七氟醚對老齡大鼠海馬CA3區(qū)突觸結構的影響

韋曉勇，王　毅，閔紅星，陸　波，李　軍

七氟醚對老齡大鼠海馬CA3區(qū)突觸結構的影響

韋曉勇1，王毅2a，閔紅星2a*，陸波2b，李軍2b

[摘要]目的觀察七氟醚對老齡大鼠海馬CA3區(qū)突觸結構的影響。方法健康SD大鼠60只，18月齡，隨機分為4組：空白對照組(C組)、3%七氟醚組(S1組)、1.5%七氟醚組(S2組)、3%異氟醚組(I組)，每組15只。于麻醉結束后1、3、7 d (T1~T3)行Morris水迷宮實驗，并測定海馬CA3區(qū)突觸結構各指標。結果與C組比較，I組T1~T3、S1組T1~T2時逃避潛伏期延長，穿越原平臺象限次數(shù)減少，I組、S1組T1~T3海馬CA3區(qū)突觸間隙增寬，PSD厚度變薄，突觸活性區(qū)長度縮短，突觸界面曲率減小(P<0.05)；與I組、S1組比較，S2組T1~T2時逃避潛伏期縮短，T1~T3海馬CA3區(qū)突觸間隙變窄，PSD厚度增厚，突觸活性區(qū)長度延長，突觸界面曲率增大(P<0.05)；與I組比較，S1組、S2組T3時逃避潛伏期縮短，穿越原平臺象限次數(shù)增加(P<0.05)；與S1組比較，I組T3時逃避潛伏期延長，穿越原平臺象限次數(shù)減少(P<0.05)；與T1比較，I組、S1組、S2組T2~T3時逃避潛伏期縮短(P<0.05)。結論低濃度七氟醚對老齡大鼠認知功能無明顯影響，高濃度七氟醚、異氟醚均可導致老齡大鼠認知功能減退，其機制可能與抑制海馬CA3區(qū)突觸結構的改變有關。

[關鍵詞]七氟醚；認知障礙；海馬；突觸；異氟醚

[Abstract]Objective To observe the effects of sevoflurane on the synaptic interface structure in hippocampal CA3 area in senile rats. MethodsSixty healthy SD rats aged 18 months were randomly divided into 4 groups: blank control group(group C,n=15),3% sevoflurance group (group S1,n=15),1.5% sevoflurance group (group S2,n=15),3% isoflurane group (group I,n=15). The Morris water maze test was performed at the 1st,3rd and 7th day (T1~T3) after anesthesia,and the synaptic structure in hippocampal CA3 area was measured.ResultsCompared with group C,the escape latency was longer,the frequency of crossing the original platform was reduced at T1~T3in group I and at T1~T2in group S1,the width of synaptic cleft increased,the thickness of the postsynaptic density decreased,the length of active zones was shortened,and the curvature of the synaptic interface decreased at T1~T3in group I and group S1(P<0.05);Compared with group I and group S1,the escape latency was shortened at T1~T2in group S2,the width of synaptic cleft decreased,the thickness of the postsynaptic density increased,the length of active zones was prolonged,and the curvature of the synaptic interface was increased at T1~T3in group S2(P<0.05);Compared with group I,the escape latency was shortened,the frequency of crossing the original platform increased at T3in group S1and group S2(P<0.05);Compared with group S1,the escape latency was longer,the frequency of crossing the original platform was reduced at T3in group I (P<0.05);Compared with T1,the escape latency was shortened at T2~T3in group I,group S1and group S2(P<0.05).ConclusionSevoflurane of low concentration has no obvious effect on cognitive function in senile rats. Both sevoflurane and isoflurane of high concentration can induce the cognitive hypofunction in senile rats,and the mechanism may be associated with the inhibition of the changes of synaptic structure in hippocampal CA3 area.

