色季拉山8個杜鵑花野生種親緣關(guān)系的ISSR分析

徐靜靜，張良英，趙 冰，鄭茜子， 申惠翡， 袁柳祥

（1．西北農(nóng)林科技大學風景園林藝術(shù)學院， 陜西 楊凌712100；2．西藏大學農(nóng)牧學院， 西藏 林芝860000）

杜鵑花（Rhododendron）作為“十大名花”之一，分布廣泛且栽培歷史悠久。世界約有960種杜鵑花，我國約有550種［1］，杜鵑花與報春（Primula）和龍膽（Oentiana）被稱為世界三大高山野生花卉［2］，在我國西藏有廣泛的分布，《西藏植物志》中詳細記載了170多種杜鵑花［3］。目前對西藏杜鵑花的研究主要集中于其群落分布以及從形態(tài)學角度分析種質(zhì)資源問題［4－5］。

西藏色季拉山屬濕潤山地暖溫帶、半濕潤山地溫帶氣候，含有約25種杜鵑花種與變種［5］，資源豐富，對杜鵑花種質(zhì)資源的研究有著重要的意義。利用ISSR分子標記對杜鵑花的研究已經(jīng)有許多［6］，東北地區(qū)、云南以及陜西秦嶺一帶的杜鵑花資源都曾有學者研究［7－8］，但西藏杜鵑花資源的分子標記卻未見報道。本研究利用ISSR分子標記技術(shù)對色季拉山8個杜鵑花野生種的親緣關(guān)系進行研究，以期為色季拉山野生杜鵑花資源的開發(fā)利用和育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1．1 采 樣

本實驗所用材料采集于色季拉山（表1），按種群采樣法采集樣本，每種采集20個樣本，放入硅膠干燥帶回，－70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 8種杜鵑花的名稱和采集地分布

圖1 8個杜鵑花野生種間花部形態(tài)差異

1．2 總DNA的提取

采用CTAB法對硅膠干燥的葉片提取總基因組DNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，并用紫外分光光度計（Bio－RAD SmartpecMT 3000）檢測DNA濃度。最后用雙蒸水將DNA稀釋到50ng／μL，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1．3 引物篩選與PCR擴增

本實驗所用引物參照加拿大哥倫比亞大學UBC公司公布的ISSR引物序列，由沃爾森生物工程技術(shù)服務有限公司合成。用每個種的DNA樣本在25μL反應體系中對所選的49條引物進行篩選，最后選出8條擴增條帶清晰、重復性好的引物，使用者對8條引物（UBC 811、UBC 819、UBC 826、UBC 834、UBC 835、UBC 841、UBC 842、UBC 856）所有樣本進行 PCR擴增，得到擴增產(chǎn)物。

PCR擴增反應在北京君意公司生產(chǎn)的PCR儀上進行，反應體系采用25μL的Mix反應體系：1μL引物、1μL 模 板 DNA、12．5μL Taq mix、10．5μL ddH2O。擴增反應程序為94℃預變性5min；94℃變性45s，53℃退火45s，72℃延伸90s，45個循環(huán)；72℃延伸8min，4℃保存。

對擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳，使用Gene Genius公司的Bio Imaging System凝膠成像系統(tǒng)拍照，并記錄數(shù)據(jù)。

1．4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)相同分子量DNA片段電泳遷移相同統(tǒng)計電泳結(jié)果，使用“0，1”數(shù)據(jù)記錄，有DNA擴增條帶記為1，無條帶記為0，形成0／1矩陣。利用POPGENE軟件進行相似性系數(shù)的分析，多態(tài)位點百分率（PPL）、有效等位基因（Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（h）、Shannon信息指數(shù)（Ⅰ）。然后利用 NTSYSpc 2．1軟件使用非加權(quán)算數(shù)平均法（UPGMA）對種群進行聚類分析，獲得種群間親緣關(guān)系樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2．1 引物篩選與ISSR擴增片段

本實驗的ISSR標記技術(shù)使用的是通用型引物，不同的引物對不同的物種擴增條帶差異明顯，若想獲得條帶多態(tài)性和穩(wěn)定性都比較好的引物，則需要對不同的引物進行篩選。實驗所提供的材料均為野生種，因此在引物篩選時需要使用這8個野生種的樣本DNA對所選引物進行篩選，以獲得能同時擴增該8個種且所得條帶清晰明亮、多態(tài)性高、穩(wěn)定性強的引物。本實驗選取了UBC的49條引物，使用這49條引物對8個野生種的DNA進行擴增，分析得出，8個引物（表2）可對8個野生種擴增出條帶清晰明亮、多態(tài)性高且穩(wěn)定性強的條帶。

利用這8個引物分別對8個種的樣本DNA進行擴增，共獲得343條帶，其中多態(tài)性條帶335條；每個引物可擴增出14～16位點，總共獲得124個位點，其多態(tài)性位點123個，多態(tài)位點百分率為99．19%；擴增片段為250～2 000bp，得出了帶型豐富的電泳圖譜（圖2）。

