金果欖組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究

李小泉，薛艷霞，韋紹龍

（1．廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所， 南寧530007； 2．廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院， 南寧530005）

金果欖（Tinospora capilliPes Gagnep．）別名地苦膽、山慈菇、九龍膽等，為防己科植物，分布于廣西、湖南等地。其干燥塊根為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥，具有清熱解毒、利咽、止痛之功效，常用于治療咽喉腫痛、癰疽疔毒、泄瀉、痢疾、脘腹熱痛等癥［1］。隨著對(duì)金果欖研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)金果欖還具有抗幽門(mén)螺桿菌［2］、抑菌［3］、降血糖［4］、抗腫瘤［5］、抗輻射［6］以及改善心腦血管疾?。?］作用，可用于治療胃潰瘍、糖尿病、癌癥和老年癡呆［8］等病癥。近年來(lái)，由于過(guò)度采挖，金果欖野生自然資源急劇減少，處于瀕危狀態(tài)。人工栽培是緩解金果欖的供需矛盾、拯救金果欖野生自然資源的有效措施，而種苗則是人工栽培所面臨的首要問(wèn)題。目前對(duì)金果欖的研究主要集中于化學(xué)成分、藥理以及資源調(diào)查等方面，種苗繁育方面鮮有報(bào)道。植物組織培養(yǎng)不僅具有繁殖系數(shù)高、育苗速度快等優(yōu)點(diǎn)，還能保持原植株的優(yōu)良性狀等特點(diǎn)。因此，開(kāi)展金果欖組織培養(yǎng)與快速繁殖技術(shù)研究，可為金果欖人工栽培提供大量?jī)?yōu)質(zhì)種苗。

1 材料與方法

1．1 材 料

金果欖莖節(jié)為外植體，莖節(jié)分為嫩莖節(jié)和老莖節(jié)，沒(méi)有木質(zhì)化的為嫩莖節(jié)，有木質(zhì)化的為稍老莖節(jié)；材料來(lái)源于廣西靖西縣，引種到廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所中草藥園圃。

1．2 方 法

1．2．1 材料預(yù)處理

在天氣晴朗的09：00～10：00時(shí)，剪取金果欖莖節(jié)，去掉葉片，留下0．5cm葉柄，將莖節(jié)剪成木質(zhì)化帶節(jié)間的莖段、幼嫩的帶節(jié)間莖段和頂芽約2cm長(zhǎng)的3種外植體，用洗衣粉水浸泡20min，自來(lái)水清洗10min，高錳酸鉀溶液浸泡8min，用濾紙吸干表面水分，備用。

1．2．2 外植體滅菌

在超凈工作臺(tái)上，外植體在75%乙醇浸泡20～30 s，無(wú)菌水清洗1次，然后用0．1%升汞（HgCl2）滅菌6～15min，無(wú)菌水清洗5次，放在無(wú)菌濾紙上吸去多余水分，備用。

1．2．3 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基：初代培養(yǎng)、增殖培養(yǎng)為 MS，生根培養(yǎng)為1／2MS，每升培養(yǎng)基中加入5g瓊脂、20g白糖，pH 值為5．8，在121℃、0．11kPa滅菌25min，冷卻后接入外植體。

在光照強(qiáng)度1 500～2 000μmol／（m2·s）、光照時(shí)間12h／d、溫度25℃左右的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。

1．2．4 初代誘導(dǎo)培養(yǎng)

將滅菌好的金果欖莖節(jié)切去兩端的舊傷口，接種于初代誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)基附加的激素以6－BA濃度為0．5，1．0，2．0，3．0mg／L分別與 NAA 0．2mg／L 組合的4個(gè)處理，每個(gè)處理接種40個(gè)外植體，培養(yǎng)30d，統(tǒng)計(jì)各處理的芽誘導(dǎo)率。

1．2．5 繼代增殖培養(yǎng)

在金果欖初代誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞分裂素6－BA與NAA使用時(shí)，金果欖節(jié)間單芽誘導(dǎo)率高，叢生芽少，擬在培養(yǎng)基中添加TDZ（噻二唑苯基脲），以期摸索到增殖系數(shù)較高的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑適宜添加量的培養(yǎng)基。將初代誘導(dǎo)得到的芽接入增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)。增殖培養(yǎng)基中植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合為：