收稿日期：2015-02-10

基金項目：國家自然科學基金青年基金(81102885)

通信作者*

DOI:10.14053/j.cnki.ppcr.201510002

Effects of sevoflurane on the synaptic interface structure in hippocampal CA3 area in senile ratsWEI Xiao-yong1,WANG Yi2a,MIN Hong-xing2a*,LU Bo2b,LI Jun2b(1.Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2.a.Department of Anesthesiology,b.Department of Preventive Care,General Hospital of Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China)

Key words：Sevoflurane;Cognition disorders;Hippocampus;Synapses;Isoflurane

0引言

術后認知功能障礙(POCD)是老年患者術后常見的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，臨床表現(xiàn)為以記憶下降為主的認知功能減退[1]。大量研究表明，七氟醚麻醉可引起老年大鼠空間認知功能障礙[2-3]。前期研究結果表明，高濃度七氟醚可引起老齡大鼠早期空間學習和記憶能力一過性下降，但未闡明機制[4]。突觸是神經(jīng)元之間傳遞信息的重要結構，海馬不同區(qū)域的功能不盡相同，其中CA3區(qū)在學習記憶中起重要作用[5]。因此，本研究擬通過觀察七氟醚對老齡大鼠海馬CA3區(qū)突觸結構的影響，探討七氟醚導致認知功能減退的可能機制。

1材料與方法

1.1動物選擇及分組健康雄性SD大鼠60只(由寧夏醫(yī)科大學動物實驗中心提供，清潔級，合格證號：SCXK(寧)2011-0001)，18個月齡，體重450~500 g，隨機分為4組：空白對照組(C組)、3%七氟醚組(S1組)、1.5%七氟醚組(S2組)、3%異氟醚組(I組)，每組15只。

1.2主要藥品及儀器七氟醚(魯南貝特制藥有限公司，批號：65130101)，異氟醚(魯南貝特制藥有限公司，批號：110408)，Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，麻醉氣體監(jiān)測儀(Drager infinity kappa，德國)，麻醉機(Drager，SA2-C型，德國)，H-7500型透射電鏡(Hitachi公司，日本)，生物安全柜[力康HealForce，A2型，力新儀器(上海)有限公司]。

1.3麻醉方法自制透明麻醉箱，為透明玻璃材質(zhì)，體積為40 cm×30 cm×25 cm，麻醉箱30 cm×25 cm的兩側(cè)壁中線距上下頂?shù)? cm處各有一孔，一孔接麻醉機，另一孔連接麻醉氣體監(jiān)測儀，麻醉時在箱底部鋪設一薄層鈉石灰，吸收二氧化碳，防止麻醉過程箱內(nèi)二氧化碳蓄積影響實驗結果，并在鈉石灰上平鋪一層醫(yī)用紗布，防止大鼠吸入鈉石灰粉塵和灼傷四肢皮膚。每組隨機取6只大鼠進行Morris水迷宮適應性訓練3 d，之后將其與每組剩余的大鼠分別置于自制的循環(huán)密閉麻醉箱中，并把麻醉箱放于生物安全柜中，以便收集廢氣，麻醉箱連接于麻醉呼吸機螺紋管回路中，麻醉呼吸機工作狀態(tài)為手控模式，調(diào)節(jié)排氣閥至最小壓力，調(diào)節(jié)七氟醚揮發(fā)罐輸出濃度為3%行麻醉誘導，吸入氧濃度40%，麻醉機輸出氣體總流量2 L/min,接氣體監(jiān)測儀監(jiān)測麻醉箱內(nèi)氧氣、二氧化碳、七氟醚的濃度。待大鼠翻正反射消失后，S2組調(diào)節(jié)七氟醚揮發(fā)罐使箱內(nèi)七氟醚濃度達1.5%，吸入2 h，觀察大鼠皮膚顏色，監(jiān)測呼吸頻率、心率和脈搏血氧飽和度，之后將大鼠置于氧濃度約為40%的環(huán)境中任其自然蘇醒，之后回籠飼養(yǎng)，自由取食。S1組、I組方法同上，分別調(diào)節(jié)七氟醚、異氟醚揮發(fā)罐，維持箱內(nèi)七氟醚、異氟醚濃度均為3%，吸入2 h。C組只吸入含有40%氧氣的空氧混合氣體2 h。維持麻醉箱溫度(25±1)℃。

