7個(gè)草菇菌株的遺傳多樣性與生物學(xué)特性研究

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(1.廣東省微生物研究所；省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510070；2.廣東粵微食用菌技術(shù)有限公司， 廣州 510070)

據(jù)文獻(xiàn)記載，草菇栽培始于我國(guó)[1]。數(shù)十年的栽培技術(shù)與育種技術(shù)的發(fā)展，使得我國(guó)草菇品種眾多，種源復(fù)雜。據(jù)全國(guó)食用菌品種認(rèn)定委員會(huì)公告，經(jīng)國(guó)家級(jí)認(rèn)定的草菇品種至今尚只有1個(gè)(川草53)?？梢?jiàn)現(xiàn)時(shí)國(guó)內(nèi)流通的眾多草菇品名尚處于未登記或未審核狀態(tài)，菌種質(zhì)量尚缺乏官方認(rèn)證。要對(duì)各種草菇菌種進(jìn)行準(zhǔn)確的認(rèn)證，首先要獲得申請(qǐng)者所提供菌株的遺傳多樣性信息及生物學(xué)特性。

分子標(biāo)記在食用菌栽培種或菌株之間的遺傳多樣性研究中得到廣泛應(yīng)用，但往往不同種類的分子標(biāo)記對(duì)近緣菌株或栽培品種之間的差異有不同體現(xiàn)。例如22個(gè)商用白色雙孢蘑菌株中，利用RAPD分析能直接展現(xiàn)出較好的多態(tài)性，而利用ITS分析則需要發(fā)掘各菌株序列的SNP才能體現(xiàn)較好的多態(tài)性[2]。在毛木耳和黑木耳研究中，應(yīng)用ERIC-PCR能分辨出二者，但應(yīng)用RAPD則不行[3]。在真姬菇的商業(yè)用和保藏菌株的研究中，基于ISSR的聚類和基于菌株本身農(nóng)藝性狀分類未能較好契合[4]。但某些生物學(xué)特性是能和分子標(biāo)記的分類相契合的，例如在蟲(chóng)草無(wú)性分離物的研究中，其ERIC-PCR分析結(jié)果與各分離物體細(xì)胞不親和性試驗(yàn)的結(jié)果具有較高的一致性[5]。結(jié)合不同的分子標(biāo)記進(jìn)行分析，可能會(huì)得到更精準(zhǔn)的近緣分類結(jié)果。例如在20株榆黃蘑分別應(yīng)用ISSR和SRAP時(shí)都展現(xiàn)較好的出多態(tài)性，但是結(jié)合兩者后進(jìn)行的聚類結(jié)果與菌株子實(shí)體形態(tài)分類及拮抗反應(yīng)結(jié)果有更高的一致性[6]。

分子標(biāo)記的多樣性以及組合使用的多樣性必然使遺傳多樣性信息更加豐富和復(fù)雜。目前我國(guó)公認(rèn)有效的遺傳多樣性分析技術(shù)，部分被列為標(biāo)準(zhǔn)，如現(xiàn)行的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)“草菇菌種”(GB/T 23599—2009)中提及的ITS比對(duì)技術(shù)，“食用菌菌種真實(shí)性鑒定 酯酶同工酶電泳法”(NY/T 1097-2006)和“食用菌菌種區(qū)別性鑒定 拮抗反應(yīng)”(NY/T 1845-2010)等。這些分類鑒定方法在區(qū)分屬之間的菌株或品種時(shí)，有較好的分辨力。而在不同品種或不同菌株草菇之間，則尚未見(jiàn)到綜合運(yùn)用這些遺傳多樣性的研究方法進(jìn)行分類。

在草菇的生物學(xué)特性和雜交育種研究中，同工酶分析、RAPD和SRAP分析都能較好地體現(xiàn)出菌株間[7]、親子之間的差異性[8-9]。本研究從生理、蛋白質(zhì)和基因3個(gè)水平上對(duì)7個(gè)館藏草菇菌株進(jìn)行了遺傳多樣性和生物學(xué)特性研究，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行比較分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本單位館藏草菇菌株，分別記為V 1、V 2、V 3、……V 7，共7個(gè)菌株。

