沉水樟組織培養(yǎng)技術(shù)研究

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(1.福建省林業(yè)科學(xué)研究院， 福建 福州 350012；2.國家林業(yè)局南方山地用材林培育重點實驗室， 福建 福州 350012)

沉水樟(Cinnamomunmicranthum)別名水樟，是我國樟科樟屬的經(jīng)濟樹種，為我國大陸和臺灣的間斷分布種。長期以來對沉水樟資源的人為破壞，導(dǎo)致資源銳減，目前除福建建甌萬木林自然保護區(qū)分布有較大面積的沉水樟外，其余多被破壞殆盡，沉水樟種群已處于瀕危狀態(tài)，1982年被列為國家三級瀕危保護植物[1]。沉水樟木材紋理通直，結(jié)構(gòu)均勻細致，氣味芳香，是優(yōu)良的船舶、家具用材。植株可提取芳香油，主含黃樟油素，是重要的工業(yè)原料。沉水樟為樹形高大雄偉、干形通直、枝葉繁茂的常綠喬木。由于沉水樟屬自花授粉，雌雄花發(fā)育成熟期不一致，因而結(jié)實率很低，用作城市園林綠化樹種時，這反而成了一個優(yōu)點——可避免大量的落花落果，易于保持地面清潔。15年生沉水樟才能開花結(jié)果，果實在成熟前大量落果，果實成熟后其空殼率高達75%以上，種子多油、壽命短，難貯存，發(fā)芽率低[2]。

組織培養(yǎng)特點是繁殖速度快、繁殖后代整齊一致并能保持原有品種的優(yōu)良性狀，可在人工控制的條件下進行周年生產(chǎn)而不受自然環(huán)境中季節(jié)和惡劣天氣的影響，可以克服沉水樟種子壽命短，難貯存，發(fā)芽率低等問題。因此，開展沉水樟組培技術(shù)研究具有重要意義。

國內(nèi)僅見河南翟曉巧等《沉水樟體外植株再生體系的建立》和羅坤水等《沉水樟組織培養(yǎng)研究》的報道[3-4]。

1 材料與方法

1.1 材 料

取沉水樟小苗頂芽或半木質(zhì)化枝條作為試驗的外植體。

1.2 方 法

1.2.1 外植體表面滅菌

取沉水樟外植體經(jīng)自來水沖洗15～20 min，再用洗滌粉溶液浸泡20～30 min，然后用自來水流水沖洗干凈。在超凈工作臺上先用70%～75%酒精浸泡60 s，0.1%HgCl2消毒12～13 min，無菌水洗滌4次。剔除頂芽基部或莖段上下兩端，保留長度約為1.5 cm的莖段，接種于預(yù)先配置好的外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基上[5]。

1.2.2 培養(yǎng)條件

外植體誘導(dǎo)試驗采用暗培養(yǎng)；繼代培養(yǎng)光照強度1 000～1 500 lx；生根培養(yǎng)光照強度從1 000～1 500 lx增加到煉苗光照2 000～5 000 lx。培養(yǎng)溫度為(24±2)℃，光照時間為12 h/d。

1.3 試驗設(shè)計

1.3.1 外植體誘導(dǎo)

外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基： 1) MS+BA 5.0 mg/L(以下生長調(diào)節(jié)劑濃度相同)+IBA 0.1+Vc (抗壞血酸)5 mg/L； 2) 改良MS+BA 5.0+IBA 0.1+Vc 5 mg/L。以上均附加白糖30 g/L(“田趣”牌,下同)和瓊脂粉5.5 g/L，pH=6.0。每個處理接種30瓶(廣口瓶規(guī)格200 mL)，每瓶接種1個芽(或莖段)，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后觀察污染和誘導(dǎo)率[6-10]。