1.4行為學測試于麻醉結束后1、3、7 d (T1~T3) 3個時段，將每組適應性訓練后的6只大鼠分別行Morris水迷宮測試，具體過程參照文獻[4]，記錄大鼠尋找并爬上平臺所需時間(逃避潛伏期)，如果在120 s內(nèi)未到達平臺，則由實驗者將其引至平臺，逃避潛伏期記為120 s，每次訓練間隔1 min。取大鼠4次逃避潛伏期的平均值，作為其該日的學習成績，即逃避潛伏期(s)。定位航行實驗結束后撤除平臺，將大鼠于原平臺象限池壁中點背向池壁放入水中，記錄120 s內(nèi)穿越原平臺象限的次數(shù)。

1.5電鏡觀察于上述3個時段每組隨機取3只大鼠，10%水合氯醛(0.4 mL/100 mg)腹腔注射麻醉下，待大鼠翻正反射消失后，開胸，暴露心臟，經(jīng)升主動脈依次灌注4%多聚甲醛和生理鹽水，灌注結束后快速斷頭取腦，并在冰盤上分離海馬組織，置于2.5%戊二醛中固定，4 ℃過夜。參照邊緣系統(tǒng)解剖圖譜切取左側(cè)海馬CA3區(qū)1 mm×1 mm×1 mm組織塊，l%鋨酸固定l h，常規(guī)乙醇、丙酮脫水、透明，Epon 812包埋，制備厚度約70 nm超薄切片，醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色。采用H-7500型透射電鏡(Hitachi公司，日本)下進行觀察，取40 000倍放大倍數(shù)，每張切片隨機選5個視野，采用多點平均法測量突觸間隙寬度，參照文獻[6]介紹的方法，測量突觸后膜致密物(PSD)厚度、突觸活性區(qū)長度及突觸界面曲率(突觸界面弧長與弦長之比)。

2結果

與C組比較，I組T1~T3、S1組T1~T2時逃避潛伏期延長，穿越原平臺象限次數(shù)減少(P<0.05)；與I組比較，S2組T1~T3、S1組T3時逃避潛伏期縮短，穿越原平臺象限次數(shù)增加(P<0.05)；與S1組比較，S2組T1~T2時逃避潛伏期縮短，I組T3時逃避潛伏期延長，穿越原平臺象限次數(shù)減少(P<0.05)；與T1比較，I組、S1組、S2組T2~T3時逃避潛伏期縮短(P<0.05)，見表1。

與C組比較，I組、S1組T1~T3海馬CA3區(qū)突觸間隙增寬，PSD厚度變薄，突觸活性區(qū)長度縮短，突觸界面曲率減小，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；S2組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與I組、S1組比較，S2組T1~T3海馬CA3區(qū)突觸間隙變窄，PSD厚度增厚，突觸活性區(qū)長度延長，突觸界面曲率增大，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；I組與S1組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