1）TDZ 0．5mg／L＋NAA 0．2mg／L；

2）TDZ 1．0mg／L＋NAA 0．2mg／L；

3）TDZ 2．0mg／L＋NAA 0．2mg／L；

4）TDZ 0．5mg／L＋6－BA 0．5mg／L＋NAA 0．2 mg／L；

5）TDZ 0．5mg／L＋6－BA 1．0mg／L＋NAA 0．2 mg／L；

6）TDZ 1．0mg／L＋6－BA 0．5mg／L＋NAA0．2 mg／L；

7）TDZ 1．0mg／L＋6－BA 1．0mg／L＋NAA 0．2 mg／L。

各處理接入20個(gè)芽，每7天觀察1次，并做好記錄，40d時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理芽數(shù)，并計(jì)算出各處理增殖系數(shù)，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選出最佳增殖系數(shù)培養(yǎng)基。

1．2．6 生根培養(yǎng)

經(jīng)過(guò)多次生根培養(yǎng)基的篩選實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，金果欖的芽生根比較困難。因此，本研究采用液態(tài)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑處理和固態(tài)培養(yǎng)基結(jié)合的方法，誘導(dǎo)金果欖芽的生根。將生長(zhǎng)至3～5cm高的增殖芽切成單芽，基部放入滅過(guò)菌的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑溶液中處理10，20 min，接種于1／2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑溶液為IBA 50mg／L＋6－BA 10mg／L、IBA 100mg／L＋6－BA 10mg／L、NAA 50mg／L＋6－BA 10mg／L、NAA 100mg／L＋6－BA 10mg／L 4個(gè)處理，每處理接入15個(gè)芽，每7d觀察1次，50d時(shí)統(tǒng)計(jì)各處理生根情況，計(jì)算出各處理的根誘導(dǎo)率和根數(shù)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，篩選出較好的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的處理濃度和時(shí)間。

1．2．7 數(shù)值計(jì)算

芽誘導(dǎo)率（%）＝誘導(dǎo)出芽的外植體數(shù)／外植體總數(shù)×100%。

增殖系數(shù)＝總芽數(shù)／接入芽數(shù)。根誘導(dǎo)率（%）＝誘導(dǎo)出根的芽數(shù)／接入總芽數(shù)×100%。

1．2．8 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)處理3次重復(fù)，應(yīng)用SPSS 17．0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2．1 最佳外植體篩選和滅菌時(shí)間的確定

將金果欖莖節(jié)分為芽、嫩莖節(jié)、稍有木質(zhì)化的老莖節(jié)3種外植體，3種外植體分別在0．1%升汞中滅菌6，8，10，12min，滅菌后接種于 MS培養(yǎng)基中，20d時(shí)統(tǒng)計(jì)外植體的污染率、死亡率、出芽率等指標(biāo)，從而獲得不同外植體的最佳滅菌時(shí)間。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，金果欖芽和嫩枝的最佳滅菌時(shí)間為8min，芽的污染率為8．7%、死亡率為12．1%、出芽率為50．3%，嫩枝的污染率為5．7%、死亡率為4．3%、出芽率為72．0%；老莖節(jié)的最佳滅菌時(shí)間為10min，污染率為25．3%、死亡率為0%、出芽率為96．2%。由此可見(jiàn)，老枝的出芽率最高，且芽比較壯，但污染率也比較高，而且在隨后的培養(yǎng)中，老枝上的芽不斷有細(xì)菌污染出現(xiàn)。為了充分利用好老莖節(jié)資源，對(duì)老莖節(jié)的滅菌方案再做調(diào)整，在超凈臺(tái)上，用75%乙醇滅菌30s后，用15%次氯酸鈉滅菌20min，無(wú)菌水清洗3次，再用0．1%升汞滅菌10min，無(wú)菌水清洗5次，接入MS培養(yǎng)基中，污染率降為6．7%、死亡率為3．3%、出芽率為93．5%，得到的芽在隨后的培養(yǎng)中成活率高，且污染率大大降低。因此，金果欖老莖節(jié)選為最佳的外植體，滅菌處理為15%次氯酸鈉滅菌20min，無(wú)菌水清洗1次，再用0．1%升汞滅菌10min，無(wú)菌水清洗5次。

2．2 6－BA與NAA對(duì)金果欖外植體誘導(dǎo)的影響

金果欖帶節(jié)間的莖段在附加不同濃度6－BA與NAA 0．2mg／L組合培養(yǎng)基上培養(yǎng)10d，金果欖莖段的節(jié)間膨大成芽點(diǎn)，15d開(kāi)始萌發(fā)出芽，培養(yǎng)30d時(shí)，芽長(zhǎng)為1～3cm，各處理的誘導(dǎo)率和芽長(zhǎng)勢(shì)見(jiàn)表1。