1.3.2 繼代培養(yǎng)基

繼代培養(yǎng)基： 3) MS+BA 5.0+IBA 0.1+Vc 5 mg/L+B25 mg/L； 4) MS+BA 0.5+IBA 0.1+Vc 5 mg/L+B25 mg/L； 5) 改良MS+BA 5.0+IBA 0.1+Vc 5 mg/L+B25 mg/L； 6) 改良MS+BA 0.5+IBA 0.1+Vc 5 mg/L+B25 mg/L。以上基本均附加白糖30 g/L和瓊脂粉5.5 g/L，pH=6.0。每個處理接種30瓶(廣口瓶規(guī)格200 mL)，每瓶接種3個莖芽，3次重復(fù)，培養(yǎng)30 d后觀察增殖系數(shù)和莖芽高度[4-8]。

表1 沉水樟外植體誘導(dǎo)試驗結(jié)果分析

培養(yǎng)基號基本培養(yǎng)基BA(mg/L)IBA(mg/L)平均誘導(dǎo)率(%)外植體表現(xiàn)1MS5．00．132．2±0．87a愈傷組織多、芽大、長得快2改良MS5．00．113．3±0．64b愈傷組織少、芽小、長得慢

表2 沉水樟增殖培養(yǎng)基試驗結(jié)果分析

培養(yǎng)基編號基本培養(yǎng)基BA(mg/L)NAA(mg/L)平均增殖率(倍)平均莖芽高度(cm)莖芽生長表現(xiàn)3MS5．00．13．5±0．153b1．5±0．100c 愈傷組織多，芽多且小，多數(shù)芽頂枯死4MS0．50．12．3±0．100d3．2±0．153b 愈傷組織多，芽數(shù)適中，多數(shù)芽頂枯死5改良MS5．00．14．1±0．153a1．9±0．058c 愈傷組織少，芽多且小，少數(shù)芽頂枯死6改良MS0．50．12．8±0．067c3．9±0．100a 愈傷組織少，芽數(shù)適中，少數(shù)芽頂枯死

表3 沉水樟生根培養(yǎng)基試驗結(jié)果分析

培養(yǎng)基編號基本培養(yǎng)基IBA(mg/L)平均生根率(%)植株生根狀況71/2MS0．1013．3±0．656d 根條數(shù)少、植株生長緩慢81/2MS0．2523．3±0．436c 根條數(shù)少、植株生長中等91/2MS0．5046．6±0．557b 根條數(shù)少、植株生長中等101/2MS1．0073．3±0．404a 每株根數(shù)3～5條、植株生長快

1.3.3 生根培養(yǎng)基

生根基本培養(yǎng)基： 7) 1/2 MS+IBA 0.10； 8) 1/2 MS+IBA 0.25； 9) 1/2 MS+IBA 0.5； 10) 1/2 MS+IBA 1.0。以上基本培養(yǎng)基均添加白糖20 g/L和瓊脂粉6.0 g/L，pH=6.0。每個處理接種10瓶，每瓶接種3個莖芽，3次重復(fù)。

1.3.4 煉 苗

經(jīng)培養(yǎng)25 d后的生根苗，搬到玻璃溫室煉苗15 d。光照度3 000～5 000 lx。生根培養(yǎng)40 d后觀察統(tǒng)計根長、根數(shù)、生根率和高度莖芽。

1.3.5 移 栽

栽培基質(zhì)采用紅心土，裝入營養(yǎng)袋，移入溫室中，以0.2‰高錳酸鉀溶液消毒土壤。煉苗后的沉水樟瓶苗，植株根部的培養(yǎng)基經(jīng)自來水洗凈，經(jīng)70%甲基托布津可濕性粉劑1 200倍液浸泡15 min消毒后，移植于營養(yǎng)袋內(nèi)，澆透水后立即用薄膜覆蓋保濕。葉片每天噴水1次、2周后可揭開薄膜，并以后每天噴1～3次，并逐步過渡到每天1次。

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進行單因素方差分析，置信度為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體表面滅菌