1.2 草菇菌絲形態(tài)觀察

取各個(gè)菌株分別接種在平板培養(yǎng)基上，(32±1)℃下避光培養(yǎng)4 d后觀察。

1.3 草菇菌絲體的掃描電鏡觀察

按1.2方法培養(yǎng)草菇菌絲體，培養(yǎng)天數(shù)為2～3 d，以靠近菌絲體邊緣5 mm左右長(zhǎng)度的環(huán)帶區(qū)域?yàn)槿〔奈恢?。取出的帶瓊脂的菌絲體塊經(jīng)脫水、叔丁醇置換、冷凍干燥、貼臺(tái)、濺射Au后，使用掃描電鏡(日立H-3000 N)進(jìn)行觀察并拍照。

1.4 草菇菌絲體拮抗試驗(yàn)

按三角形接種法把7個(gè)菌株的接種塊按排列組合方式接種于平板培養(yǎng)基，在(32±1)℃下避光培養(yǎng)后觀察是否存在拮抗現(xiàn)象。

1.5 草菇菌絲體蛋白提取

取液體培養(yǎng)基(改良馬丁培養(yǎng)基)中培養(yǎng)6 d的新鮮草菇菌絲體，洗凈吸干水分放入研缽中，液氮凍結(jié)，研磨成粉，加入適量含1%蛋白酶抑制劑混合物(生工，PL 026)的0.2 M磷酸鈉緩沖液(pH=6.5)冰浴研磨至勻漿，4 ℃離心后所得上清液為草菇菌絲體蛋白提取液。

1.6 草菇菌絲體酯酶同工酶電泳分析

取1.5中得到的草菇菌絲體蛋白提取液為樣品，參考標(biāo)準(zhǔn)“食用菌菌種真實(shí)性鑒定酯酶同工酶電泳法”(NY/T 1097-2006)，稍作修正，進(jìn)行電泳。凝膠顯色后以凝膠成像系統(tǒng)拍照(英國(guó)UVItec)。使用軟件UVIband識(shí)別并測(cè)量各條帶的相對(duì)遷移率(Rf)，列表紀(jì)錄。泳道中各個(gè)遷移率位置上條帶出現(xiàn)記為1，無(wú)則記為0。所得數(shù)據(jù)矩陣輸入NTSYSpc(2.10 e)，采用UPGMA法作樹(shù)狀聚類圖。

1.7 草菇菌絲體基因組的ERIC-PCR試驗(yàn)

按1.5中描述取得新鮮菌絲體，60 ℃干燥。按Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒(生工生物，SK 8259)指示的步驟進(jìn)行總DNA提取。所得DNA溶液作為PCR擴(kuò)增模板。參照黃龍花等[10]的方法，以從華大購(gòu)置的Oligo序列ERIC 2(5′-ATGTAAGCTCCTGGGGATTCAC-3)和ERICR(5′-AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG-3′)為引物，并采用Dream Taq Green PCR Master Mix混合液及其建議體系進(jìn)行溫度梯度PCR，篩選最佳退火溫度，以最佳退火溫度的反應(yīng)體系對(duì)7個(gè)菌株模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，比較觀察電泳后的產(chǎn)物條帶。使用軟件UVIband測(cè)量各條帶的堿基對(duì)數(shù)，參照1.6對(duì)各菌株進(jìn)行聚類分析。

1.8 草菇栽培

參照菌種國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 23599—2009)相關(guān)條目制成草菇原種，取生長(zhǎng)12 d原種下種。播種方式為混播，接種量為1包原種接入2筐栽培筐中。草菇栽培料為95%廢棉、5%生石灰。栽培料堆制好后采用透氣栽培筐栽培，每筐裝入量控制在干料2.1 kg左右。栽培參數(shù)設(shè)置按廖世煌等[11]的方法加以調(diào)整進(jìn)行。采菇時(shí)按每筐單獨(dú)統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落外觀特征與菌絲體掃描電鏡觀察