從表1可看出，6－BA 濃度在0～2．0mg／L范圍內(nèi)，金果欖帶節(jié)間的莖段誘導(dǎo)率隨著6－BA濃度增加而提高，誘導(dǎo)率高達(dá)90．8%；當(dāng)6－BA濃度增加到3．0 mg／L時(shí)，誘導(dǎo)率下降為72．5%，說(shuō)明6－BA濃度太高不利于金果欖腋芽萌發(fā)。經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，各培養(yǎng)基間的誘導(dǎo)率差異顯著，誘導(dǎo)率最高的為3號(hào)培養(yǎng)基，芽的長(zhǎng)勢(shì)好。因此，金果欖初代誘導(dǎo)較好的培養(yǎng)基為MS＋6－BA 2．0mg／L＋NAA 0．2mg／L。

表1 不同培養(yǎng)基對(duì)金果欖初代芽誘導(dǎo)的影響

2．3 不同濃度植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)金果欖芽增殖的影響

初代誘導(dǎo)得到的芽接種于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，7d節(jié)間誘導(dǎo)出芽點(diǎn)，15d左右在芽點(diǎn)處陸續(xù)長(zhǎng)出新芽，40d時(shí)記錄芽數(shù)，并計(jì)算出增殖系數(shù)（見(jiàn)表2）。

由表2可看出，TDZ與6－BA組合使用對(duì)金果欖的叢生芽誘導(dǎo)和芽的長(zhǎng)勢(shì)均有促進(jìn)作用，雖然（7）號(hào)培養(yǎng)基的增殖系數(shù)稍高于（6）號(hào)，但經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析，2種培養(yǎng)基的增殖系數(shù)差異不顯著。因此，金果欖增殖培養(yǎng)較好的培養(yǎng)基為（6）MS＋TDZ 1．0mg／L＋6－BA 0．5mg／L＋NAA 0．2mg／L。

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)金果欖增殖培養(yǎng)的影響

表3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑溶液對(duì)金果欖生根的影響

2．4 IBA、NAA 對(duì)金果欖芽生根的影響

金果欖芽基部在滅過(guò)菌的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑中處理相應(yīng)時(shí)間后，接種于1／2MS培養(yǎng)基中培養(yǎng)，10d左右芽的基部膨大，形成愈傷組織，20d左右從愈傷組織處長(zhǎng)出根，50d統(tǒng)計(jì)根誘導(dǎo)率和每個(gè)芽誘導(dǎo)出的根條數(shù)（見(jiàn)表3）。

由表3可以看出，高濃度生長(zhǎng)素處理金果欖芽的基部可以有效誘導(dǎo)出根。相同濃度下，IBA的根誘導(dǎo)率和誘導(dǎo)出的根條數(shù)均比NAA的要高，而且NAA處理過(guò)的芽的基部愈傷組織特別多，但能長(zhǎng)根的不多。在對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，IBA 100mg／L＋6－BA 10mg／L處理的根誘導(dǎo)率和每株苗的根條數(shù)均與其它處理差異大顯著水平。因此，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑溶液為IBA 100mg／L＋6－BA 10mg／L處理10min時(shí)生根效果最好。根誘導(dǎo)率達(dá)80%，每株苗根條數(shù)為3．7條。

3 結(jié) 論

在金果欖最佳外植體篩選過(guò)程中，老莖節(jié)上誘導(dǎo)出來(lái)的芽壯，這可能與老莖節(jié)上積累的營(yíng)養(yǎng)比較豐富以及腋芽的芽原基發(fā)育比較好有關(guān)。

在金果欖組織培養(yǎng)過(guò)程中，存在生根難的問(wèn)題。而在扦插繁殖過(guò)程中，同樣存在插條生根影響成活率的問(wèn)題。為了使插穗盡早生根，通常會(huì)采用一些方法進(jìn)行催根。植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑可通過(guò)調(diào)節(jié)扦插苗的生理機(jī)能從植物內(nèi)部起作用［9］，適合的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)生根具有顯著促進(jìn)作用，常用的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為NAA和IBA［10－11］。因此，本研究應(yīng)用生長(zhǎng)素 NAA、IBA 分別與6－BA組合使用，開(kāi)展金果欖芽激素處理和固態(tài)培養(yǎng)基上生根的研究。結(jié)果表明，利用高濃度的生長(zhǎng)素溶液處理一定的時(shí)間對(duì)金果欖芽的生根具有促進(jìn)作用，其中IBA 100mg／L與6－BA 10mg／L組合處理10 min時(shí)生根效果最好。由于在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程為無(wú)菌狀態(tài)，從而避免了插穗因傷口感染微生物而腐爛等問(wèn)題，由于在固態(tài)培養(yǎng)基中碳源豐富，從而提高了芽的生根率和生根數(shù)。該操作簡(jiǎn)單易行，為生根難的植物建立組培快繁技術(shù)體系提供了技術(shù)參考。

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