2個(gè)水稻品種苗期高溫脅迫差異表達(dá)基因的克隆與表達(dá)

許錦彪，吳春芳，卞曉春，王玲娟，蔡曉東，汪 琴，趙 華，曹云英，3

（1．南通大學(xué)圖書(shū)館， 江蘇 南通226019； 2．南通大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院， 江蘇 南通226019；3．農(nóng)業(yè)部南方平原玉米觀察站， 江蘇 南通226019； 4．江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所， 江蘇 如皋226541）

水稻分布于亞洲和非洲的熱帶和亞熱帶地區(qū)。它是一種喜溫植物，在各個(gè)生長(zhǎng)階段都有其適宜的溫度范圍，當(dāng)超過(guò)這個(gè)范圍時(shí)，水稻的生長(zhǎng)發(fā)育就會(huì)受到一定的影響，常常會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)量降低、品質(zhì)變劣的情況。隨著工業(yè)的發(fā)展，環(huán)境也受到了一定的破壞，溫室效應(yīng)愈加明顯，水稻遭遇高溫脅迫的幾率也隨之增加，這推動(dòng)著國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)水稻高溫?zé)岷Φ难芯浚瑸榉€(wěn)定全球的糧食安全生產(chǎn)作出了貢獻(xiàn)［1－5］。

熱激蛋白（HSP）是在生物體中廣泛存在的一類(lèi)熱應(yīng)激蛋白質(zhì)。學(xué)者們認(rèn)為，當(dāng)有機(jī)體暴露于高溫（比生物體正常的生長(zhǎng)溫度高出5℃以上）下時(shí)，生物體中大部分正常蛋白質(zhì)的合成被抑制，植物就會(huì)由熱激發(fā)合成這種蛋白，通過(guò)一系列代謝反應(yīng)來(lái)應(yīng)對(duì)高溫脅迫，一般表現(xiàn)為降低正常蛋白的合成，加速熱激蛋白的轉(zhuǎn)錄和翻譯，從而來(lái)保護(hù)機(jī)體自身［6］。按照蛋白質(zhì)的大小，HSP可分為 HSP 110、HSP 90、HSP 70、HSP 60和小分子熱激蛋白smHSP（small HSP）5類(lèi)。由熱激誘導(dǎo)合成的蛋白稱(chēng)為誘導(dǎo)型熱激蛋白，與正常生活的細(xì)胞中的組成型熱激蛋白（HSC）在結(jié)構(gòu)和功能上沒(méi)有明的區(qū)別，很難區(qū)分，統(tǒng)稱(chēng)為HSP［7］。HSP在生物界中的一個(gè)重要特點(diǎn)是它們?cè)谶M(jìn)化過(guò)程中的高度保守性，這說(shuō)明它們具有普遍存在的重要生理功能，然而，在這方面的研究迄今為止還不充分，目前為止知道的HSPs的功能主要有2個(gè)方面，一是參與新生鈦的折疊、運(yùn)輸和組裝，二是參與逆境損傷蛋白的修復(fù)和降解。

本研究針對(duì)前期通過(guò)cDNA－AFLP技術(shù)的高溫差異表達(dá)片段，擬克隆該差異表達(dá)片段并測(cè)序，利用熒光定量PCR技術(shù)來(lái)檢測(cè)其在多種逆境下在耐熱性不同水稻幼苗葉片中表達(dá)量的變化，以期為以后對(duì)水稻逆境情況下的分子機(jī)制的研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 差異片段DNA的獲得

以cDNA－AFLP方法篩選、PAGE凝膠顯示的高溫差異片段（圖1方筐所示）為材料，切膠回收的產(chǎn)物為DNA 模板，用篩選時(shí)的引物（5′－GACTGCGTACCAATTCCT－3′和 5′－GATGAGTCCTGAGTAATG－3′）對(duì)該差異片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用DNA回收試劑盒（鼎國(guó)，北京）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收純化，純化產(chǎn)物用1%的瓊脂糖電泳檢測(cè)，獲得差異片段DNA。

1．2 差異片段的克隆

將 差 異 片 段 DNA 與pGEM－Teasy載 體（Promega，美國(guó)）進(jìn)行連接，連接方法參照載體說(shuō)明書(shū)來(lái)進(jìn)行，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH 5α，通過(guò)添加氨芐、IPTG和X－gal的LB平板培養(yǎng)，藍(lán)白斑篩選陽(yáng)性克隆，將陽(yáng)性克隆菌斑進(jìn)行菌落PCR和酶切鑒定，將鑒定為陽(yáng)性克隆的菌液委托上海英駿生物技術(shù)服務(wù)公司進(jìn)行測(cè)序。