7個(gè)草菇菌株接種平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)相同時(shí)間后，各菌株菌落呈現(xiàn)不同形態(tài)。從菌落類型劃分，V 1和V 4基本呈匍匐型菌絲，其他則主要為氣生型；從菌絲生長(zhǎng)速度上看，V 4最慢，至結(jié)束培養(yǎng)時(shí)仍有大量空間未見(jiàn)菌絲覆蓋。V 3和V 5稍慢，至結(jié)束培養(yǎng)時(shí)仍未長(zhǎng)滿培養(yǎng)基表面，其余菌株菌絲體均長(zhǎng)滿培養(yǎng)基。從菌絲形態(tài)來(lái)看，V 2和V 3菌絲整體濃密，呈短絨毛狀。V 5、V 6和V 7粗壯菌絲明顯，菌絲呈長(zhǎng)絲狀，其中V 5菌絲稀疏，V 6和V 7菌絲體較濃密。另外，V 1和V 2還呈現(xiàn)出明顯的環(huán)狀稀疏相間區(qū)域。

利用掃描電鏡，在不同的放大倍數(shù)下觀察了7個(gè)草菇菌株近菌落邊緣區(qū)域部分的菌絲形態(tài)。視野內(nèi)各個(gè)草菇菌株菌絲呈相互層疊、穿插或纏繞。各草菇菌株在50μm標(biāo)尺視野(上排圖片)內(nèi)可見(jiàn)粗細(xì)不一的、有分支的菌絲。在10μm標(biāo)尺視野(下排圖片)內(nèi)可見(jiàn)各菌株草菇菌絲頂端呈棒槌狀隆起或鈍圓狀。

(白色標(biāo)尺分別為上排50 μm，下排10 μm)。圖1 從菌落外觀特征對(duì)7個(gè)草菇菌株菌落進(jìn)行分類，并圖示各菌株菌絲體的掃描電鏡照片

2.2 拮抗反應(yīng)

拮抗反應(yīng)結(jié)果顯示，V 1、V 4分別和其他6個(gè)菌株產(chǎn)生拮抗反應(yīng)；V 2除了分別和V 6、V 7產(chǎn)生不明顯的拮抗反應(yīng)外(菌絲接觸區(qū)域靠近V 2一邊的形成較致密的菌絲環(huán)帶)，和其他4個(gè)菌株產(chǎn)生明顯拮抗反應(yīng)；V 3除了分別和V 6、V 7產(chǎn)生不明顯的拮抗反應(yīng)外(靠近V 3一端的菌絲較為濃密、靠近V 6、V 7一端較稀疏)，和其他4個(gè)菌株產(chǎn)生明顯拮抗反應(yīng)；V 5分別和V 6、V 7無(wú)拮抗反應(yīng)，和其他4個(gè)菌株產(chǎn)生拮抗反應(yīng)；V 6和V 1、V 4產(chǎn)生拮抗反應(yīng)，與V 2、V 3產(chǎn)生不明顯拮抗反應(yīng)，與V 7無(wú)拮抗反應(yīng)；V 7情況與V 6相同。綜上，除V 6和V 7兩者無(wú)法區(qū)分外，其他5個(gè)菌株可以通過(guò)拮抗反應(yīng)試驗(yàn)相互區(qū)分。