沉水樟外植體消毒比較困難，加上外植體容易褐化，外植體誘導(dǎo)困難，誘導(dǎo)成功率只有12%～35%。

2.2 外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基選擇

沉水樟外植體誘導(dǎo)結(jié)果見表1。試驗過程發(fā)現(xiàn)，外植體褐化嚴重，加入Vc 5 mg/L以減少褐化，并采用暗培養(yǎng)[6]。SPSS分析結(jié)果表明：培養(yǎng)基1號平均誘導(dǎo)率達到32.2%，培養(yǎng)基2號僅為13.3%，2個培養(yǎng)基之間具有顯著差異。該2種培養(yǎng)基除了基本培養(yǎng)基不同，其余激素等添加物完全相同，所以選擇培養(yǎng)基1號：MS+BA 5 mg/L+IBA 0.1 mg/L+Vc 5 mg/L作為外植體誘導(dǎo)基本培養(yǎng)基。

2.3 繼代培養(yǎng)基選擇

于無菌操作臺上，切下外植體誘導(dǎo)出的新芽，淘汰老組織，接種到繼代培養(yǎng)基，試驗結(jié)果列于表2。分析結(jié)果表明：培養(yǎng)基3～6號的平均增殖率分別達到3.5倍(b)、2.3倍(d)、4.1倍(a)和2.8倍(c)，四者之間具有顯著差異；對于平均莖芽高度，4種培養(yǎng)基分別為1.5 cm(c)、3.2 cm(b)、1.9 cm(c)和3.9 cm(a)，四者之間除了3號和5號培養(yǎng)基沒有顯著差異外，其余均有顯著差異。由于培養(yǎng)基3、4號導(dǎo)致莖芽基部愈傷組織多而且莖頂枯死較多，因此不選擇MS作為繼代基本培養(yǎng)基。由于培養(yǎng)基5號平均莖芽高度達不到工廠化育苗的要求，只有培養(yǎng)基6號莖芽高度3.9 cm符合要求；雖然培養(yǎng)基6號增殖率達僅為2.8倍，已經(jīng)符合組培工廠化育苗技術(shù)要求，所以選擇培養(yǎng)基6號：改良MS+BA 0.5+IBA 0.1+Vc 5 mg/L+B25 mg/L，作為沉水樟繼代培養(yǎng)基。

2.4 生根培養(yǎng)基選擇

增殖培養(yǎng)獲得的沉水樟合格生根莖芽接種到生根試驗培養(yǎng)基上，于培養(yǎng)室培養(yǎng)25 d，接著煉苗15 d，觀察統(tǒng)計植株生根狀況，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：培養(yǎng)基7～10號生根率之間具有顯著差異，其中培養(yǎng)基10號的平均生根率最高，達到73.3%，所以選擇培養(yǎng)基10號：1/2 MS+IBA 1.0 mg/L作為沉水樟生根培養(yǎng)基。

2.5 組培苗移栽

沉水樟組培瓶苗經(jīng)過15 d煉苗，倒出并洗凈根部培養(yǎng)基，然后移栽到溫室，移栽基質(zhì)采用紅心土，基質(zhì)提前3 d用0.2‰高錳酸鉀溶液消毒，移栽后立即覆蓋薄膜保濕和加強病蟲害防治，30 d后統(tǒng)計成活率達到82%以上。

3 結(jié)論和討論

3.1確定適宜沉水樟外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基為：MS+BA 5.0 mg/L+IBA 0.1 mg/L+Vc 5 mg/L，誘導(dǎo)率達到35%；增殖培養(yǎng)基為：改良MS+BA 0.5 mg/L+IBA 0.1 mg/L+Vc 5 mg/L+B25 mg/L，平均增殖率達到2.8倍、平均莖芽高度達到3.9 cm；生根培養(yǎng)基為：1/2 MS+IBA 1.0 mg/L，平均生根率達到73.3%。

3.2試驗中加入Vc 5 mg/L并采用暗培養(yǎng)可以減輕沉水樟外植體褐化。外植體誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)過程中莖芽基部始終有愈傷組織團存在和褐化現(xiàn)象出現(xiàn)，一定程度上影響莖芽的增殖和生長。瓶內(nèi)生根率有待于進一步提高。

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