因此，推測APN會(huì)影響T細(xì)胞的趨化。RA患者增生的滑膜巨噬細(xì)胞有兩種來源，一是血液循環(huán)中的巨噬細(xì)胞，二是滑膜組織原來存在的巨噬細(xì)胞。APN能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌趨化因子吸引T細(xì)胞，滑膜中T細(xì)胞浸潤分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-17等促進(jìn)關(guān)節(jié)軟骨破壞[16]。在RA中，中性粒細(xì)胞的比例小于淋巴細(xì)胞比例，淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生趨化因子吸引淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞向滑膜浸潤，T細(xì)胞活化又能促進(jìn)APN的表達(dá)，所以APN的上調(diào)可能是T細(xì)胞在RA病理過程中的正反饋效應(yīng)。APN的上調(diào)能促進(jìn)毛細(xì)血管形成以及巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞的趨化。因此通過抑制APN的作用，可能會(huì)抑制RA血管翳形成，從而減輕關(guān)節(jié)軟骨的破壞程度。

APN參與血管形成

APN參與毛細(xì)血管形成、內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動(dòng)及粘附。APN交聯(lián)后可以活化局部黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)，引起細(xì)胞骨架改變，誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞黏附和遷移[17]。在受到血管生成信號后，活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面APN的表達(dá)上調(diào)，人為干預(yù)APN的作用后毛細(xì)血管的形成受到影響。bestatin作用于內(nèi)皮細(xì)胞48 h后，血管內(nèi)皮生長因子基因表達(dá)下降。bestatin作用于內(nèi)皮細(xì)胞72 h后抑制了內(nèi)皮細(xì)胞微管蛋白形成[18]。因此，推測APN可能參與血管生成的調(diào)節(jié)。此外APN可能還參與調(diào)節(jié)血管生成過程的啟動(dòng)環(huán)節(jié)。分別從野生型和APN基因敲除的大鼠的骨基質(zhì)細(xì)胞中分離間充質(zhì)干細(xì)胞，正常的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞，但是APN基因敲除大鼠的干細(xì)胞則無法分化成血管內(nèi)皮細(xì)胞。因此APN可能是血管形成的必要條件。RA患者的滑膜病理改變基礎(chǔ)是滑膜中出現(xiàn)由新生毛細(xì)血管和炎性細(xì)胞組成的血管翳，血管翳的形成與關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞直接相關(guān)。APN在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中參與血管生成的啟動(dòng)和調(diào)節(jié)，因此推測RA血管翳的形成可能也與滑膜細(xì)胞表面上調(diào)的APN有關(guān)。

APN可能參與調(diào)節(jié)滑膜細(xì)胞的增殖

APN/CD13單抗作用于絨毛膜癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞能夠阻止它們的增殖，bestatin作用于腫瘤細(xì)胞模型ES-2細(xì)胞株能夠明顯抑制其增殖活性[19]。在卵巢癌細(xì)胞株(SKOV-3細(xì)胞株)中也會(huì)產(chǎn)生抑制作用[20]。推測APN可能參與調(diào)節(jié)細(xì)胞分裂，能促進(jìn)細(xì)胞增殖。APN下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)小分子半乳凝集素-3(galectin-3)和凋亡相關(guān)調(diào)控蛋白Bcl-2(B-cell lymphoma-2)的結(jié)構(gòu)特征相似[21]，能防止線粒體破壞和細(xì)胞色素C的釋放[22]，具有抗凋亡的作用。RA的主要病理改變包括滑膜細(xì)胞增殖，滑膜增厚?；ぜ?xì)胞分為兩類，包括具有巨噬細(xì)胞樣功能的A細(xì)胞和纖維母細(xì)胞樣的B型細(xì)胞。推測RA患者關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞大量增殖可能也受APN的調(diào)節(jié)作用。但是阻斷APN的作用是否能中斷或減緩滑膜細(xì)胞的增殖尚無試驗(yàn)證實(shí)。由于抑制APN能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，所以APN抑制劑對RA合并腫瘤的患者及由于長期服用生物制劑而引發(fā)腫瘤的患者提高長期生存率有重要意義。

APN可能與RA血脂水平升高有關(guān)

RA患者與健康人相比，血脂存在明顯異常，并且在RA活動(dòng)期血脂異常水平高于RA緩解期，而血脂異常是RA患者并發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素[23]。但是，造成RA患者血脂升高的原因并不清楚。依折麥布(Ezetimibe Tablets)(臨床治療高脂血癥的藥物)和APN結(jié)合能引起小腸細(xì)胞細(xì)胞膜上的脂伐內(nèi)翻，下調(diào)細(xì)胞表面攝取膽固醇相關(guān)的蛋白，通過改變APN的構(gòu)象影響APN與Fc受體(免疫球蛋白F段C末端受體)的交聯(lián)，抑制腸道對膽固醇的攝取從而降低血低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)水平[24]。而RA患者產(chǎn)生細(xì)胞因子如IFN-γ、TGF-β能誘導(dǎo)滑膜APN的表達(dá)增加，APN能促進(jìn)腸道對外源性膽固醇的攝取，由此推測可能是RA患者小腸黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)的APN上調(diào)，從而促進(jìn)對外源性膽固醇及甘油三酯的攝取，使RA患者的血清LDL增加。下調(diào)APN的表達(dá)可能降低RA患者的血脂水平，防止動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。

展　　望

APN的上調(diào)參與趨化淋巴細(xì)胞浸潤關(guān)節(jié)滑膜、促進(jìn)RA患者的關(guān)節(jié)軟骨破壞，啟動(dòng)和調(diào)節(jié)血管翳形成。推測其在RA病理改變過程中起全面調(diào)控的作用。目前對APN的研究多是通過APN單抗進(jìn)行的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，整體的APN缺陷的RA動(dòng)物模型很少，這在一定程度上限制了APN對完整動(dòng)物體的作用的研究。并且APN對細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)IL-17和TNF-α產(chǎn)生的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。除此以外，APN不僅可能是RA的危險(xiǎn)因素，而且能夠促進(jìn)腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移，目前針對RA治療的傳統(tǒng)藥物主要是改善病情的傳統(tǒng)的抗風(fēng)濕藥物(disease-modifying anti-rheumatic drugs，DMARDs)及生物制劑，在一定程度上緩解了患者的關(guān)節(jié)癥狀，但是不能達(dá)到完全緩解，且藥物起效時(shí)間長、長期使用會(huì)引發(fā)感染、腫瘤等副作用，其安全性和療效有待提高。APN可能參與RA的病理發(fā)展進(jìn)程，因此抑制APN的作用可能對RA的發(fā)病有緩解作用，APN抑制劑可能是RA治療的另一靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。

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