1．3 基因片段的序列分析

測(cè)序結(jié)果去除載體和接頭序列后得到所需的差異片段的序列，通過(guò)NCBI的BLAST軟件進(jìn)行同源性序列分析，獲得該差異片段的基因號(hào)。

1．4 差異片段在不同逆境下的熒光定量表達(dá)分析

1．4．1 材料與處理

供試品種為敏感型秈稻雙桂1號(hào)和耐熱型品種黃華占。選取飽滿(mǎn)種子經(jīng)800倍液的50%多菌靈浸種48h，再以自來(lái)水沖洗干凈，清水浸種48h，種子露白時(shí)32℃催芽，等芽長(zhǎng)半谷長(zhǎng)時(shí)，室溫?zé)捬亢?，挑選整齊一致的發(fā)芽種子移至澆有Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的盆缽中，共12盆，每個(gè)品種6盆，每盆約有50株，于光照培養(yǎng)箱中濕潤(rùn)培養(yǎng)，溫度28℃／22℃（晝／夜），光照強(qiáng)度500μmoL／（m·s），光照12h／12h（晝／夜），相對(duì)濕度為90%／80%（晝／夜）。待水稻幼苗長(zhǎng)至3～4片葉時(shí)，將每個(gè)品種的6盆水稻分別分為5組；2盆用于42℃／42℃高溫處理，1盆用于150mmol／L NaCl處理，1盆用于100μmol／L精胺處理，1盆用于20%PEG 6000模擬干旱處理，1盆作為對(duì)照。分別在各處理0，3，6，12，24h及恢復(fù)24h取功能葉片于液氮中冷凍，迅速轉(zhuǎn)移到－80℃超低溫冰箱中用于總RNA提取。

1．4．2 葉片總RNA的提取及cDNA的合成

參 照 RNAiso－mate for plant tissue 說(shuō) 明 提 取RNA。通過(guò)Nanodrop 2000超微量核酸蛋白測(cè)定儀（美國(guó)）對(duì)RNA樣品進(jìn)行定量檢測(cè)。cDNA合成采用PrimeScript RT Master Mix Perfect Real Time方法來(lái)進(jìn)行，反應(yīng)體系中包含2μL 5×PrimeScript RT Master Mix，總 RNA＜500ng，加 RNase－free水至10μL。反應(yīng)程序?yàn)?7℃，15min；85℃，5s，4℃終止反應(yīng)。合成產(chǎn)物用于熒光定量PCR。

1．4．3 熒光定量PCR分析

利用 DNAMAN v 5．2．2 引 物 設(shè) 計(jì) 軟 件，根 據(jù)NCBI公布的ActinmRNA（AY 212324）和本實(shí)驗(yàn)測(cè)序所獲得序列設(shè)計(jì)引物。OsActin上游引物為5′－CTTCATAGGAATGGAAGCTGCGGGTA－3′和下游引物 為 5′－CGACCACCTTGATCTTCATGCTGCTA－3′；差 異 片 段 Os07g0620200 上 游 引 物 5′－AATGCACTCTGCATGCCCAC－3′，下游引 物為 5′－CCTGTAAACCAGGCCATGTGA－3′。 引 物 由 invitrogen上海貿(mào)易有限公司合成。

熒光定量PCR按照SYBR PrimeScript TM RTPCR KitⅡ試劑盒說(shuō)明操作，其反應(yīng)體系中含12．5μL SYBR Primx ExTaq Ⅱ、1μL 引 物、0．5μL ROX Referance DyeⅡ、2μL cDNA，加滅菌的雙蒸水至25μL。以 OsActin為內(nèi)參，4個(gè)重復(fù)，用 ABI 7500 Real－TimePCR儀分析差異片段在各處理下的表達(dá)情況。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性30s，然后95℃5s，60℃34s，循環(huán)40次。每一個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)實(shí)時(shí)測(cè)定熒光值，全部循環(huán)結(jié)束時(shí)測(cè)量熔解曲線(xiàn)。用ABI 7500Software v 2．0．4測(cè)定每一個(gè)樣品的Ct值（Cycles threshold），用相對(duì)定量法分析基因表達(dá)水平。