表1 7個(gè)草菇菌株菌絲體的兩兩拮抗反應(yīng)結(jié)果判定

V1V2V3V4V5V6V7V1++++++V2+++NNV3++NNV4+++V5--V6-V7

注：“+”表示有拮抗反應(yīng)，“-”表示無(wú)拮抗反應(yīng)，“N”表示拮抗反應(yīng)不明顯。

2.3 菌絲體酯酶同工酶酶譜分析

7個(gè)草菇菌種的酯酶同工酶電泳圖譜經(jīng)軟件進(jìn)行條帶分析后顯示，酶條帶出現(xiàn)在Rf值0.08～0.70之間。7個(gè)草菇菌種中共出現(xiàn)10條不同Rf值的酶帶，其中9條為多態(tài)性酶帶，多態(tài)性位點(diǎn)百分比為90%。其中Rf=0.08酶帶只在V 5中出現(xiàn)、Rf=0.18酶帶只在V 3中出現(xiàn)，而Rf=0.57酶帶只在V 5中缺失。

圖2 A：7個(gè)草菇菌株菌絲體酯酶同工酶酶譜；B：7個(gè)草菇菌株基于同工酶酶譜的聚類樹(shù)狀圖

表2 7個(gè)草菇菌株的生物學(xué)特性與遺傳多樣性比較

區(qū)分類數(shù)ⅠⅡⅢⅣⅤⅥⅦ菌絲體菌落外觀aV1V2V3V4V5V6，V7—菌絲掃描電鏡觀察———————拮抗試驗(yàn)bV1V2V3V4V5V6，V7—酯酶同工酶譜分析?V1(0．92)V2，V7(1．00)V3(0．44)V4(0．69)V5(0．49)V6(0．92)—ERIC?PCR分析?V1(0．94)V2(0．89)V3(0．96)V4(0．87)V5(0．84)V6(0．84)V7(0．96)農(nóng)藝性狀cV1，V4，V5V2V3V6V7——

注：a分類依據(jù)見(jiàn)圖1；b分類依據(jù)表1；c分類依據(jù)見(jiàn)圖4；*括號(hào)給出該菌株在聚類分析中最近1個(gè)分枝點(diǎn)的相似性系數(shù)值。

注：泳道1～7分別是V 1～V 7，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)物。圖3 上圖：2個(gè)適宜的退火溫度下7個(gè)草菇菌株的ERIC-PCR產(chǎn)物圖譜；下圖：基于2個(gè)ERIC-PCR產(chǎn)物圖譜多態(tài)性的菌株聚類樹(shù)狀圖

圖4 從栽培特性對(duì)7個(gè)草菇菌株進(jìn)行分類

根據(jù)同工酶圖譜帶型進(jìn)行UPGMA法構(gòu)建的聚類分析，7個(gè)草菇菌株同工酶帶型的相似性系數(shù)在0.44～1.00之間。V 2和V 7最為相似，V 1和V 6較為相似，相似系數(shù)為0.92。V 4和前面四者在相似系數(shù)為0.69時(shí)歸為一類，而V 5和V 3和其他菌株差異較大，在相似系數(shù)小于0.50時(shí)才被歸為一類。

2.4 ERIC-PCR分析

結(jié)合2種退火溫度下擴(kuò)增的分子標(biāo)記圖譜，經(jīng)軟件識(shí)別，擴(kuò)增得到不同分子量DNA片段條帶一共14條，其中9條顯示出多態(tài)性，多態(tài)性位點(diǎn)百分比為64%。其中V 3具有1條特異性條帶(893 bp，退火溫度47.1 ℃圖譜)，V 2缺失了其他菌株共有的2條條帶(1.7 kb和1.4 kb，退火溫度47.1 ℃圖譜)，V 4缺失了其他菌株共有的1條條帶(171 bp，退火溫度47.1 ℃圖譜)，V 5缺失了其他菌株共有的1條條帶(1.7 kb，退火溫度53.7 ℃圖譜)。

根據(jù)2種退火溫度下擴(kuò)增的分子標(biāo)記圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果顯示7個(gè)菌株的相似系數(shù)范圍在0.80～0.96之間。7個(gè)菌株在相似系數(shù)為0.80時(shí)分為2簇，其中1簇在相似系數(shù)為0.84時(shí)分為2支，分別是V 4和V 6。另外一簇也在相似系數(shù)為0.84時(shí)分為1支和1簇，包含V 1、V 2、V 3、V 5和V 7，其中V 5單獨(dú)為1支；在相似系數(shù)為0.89時(shí)，V 2再單獨(dú)分為1支；在相似系數(shù)為0.94時(shí)，V 1再單獨(dú)分為1支；V 3與V 7最為相似。