表1　四組大鼠各時段逃避潛伏期和穿越平臺次數(shù)比較

注：*與C組比較，P<0.05；#與I組比較，P<0.05；&與S1組比較，P<0.05；△與T2比較，P<0.05

表2　四組大鼠各時段海馬CA3區(qū)突觸結構參數(shù)的比較

注：*與C組比較，P<0.05；#與I組比較，P<0.05；&與S1組比較，P<0.05

3討論

Morris水迷宮是用于評估嚙齒類動物學習記憶功能的重要工具，已成為一種研究空間學習和記憶機制的標準工具[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，七氟醚和異氟醚對老齡大鼠的學習和記憶均有影響，且異氟醚較七氟醚對學習和記憶的影響恢復慢[4]。吸入麻醉藥對老年大鼠的學習記憶功能影響的發(fā)病機制尚無定論[8]。研究表明，海馬區(qū)域是重要的學習與記憶的存儲結構[9-10]，特別是CA3區(qū)與年齡相關性認知功能損害有關[11]，突觸是神經(jīng)元之間進行信息交流的關鍵部位[12]，其可塑性是突觸發(fā)育及神經(jīng)通路重塑的先決條件，是學習和記憶的形態(tài)學基礎[13]。因此，本研究采用Morris水迷宮實驗觀察吸入麻醉藥七氟醚及異氟醚對老齡大鼠認知功能障礙的影響，并通過電鏡測定海馬CA3區(qū)突觸結構各參數(shù)的變化，以探討其可能的相關機制。本研究以逃避潛伏期測量大鼠的學習能力，以穿越原平臺象限次數(shù)測量大鼠的記憶能力。結果顯示，與C組比較，S1組、I組逃避潛伏期延長，穿越原平臺象限次數(shù)減少，S2組各指標比較差異無統(tǒng)計學意義；與I組、S1組比較，S2組逃避潛伏期縮短，穿越原平臺象限次數(shù)增加，由此提示，低濃度七氟醚對老齡大鼠認知功能無明顯影響，高濃度七氟醚、異氟醚均可導致老齡大鼠認知功能減退。

突觸是神經(jīng)元與神經(jīng)元之間以及神經(jīng)元與效應細胞之間相互聯(lián)系和信息傳遞的結構，是神經(jīng)系統(tǒng)可塑性變化最敏感的部位[1,6]，其功能及結構完整性對維持大腦功能的正常至關重要。突觸前膜和突觸后膜之間的狹窄間隙稱為突觸間隙，其內(nèi)含有包含物、微絲、突觸間絲及特異性S-100蛋白質(zhì)等。有報道，突觸間隙增寬，影響間隙內(nèi)某些包含物的合成及其與遞質(zhì)間的結合，并且影響S-100蛋白質(zhì)與鈣離子的接觸，導致神經(jīng)沖動傳導受阻，學習記憶能力下降[14]。PSD是位于突觸活性區(qū)突觸后膜下方與胞質(zhì)相連的一層致密物質(zhì)，由細胞骨架蛋白與調(diào)節(jié)蛋白組成，其含有多種蛋白質(zhì)、酶及離子通道，這些物質(zhì)構象或數(shù)量的變化均可引起PSD 超微結構的變化，即厚度的改變，其厚度與神經(jīng)運動功能和學習記憶的保持能力密切相關[15]。突觸前膜與聚集成簇的突觸小泡相接觸形成突觸活性區(qū)，其長度反映神經(jīng)遞質(zhì)釋放的有效面積，且PSD厚度變化影響突觸可塑性[12]，進而影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳導。突觸界面曲率為活性區(qū)弧長與其相對應弦長之比，是突觸可塑性的潛在性特征，其增大可加大突觸間的接觸面，提高神經(jīng)信息傳遞的有效性。

本研究結果表明，與C組比較，Ⅰ組、S1組T1~T3海馬CA3區(qū)突觸間隙增寬，PSD厚度變薄，突觸活性區(qū)長度縮短，突觸界面曲率減小，S2組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義，提示高濃度七氟醚、異氟醚均可引起老齡大鼠海馬CA3區(qū)突觸結構的損傷。研究發(fā)現(xiàn)，異氟醚主要對PSD和突觸間隙寬度產(chǎn)生影響[14]，七氟醚可引起大鼠海馬內(nèi)PSD蛋白質(zhì)表達下調(diào)，造成長期的空間學習和記憶損害[16]。因此，推測高濃度七氟醚、異氟醚導致老齡大鼠認知功能減退，其機制可能與抑制海馬CA3區(qū)突觸結構的改變有關。

綜上所述，低濃度七氟醚對老齡大鼠認知功能無明顯影響，高濃度七氟醚、異氟醚均可導致老齡大鼠認知功能減退，其機制可能與抑制海馬CA3區(qū)突觸結構的改變有關。

參考文獻：

[1]陳勇,童希忠,胡衍輝,等.星狀神經(jīng)節(jié)阻滯對老齡大鼠術后海馬CA3區(qū)突觸結構的影響[J].中華麻醉學雜志,2014,34(2):158-160.