1．5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 19．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，用Duncan’s進(jìn)行處理間差異性檢驗(yàn)（p＝0．05），用Sigmaplot 12．0繪制圖表。

圖1 cDNA－AFLP顯示的差異片段（A）、PCR擴(kuò)增（B）、回收檢測(cè)（C）和藍(lán)白斑篩選（D）

2 結(jié)果與分析

2．1 差異表達(dá)片段的克隆

將高溫導(dǎo)致的差異表達(dá)片段（圖1 A）回收后，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)1%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，結(jié)果顯示為單一條帶（圖1B）；將該片段凝膠通過(guò)試劑盒進(jìn)行回收純化（圖1C），再將純化后的cDNA片段與T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞平板上過(guò)夜培養(yǎng)后，篩選陽(yáng)性克隆白斑（圖1D）；對(duì)白斑進(jìn)行菌落和酶切鑒定后送去測(cè)序。

2．2 差異表達(dá)片段的序列分析

對(duì)該差異表達(dá)片段克隆后經(jīng)測(cè)序和序列分析后，發(fā)現(xiàn)它由307個(gè)堿基組成，序列如下：GATGAGTCCTGAGTAATGGCATGTCTGGGGCTCCTTCACA GAATGGGGCACCATCCTACATCCCTTCACAGG CTTCTCAATTTGCAGCTGATAAATACTACACG TCCCCCAACTAATTTGGGGGATAATCTACAGT CTACAAACTAGTAAAGACTAAAGATTACTCA GCCAGGTGGTACAAGAGATCACCAGCTAACT ACAGACACAGGGTACATTTCCAAGGAACACA AGAGCAACATGAGACATGATGACAACAAAC GCAAAGCGACAGCAGAGGATCGGTCCATGCA GGAATTGGTACGCAGTC。對(duì)該序列通過(guò)BLAST搜索，發(fā)現(xiàn)為Os07g0620200基因，編碼產(chǎn)物與水稻中的熱激蛋白DnaJ N端的結(jié)構(gòu)域同源。

2．3 不同逆境下差異表達(dá)片段的熒光定量表達(dá)分析

2．3．1 基因表達(dá)的有效性

從圖2可見(jiàn)，差異表達(dá)片段Os07g0620200和內(nèi)參Os Actin的CT值在20～30之間（圖2A、B）；熔解曲線(xiàn)呈單峰（圖2C、D），即產(chǎn)物的特異性。說(shuō)明二者均獲得了有效擴(kuò)增的特異性產(chǎn)物。

2．3．2 高溫下Os07g0620200基因的表達(dá)

如圖3A所示，遇到高溫（42℃）時(shí)，雙桂1號(hào)中Os07g0620200基因的表達(dá)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間的變化明顯，0～3h之間有顯著的增加，之后開(kāi)始下降，在高溫處理24h后，該基因的表達(dá)趨近于0。與常溫對(duì)照相比，除了處理24h低于對(duì)照外，其余各時(shí)間點(diǎn)該基因的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照；而在黃華占品種中，高溫下Os07g0620200基因在各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量雖有所差異，但差異并不大，總體上呈上升趨勢(shì)，24h表達(dá)量達(dá)到最大（圖3E）。與常溫對(duì)照相比，除了處理12h略低于對(duì)照外，其余各時(shí)間點(diǎn)該基因的表達(dá)量均顯著高于對(duì)照。從2個(gè)品種到達(dá)最大表達(dá)量的時(shí)間相比，雙桂1號(hào)（3h）早于黃華占（24h），表明雙桂1號(hào)對(duì)高溫的反應(yīng)更早，更為敏感?；謴?fù)24h后，雙桂1號(hào)中Os07g0620200基因的表達(dá)量有明顯回升，但仍低于起始量，而黃華占中該基因的表達(dá)有所下降，但高于起始量，兩者均高于同期對(duì)照。

2．3．3 干旱脅迫下Os07g0620200基因的表達(dá)