2.5 不同草菇菌株的栽培狀況比較

在相同的栽培條件下，7個(gè)草菇菌株中僅V 6和V 7能產(chǎn)生子實(shí)體，而且V 6和V 7所得產(chǎn)量差異顯著(μ=0.05，LSD)。V 1、V 4和V 5無(wú)原基產(chǎn)生；V 2雖然有原基產(chǎn)生，但原基產(chǎn)生時(shí)間比V 6和V 7要遲，且原基沒(méi)有發(fā)育成子實(shí)體；V 3在原種制作過(guò)程中生長(zhǎng)十分緩慢，至其他菌株栽培結(jié)束時(shí)仍未長(zhǎng)滿菌種袋。

3 討 論

所采用的7個(gè)草菇菌株通過(guò)多種分子標(biāo)記的分析，體現(xiàn)出遺傳多樣性，而在生物學(xué)特性上，如菌落形態(tài)、拮抗性、栽培特性上也表現(xiàn)出差異之處。

7個(gè)受試菌株菌絲體，從菌絲菌落形態(tài)、菌絲濃密分布，菌絲長(zhǎng)速等特征，憑肉眼幾乎可逐一分辨。一般經(jīng)驗(yàn)而言，匍匐性菌絲的草菇菌株不育。本實(shí)驗(yàn)中，V 1和V 4屬于匍匐型菌株，在栽培試驗(yàn)中也未能產(chǎn)生原基(見(jiàn)圖1和圖4)，符合這一判斷，但氣生型的菌株未必可育(如V 5)，甚至不能完成原種的生長(zhǎng)(如V 3)。有文獻(xiàn)報(bào)道，草菇雙核體菌絲的菌落形態(tài)與結(jié)實(shí)與否未見(jiàn)有直接關(guān)系[12]。另外，草菇菌絲體的生長(zhǎng)速度與產(chǎn)量也沒(méi)有嚴(yán)格的正相關(guān)[13-14]。以上結(jié)果在本研究中也有所體現(xiàn)。

黃敏敏等[15]通過(guò)掃描電鏡觀察了不同pH對(duì)金福菇菌絲粗細(xì)、鎖狀聯(lián)合數(shù)量等的影響，以判斷同一菌株菌絲體在不同培養(yǎng)環(huán)境下的變化。本研究嘗試從菌絲微觀結(jié)構(gòu)角度來(lái)展現(xiàn)菌株間差異，顯微視野中大部分菌絲的粗細(xì)與形狀并無(wú)突出的差異，無(wú)法從中獲取分辨7個(gè)菌株的可靠依據(jù)。

7個(gè)草菇菌株兩兩進(jìn)行了拮抗試驗(yàn)，但有部分拮抗反應(yīng)不太明顯。影響草菇菌株間拮抗反應(yīng)清晰度的原因很多，鄭玲[16]的碩士學(xué)位論文中提及草菇菌齡、退化等因素會(huì)影響拮抗反應(yīng)，而筆者認(rèn)為，草菇氣生菌絲旺盛，也可能是影響拮抗反應(yīng)觀察的原因之一。

同工酶圖譜和ERIC-PCR圖譜的聚類分析依據(jù)是泳道中條帶的有無(wú)，因此對(duì)條帶出現(xiàn)與否的判定很重要。本研究采用了具有條帶識(shí)別功能的軟件對(duì)所有參與聚類分析的圖譜進(jìn)行條帶識(shí)別，人工判斷為輔助，力求使每個(gè)泳道中條帶存在與否的判定依據(jù)相一致。還采用了軟件SPSS對(duì)上述3類標(biāo)記的圖譜進(jìn)行聚類分析(文中未顯示)，但由于NTSYS在聚類過(guò)程的設(shè)置參數(shù)更符合由圖譜轉(zhuǎn)化成的1、0數(shù)據(jù)矩陣，所以采用后者進(jìn)行聚類分析。SPSS聚類結(jié)果與本研究采用的聚類結(jié)果略有不同。