表2 對8個野生種樣本進行擴增的ISSR引物

圖2 引物UBC 856對8種杜鵑花種質(zhì)資源的ISSR擴增電泳圖

2．2 聚類分析

利用POPGENE 32對數(shù)據(jù)進行分析和計算，計算了有效等位基因數(shù)、多態(tài)位點百分率、Nei’s遺傳距離、Shannon信息指數(shù)，據(jù)此分析了8個種間的親緣關(guān)系。數(shù)據(jù)表明，8個種間的遺傳距離為0．377 6～0．709 4，遺傳相似性系數(shù)為0．491 9～0．685 5，雪層杜鵑與鱗腺杜鵑間的遺傳距離最大，黃毛海綿杜鵑與硬毛杜鵑間的遺傳距離最小。

利用NTSYSpc 2．1軟件根據(jù)8個種之間的遺傳相似性系數(shù)對這8個種進行UPGMA聚類分析，構(gòu)建聚類樹形圖（圖3）?？煽闯?，在相似性系數(shù)約0．55處，8種杜鵑花被明顯地聚成兩類。第一類群中包含雪層杜鵑和柳條杜鵑；第二類群包含其余6種杜鵑花（硬毛杜鵑、黃毛海綿杜鵑、光蕊杜鵑、黃杯杜鵑、鱗腺杜鵑、白背紫斑杜鵑）被聚到了一個類群，其中硬毛杜鵑和黃毛海綿杜鵑的遺傳相似性系數(shù)最大，約為0．69。

3 結(jié)論與討論

ISSR分子標記技術(shù)具有操作簡單、成本低、重復性高的優(yōu)點，近年來被廣泛用于品種鑒定分類［9］、品種起源［10］、親緣關(guān)系的研究［11］和對瀕危物種的遺傳多樣性分析［12］。本實驗中使用篩選所得的8個引物對8個杜鵑花野生種進行擴增，共得到343條清晰條帶，其中多態(tài)性條帶335條，多態(tài)性條帶比率為97．67%。圖譜數(shù)據(jù)經(jīng)分析所得的遺傳距離為0．377 6～0．709 4，有效等位基因百分率為99．19%。所得數(shù)據(jù)表明，實驗所用的8個野生資源可以利用ISSR標記技術(shù)對其親緣關(guān)系進行分析。

表3 8種杜鵑花的遺傳距離（對角線下）和遺傳相似性系數(shù)（對角線上）

圖3 8個杜鵑花野生種的遺傳相似性系數(shù)聚類分析圖

使用POPGENE軟件分析數(shù)據(jù)所得的8個種的遺傳距離為0．377 6～0．709 4；平均 Nei’s基因多樣性指數(shù)為0．376 8，平均Shannon信息指數(shù)為0．557 6，這些數(shù)據(jù)表明，在這8個種群間有著明顯的遺傳差異。8個種間遺傳相似性系數(shù)為0．491 9～0．685 5，在聚類分析中可以被聚到一起，且有明顯分組。聚類分析結(jié)果表明，在這8個野生種間存在著遺傳差異，并且有相同的遺傳背景。

利用 NYSYSpc 2．1根據(jù) Nei’s遺傳相似性系數(shù)對8個杜鵑花野生種進行聚類分析，結(jié)果表明，在遺傳相似性系數(shù)約為0．55處，8個野生種明顯地被分為了兩類?！吨袊参镏尽?、《西藏植物志》中將該8種杜鵑分為三大類，杜鵑亞屬（雪層杜鵑、鱗腺杜鵑）、常綠杜鵑亞屬（黃杯杜鵑、硬毛杜鵑、光蕊杜鵑、黃毛海綿杜鵑、白背紫斑杜鵑）、糙葉杜鵑亞屬（柳條杜鵑）［13－15］，由聚類結(jié)果（圖3）可看出，8種杜鵑花野生種的遺傳相似性聚類與其形態(tài)分類不相符。雪層杜鵑和柳條杜鵑聚為一類，表明它們有相同的遺傳背景，然而遺傳相似性較低，在形態(tài)學分類上差異較大。白背紫斑杜鵑形態(tài)上被分為常綠杜鵑亞屬，且屬于常綠杜鵑組下的大理杜鵑亞組，與黃毛海綿杜鵑同處于同一亞組，在遺傳相似性系數(shù)聚類分析中與黃毛海綿有著相同的遺傳背景。由此可見，形態(tài)學分析可作為親緣關(guān)系研究的輔助手段。

本研究利用ISSR標記技術(shù)初步分析了西藏色季拉山8種杜鵑花資源的親緣關(guān)系，聚類分析結(jié)果未能和形態(tài)學分類相一致，這為進一步研究西藏杜鵑屬植物分類提供分子水平的理論依據(jù)，為育種以及雜交組合提供理論依據(jù)，同時也為其種質(zhì)資源保護利用提供理論基礎(chǔ)。

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