如圖3B、F所示，2個(gè)品種在干旱脅迫下該基因的表達(dá)情況顯示了2種完全不同的表現(xiàn)，前者為先上升后下降的趨勢(shì)，變化范圍較大，6h時(shí)干旱脅迫明顯激活了該基因的表達(dá)，6～12h處在一個(gè)較高的表達(dá)水平，且在脅迫處理期間表達(dá)量明顯高于對(duì)照（圖3B）；后者則截然相反，呈先下降后上升的趨勢(shì)，基因表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定（圖3）。而且，在6h時(shí)雙桂1號(hào)中該基因的表達(dá)量幾乎達(dá)到了最大值（起始量的2倍多），黃華占則為最低點(diǎn)（起始量的一半左右）。與常溫對(duì)照相比，恢復(fù)24h后，兩者表現(xiàn)明顯不同，該基因的表達(dá)在雙桂1號(hào)中急劇減少，顯著低于起始量，與對(duì)照相當(dāng)，而在黃華占中的表達(dá)有明顯的增加，顯著高于其起始表達(dá)水平，顯著高于同期對(duì)照。

2．3．4 鹽脅迫下Os07g0620200基因的表達(dá)

圖2 Os07g0620200基因和內(nèi)參Os Actin的擴(kuò)增曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)

如圖3C、G所示，在高鹽（150mmol／L）處理下，雙桂1號(hào)和黃華占2個(gè)水稻品種中Os07g0620200基因的表達(dá)有明顯的差異。對(duì)于雙桂1號(hào)來(lái)說(shuō)，隨著鹽脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，該基因的表達(dá)量呈現(xiàn)先快速下降后緩慢上升的趨勢(shì)，但直至脅迫24h時(shí)，該基因的表達(dá)水平仍低于脅迫前水平。與對(duì)照相比，在0～12h期間與對(duì)照持平，脅迫24h明顯高于對(duì)照。黃華占在鹽脅迫下該基因的表達(dá)總體呈上升趨勢(shì)，在0～12h內(nèi)上升趨勢(shì)比較緩慢，24h則表現(xiàn)出鹽脅迫對(duì)黃華占中

Os07g0620200基因表達(dá)的明顯激活作用，其表達(dá)水平快速增加，幾乎達(dá)到了起始量的3倍多。與對(duì)照相比除脅迫12h明顯低于對(duì)照外，其余時(shí)間均明顯高于對(duì)照?；謴?fù)24h后，雙桂1號(hào)中該基因的表達(dá)水平恢復(fù)到脅迫起始量，黃華占則增加到更高的表達(dá)水平，兩者均高于同期對(duì)照。

2．3．5 精胺（Spm）對(duì)Os07g0620200基因表達(dá)的影響

由圖3D、H所示，在通過(guò)外源Spm噴施葉片后，雙桂1號(hào)中該基因的表達(dá)變化相對(duì)穩(wěn)定，在12h內(nèi)該基因表達(dá)量變化不大，但24h時(shí)與初始相比明顯下降；而黃華占變化較大，3h該基因表達(dá)量明顯低于起始表達(dá)量，6h高于起始值，12h達(dá)到最大表達(dá)量，是起始時(shí)的4倍左右，24h低于起始量，但仍高于雙桂1號(hào)此時(shí)的表達(dá)量。與對(duì)照相比，外源Spm處理增加雙桂1號(hào)中該基因的表達(dá)水平（24h與對(duì)照相當(dāng)除外），黃華占在0～3h變化不大，24h明顯低于對(duì)照，在6～12h期間明顯高于對(duì)照，且黃華占增加的幅度大于雙桂1號(hào)?；謴?fù)24h后雙桂1號(hào)與對(duì)照相當(dāng)，但明顯低于脅迫前起始量，而黃華占則明顯高于起始量及對(duì)照。

2．3．6 各處理間表達(dá)量的比較

對(duì)該基因在不同逆境處理下0～24h內(nèi)的表達(dá)量進(jìn)行方差分析結(jié)果（表1）表明，雙桂1號(hào)和黃華占2個(gè)品種各處理間Os07g0620200基因表達(dá)水平均極顯著高于對(duì)照，雙桂1號(hào)各處理間的表達(dá)高低依次為PEG處理＞高溫處理＞Spm處理＞NaCl處理＞對(duì)照。黃華占則為NaCl處理＞Spm處理＞高溫處理＞PEG處理＞對(duì)照。這表明PEG、高溫、Spm及NaCl等非生物脅迫，均誘導(dǎo)了Os07g0620200基因的表達(dá)，但不同脅迫處理下表達(dá)模式有所不同。2個(gè)品種比較，黃華占中Os07g0620200基因的表達(dá)量始終高于其在雙桂1號(hào)中的表達(dá)量，除PEG處理稍低外。