黃龍花等[10]成功通過(guò)一對(duì)ERIC-PCR引物區(qū)分出不同栽培品種的真姬菇；王永紅[17]等曾利用ERIC-PCR檢視不同保藏條件對(duì)同一草菇菌種遺傳性狀產(chǎn)生影響。通過(guò)比較7個(gè)草菇菌株的ERIC-PCR圖譜發(fā)現(xiàn)，不同的反應(yīng)體系會(huì)產(chǎn)生不同的區(qū)別效果。因此，選擇聯(lián)合2個(gè)圖譜的多態(tài)性進(jìn)行聚類分析。

通過(guò)生物學(xué)特性與遺傳多樣性可研究，可實(shí)現(xiàn)對(duì)7個(gè)草菇菌株進(jìn)行分類。對(duì)各種實(shí)驗(yàn)方法的分類情況歸納為表2。從表2可見(jiàn)，利用ERIC-PCR作為分子標(biāo)記可將7個(gè)草菇菌株完全分類。利用觀察菌落外觀、拮抗試驗(yàn)、同工酶圖譜聚類分析可把7個(gè)菌株分為六類，但其中最相似的2個(gè)菌株的歸類并不一致。利用栽培特性進(jìn)行分類的結(jié)果稍遜于其他分類方法，同時(shí)它的分類判定也較為主觀，在本研究中此方法可把7個(gè)菌株分為五類。而在2種可標(biāo)出相似性系數(shù)的方法中，即使在同一區(qū)分類中出現(xiàn)相同的菌株，但它們的相似性系數(shù)并不一致，表明這2種方法體現(xiàn)出不同的遺傳多樣性樣式。

綜上所述，7個(gè)草菇菌株通過(guò)一系列的生物學(xué)特性與遺傳多樣性測(cè)試，可顯示出它們相互之間的差異性。對(duì)于草菇菌種將來(lái)要進(jìn)行審定、認(rèn)證、保護(hù)等，有很好的參考作用。

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圖3 巰基乙醇·Tris法不同料液比提取烏拉爾甘草的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果比較

3.4 烏拉爾甘草與脹果甘草的蛋白質(zhì)電泳結(jié)果比較

由圖4可以看出，烏拉爾甘草種子和脹果甘草種子的蛋白質(zhì)條帶位置和數(shù)量均具有顯著差異,脹果甘草種子蛋白質(zhì)電泳的上部條帶較烏拉爾甘草條帶淺淡，但中部的2條帶上方各出現(xiàn)1條新帶，因此，可以依據(jù)這2條帶來(lái)鑒定烏拉爾甘草和脹果甘草的種子。

4 結(jié)論與討論

本研究通過(guò)分析比較8種蛋白質(zhì)提取方法，發(fā)現(xiàn)巰基乙醇法和丙酮沉淀法在甘草種子蛋白質(zhì)電泳試驗(yàn)中電泳條帶多，背景清晰，成本低，適宜于進(jìn)行甘草種子的SDS-PAGE電泳。1∶10和2∶10的料液比適宜于甘草種子蛋白質(zhì)的提取。10%和12%的分離膠電泳效果差異不大，均適用于進(jìn)行種質(zhì)鑒定，烏拉爾甘草種子和脹果甘草種子的蛋白質(zhì)條帶位置和數(shù)量均具有顯著差異,該研究結(jié)果為甘草種子純度檢測(cè)提供了有效的技術(shù)方法。

圖4 巰基乙醇法鑒定烏拉爾甘草(左側(cè))與脹果甘草(右側(cè))的種子蛋白質(zhì)電泳結(jié)果比較

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