[2]Wang SQ,Fang F,Xue ZG,et al.Neonatal sevoflurane anesthesia induces long-term memory impairment and decreases hippocampal PSD-95 expression without neuronal loss[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2013,17(7);941-950.

[3]Xiong WX,Zhou GX,Wang B,et al.Impaired spatial learning and memory after sevoflurane-nitrous oxide anesthesia in aged rats is associated with down-regulated cAMP/CREB signaling[J].PloS One,2013,8(11):e79408.

[4]韋曉勇,李軍,王毅,等.七氟醚對老齡大鼠空間學習和記憶能力的影響[J].實用藥物與臨床,2015,18(4):379-382.

[5]農(nóng)偉東,莫雪安,陽玉群.甘露醇對骨髓間充質(zhì)干細胞治療血管性癡呆大鼠行為學及海馬CA3區(qū)突觸素表達水平的影響[J].中華神經(jīng)科雜志,2013,46(6):408-270.

[6]郭丹丹,章以杰,劉志成,等.硫化氫對老齡急性腦梗死大鼠海馬CA3區(qū)突觸結構的影響[J].實用藥物與臨床,2015,18(4):386-390.

[7]吳羽楠,張?zhí)N,林如輝,等.電針對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力及RhoA蛋白表達的影響[J].中國康復理論與實踐,2015,21(1):17-21.

[8]Mawhinney LJ,De Rivero Vaccari JP,Alonso OF,et al.Isoflurane/nitrous oxide anesthesia induces increases in NMDA receptor subunit NR2B protein expression in the aged rat brain[J].Brain Res,2012,1431:23-34.

[9]Deng W,Aimone JB,Gage FH.New neurons and new memories:how does adult hippocampal neurogenesis affect learning and memory[J].Nat Rev Neurosci,2010,11(5):339-350.

[10]Yassa MA,Stark SM,Bakker A,et al.High-resolution structural and functional MRI of hippocampal CA3 and dentate gyrus in patients with amnestie mild cognitive impairment[J].Neumimage,2010,51(3):1242-1252.

[11]Haberman RP,Colantuoni C,Stocker AM,et al.Prominent hippocampal CA3 gene expression profile in neurocognitive aging[J].Neurobiol Aging,2011,32(9):1678-1692.

[12]歐陽俊搖,王蕾,張秋霞,等.腦血流低灌注對大鼠突觸后致密物結構及PSD-95蛋白表達的影響[J].中國神經(jīng)免疫學和神經(jīng)病學雜志,2015,22(1):20-24,29.

[13]Kasai H,Fukuda M,Watanabe S,et al.Structural dynamics of dendritic spines in memory and cognition [J].Trends Neurosci,2010,33(3):121-129.

[14]崔香淑,金夢,崔常雷,等.異氟烷對老年患者全身麻醉術后認知功能的影響[J].中國老年學雜志,2015,35(6):1723-1726.

[15]段小東,張雷,胥方元,等.行為學訓練對局灶性腦缺血大鼠梗死側(cè)海馬CA3區(qū)突觸結構的影響[J].中國康復醫(yī)學雜志,2012,27(5):415-419.

[16]Wang SQ,Fang F,Xue ZG,et al.Neonatal sevoflurane anesthesia induces long-term memory impairment and decreases hippocampal PSD-95 expression without neuronal loss[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci,2013,17(7):941-950.

歡迎訂閱·歡迎投稿

作者單位：1.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學，南京 210023