表1 不同逆境處理下2個(gè)水稻品種Os07g0620200基因表達(dá)的多重比較（Duncan檢測(cè)）

圖3 2個(gè)品種中Os07g0620200基因在不同處理下的表達(dá)分析

3 討 論

本研究中克隆前期篩選的Os07g0620200基因，發(fā)現(xiàn)它的編碼產(chǎn)物與水稻中的熱激蛋白DnaJ N端的結(jié)構(gòu)域同源。含有DnaJ結(jié)構(gòu)域的蛋白統(tǒng)稱(chēng)為DnaJ蛋白。DnaJ蛋白是熱激蛋白的一種輔助蛋白，激活HSP 70的ATPase而調(diào)控其活性，在逆境下能調(diào)控?zé)峒さ鞍椎男纬伞naJ結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞中具有多種功能，除了決定HSP 40和HSP 70相互作用的專(zhuān)一性，并使一種特定的HSP 40蛋白質(zhì)在HSP 70家族中挑選出對(duì)應(yīng)的分子外，還有新生蛋白的折疊、胞吞作用、多肽穿過(guò)細(xì)胞器質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)整對(duì)各種脅迫的反應(yīng)及對(duì)預(yù)降解蛋白的靶定等功能［8－9］。因此，推測(cè)本研究中克隆的差異基因Os07g06202004在水稻逆境中應(yīng)對(duì)各種脅迫有關(guān)。在許多生物中都有類(lèi)似DnaJ蛋白的存在，如擬南芥、水稻等［10－13］。在水稻中目前已報(bào)道有101個(gè)編碼DnaJ蛋白的基因，通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)本研究中的Os07g0620200基因不是其中之一，它的具體功能有待下一步研究。

在非生物逆境下，正常蛋白質(zhì)合成減少，而熱激蛋白的合成會(huì)增加。劉大麗等［14］報(bào)道了在鹽（NaCl、NaHCO3和 Na2CO3），PEG，高 pH 值（pH＝8．0和pH＝11．0）以及熱激（50℃）下，水稻根中的rHsp 90基因都受到了不同程度的誘導(dǎo)。陳新海等［15］報(bào)道了高溫脅迫下水稻葉片中的多種熱激蛋白的表達(dá)量上調(diào)。本研究中通過(guò)熒光定量分析PEG、高溫、Spm及NaCl等非生物脅迫下Os07g0620200基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)所有脅迫均誘導(dǎo)了該基因的表達(dá)（圖3）。這與前人的結(jié)論相似。表明該基因參與逆境脅迫。此外，在不同耐性水稻品種中，該基因的表達(dá)量存在明顯的差異。有研究表明，熱激蛋白在高溫脅迫下的不同耐性品種中出現(xiàn)表達(dá)差異，耐高溫水稻的表達(dá)量高于敏感型水稻的表達(dá)量。而且隨著高溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，耐高溫水稻的sHSP表達(dá)量未出現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)［15］。肖清鐵等［16］發(fā)現(xiàn)抗鎘水稻品種中熱激蛋白上調(diào)表達(dá)，鎘敏感水稻品種中熱激蛋白的表達(dá)無(wú)顯著差異。本研究結(jié)果表明，高溫、鹽脅迫、模擬干旱脅迫均增強(qiáng)了該基因的表達(dá)，還表明耐性品種Os02g0611200基因的表達(dá)量始終高于敏感品種，敏感品種響應(yīng)逆境的時(shí)間較早，后期表達(dá)量較低，恢復(fù)正常條件后，表達(dá)量低于或與初始值相當(dāng)，而耐性品種的表達(dá)量則均顯著高于初始值。即耐熱品種黃華占中熱激蛋白的大量合成可能是具有更強(qiáng)的抵抗逆境能力的原因之一。

多胺（腐胺、精胺、亞精胺）是一種重要生理活性物質(zhì)，它能調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。研究表明外源多胺可以增強(qiáng)植物對(duì)逆境的抗性，這在許多植物中已得到證實(shí)。如魏秋平等［17］發(fā)現(xiàn)，0．01mmol／L 精胺有緩解擬南芥鹽害的作用。古紅梅等［18］發(fā)現(xiàn)冷脅迫處理時(shí)外源1mmol／L亞精胺處理能明顯提高小麥幼苗的耐冷性。本研究發(fā)現(xiàn)0．1mmol／L精胺明顯提高了2個(gè)耐性不同水稻Os 02 g0611200基因的表達(dá)量，耐性品種表達(dá)量明顯高于敏感品種。表明外源多胺可以促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄水平。

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