腦出血實(shí)驗(yàn)動物模型研究進(jìn)展

魯華山 于長義 田志佳 楊彥龍 李立宏* (解放軍第06醫(yī)院創(chuàng)傷科，吉林 通化 3400; 第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 70038)

·綜述·

*通訊作者：李立宏，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，E-mail: lihongli777@163.com

腦出血實(shí)驗(yàn)動物模型研究進(jìn)展

魯華山1于長義1田志佳1楊彥龍2李立宏2*
(1解放軍第206醫(yī)院創(chuàng)傷科，吉林 通化 134001;2第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710038)

腦出血; 實(shí)驗(yàn)動物; 模型; 研究進(jìn)展

腦出血(intracerebral hemorrhage, ICH)是一種發(fā)病率和致殘率都很高的疾病，其十年生存率只有24.1%。腦出血的實(shí)驗(yàn)研究對于了解腦出血的發(fā)病原因、發(fā)生發(fā)展過程、損傷機(jī)制、病理生理改變及其預(yù)防和治療都至關(guān)重要，而建立穩(wěn)定性高、可重復(fù)性好、能較好的反應(yīng)其損傷機(jī)制的動物模型是該研究的前提。本文對腦出血實(shí)驗(yàn)動物模型的動物選擇、模型制作方法、各模型的優(yōu)劣和存在問題及未來展望等進(jìn)行綜述。

一、腦出血動物選擇

腦出血動物模型采用嚙齒類動物較多，因其價(jià)格低廉，體型較小，容易管理和進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性手術(shù)，且目前已積累了大量關(guān)于嚙齒類動物的生理、生化、藥理、形態(tài)學(xué)及遺傳學(xué)等可借鑒的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)資料。大多數(shù)腦出血采用的是大鼠作為模型，大鼠腦尾殼核是腦內(nèi)最大核團(tuán)，易于立體定位，而且尾殼核屬基底節(jié)，是人類高血壓腦出血最好發(fā)部位，所以大鼠腦出血模型中多定位于鼠腦尾殼核。兔子耳靜脈取血容易，基底節(jié)區(qū)相對發(fā)達(dá)，易于穿刺定位，且出血后神經(jīng)功能缺損明顯，在研究腦出血后病理生理改變的研究中較常用，采用兔做模型動物，其各項(xiàng)生理病理及病理變化與靈長類動物很接近，因此是一種較好的腦出血動物模型。犬的生理功能與人類相似性較高，用犬做的腦出血動物模型與人腦出血的情況比較接近。豬腦的解剖結(jié)構(gòu)與人腦很相似、腦容積大、腦實(shí)質(zhì)呈回狀、腦白質(zhì)發(fā)達(dá)、花費(fèi)較低、模擬腦出血情況較好，是比較理想的腦出血模型動物。最近，一項(xiàng)關(guān)于高原腦出血的動物模型研究[1]就以豬為對象，較好的模擬了高原腦出血的情況。靈長類動物的大腦無論從解剖結(jié)構(gòu)上還是生理功能上講，都是與人類最接近的動物，因此從模擬效果上講，靈長類動物無疑是最理想的動物模型選擇，可用于神經(jīng)保護(hù)劑等臨床前藥物的有效性和安全性的評估。但是靈長類動物價(jià)格昂貴，使用受到限制，倫理要求高，來源少等均使其不可能大規(guī)模用于實(shí)驗(yàn)室研究。研究者可根據(jù)自己實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵筮x擇合適的動物做成模型。

二、模型制作方法[2]

目前有關(guān)腦出血動物模型的研究文獻(xiàn)有很多，但都是在已有方法上的改進(jìn)，主要可分為4類：腦內(nèi)注血法和細(xì)菌膠原酶注入腦內(nèi)法應(yīng)用最廣泛，自發(fā)性腦出血動物模型最接近臨床發(fā)病過程，是較為理想的方法，微球囊充脹法已應(yīng)用較少。其各自特點(diǎn)如下：

1.腦內(nèi)注血法：腦內(nèi)直接注入自體動脈血或凝血塊是最常用的腦出血模型。20世紀(jì)60年代多采用狗、貓、猴等大動物，80年代末以后較多使用大鼠作為實(shí)驗(yàn)動物。該方法造成的腦出血模型在一定程度上類似人腦出血的病理過程，而且操作簡單，通過立體定向手術(shù)可造成各種部位的腦出血。將血液注入到腦內(nèi)制成腦出血的最早的實(shí)驗(yàn)是1982年Ropper等[2]報(bào)道的，在1 s內(nèi)將供體鼠腦室內(nèi)的血液通過27號兒科腰椎穿刺針注入到模型鼠右側(cè)尾狀核，但是該模型沒有考慮到供體鼠血液本身對模型的影響和注射壓力變化等因素。為了解決這個(gè)問題，1994年，有研究[3]用微注射泵把自體血以穩(wěn)定的速率注射到大鼠右側(cè)尾狀核，制作出腦出血模型，該模型具有可控性好、可重復(fù)等特點(diǎn)。但是該模型如果注射速度較快就會使血液沿著針道反流、破入腦室系統(tǒng)或是溢到硬膜下。此外，這種模型還有一個(gè)缺陷就是不能模擬血壓對血腫大小的影響。為了解決反流問題，1996年，Deinsberger等[4]在前一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上做了改進(jìn)，他們先將 5 μl新鮮自體血注入到尾狀核中，10 min后待血凝塊形成，再將剩余的血液注入到尾狀核形成血腫，這種兩次注入法有效的減少了血液沿針道反流。但該法注射時(shí)間延長易形成血凝塊，使得注射難度增大。Belayev等[5]在供體老鼠心臟血液中加入肝素以阻止血凝塊形成，但是有研究[6]證明，非肝素化的血液產(chǎn)生的血腫比肝素化的血液產(chǎn)生的血腫更大。近年來，這種“兩次注血法”經(jīng)過研究者改進(jìn)和動物種類的改變，制作出了一些更好的模型。Yu等[7]采用了一種自制的雙套管進(jìn)行兩次注血、三次拔針法造出了一種兔腦基底神經(jīng)節(jié)出血模型。這種雙套管由內(nèi)套管和外套管及針芯組成，外套管長6 mm，由塑料套管組成，內(nèi)套管長8.5 mm，由不銹鋼組成，并帶有針芯，首先在兔前囟前2 mm，右側(cè)距中縫線6 mm處的顱骨上做一直徑2 mm的鉆孔，采用立體定向技術(shù)將雙套管插入距顱骨6 mm深度的右側(cè)基底神經(jīng)節(jié)處。注血時(shí)，將內(nèi)套管鏈接到帶有微量注射泵的導(dǎo)管上，注血分兩步：第一步：以25 μl/min向套管內(nèi)注血，注射兩分鐘，共50 μl，然后將針芯插入內(nèi)套管，在該位置固定7 min；第二步：將內(nèi)套管向下插入2.5 mm，拔出針芯，以40 μl/min向套管內(nèi)注血250 μl，再將針芯插入套管內(nèi)。拔針分三步：第一步：在插入針芯后固定套管7 min，將內(nèi)套管拔出2.5 mm；第二步：在該位置固定套管8 min后，將兩個(gè)套管同時(shí)拔出3 mm；第三步：該位置固定9 min后，將兩個(gè)套管同時(shí)緩慢拔出。作者認(rèn)為該方法模擬出血效果明顯，可復(fù)制性好，能夠有效防止血液沿針道返流，并且通過微量注射泵緩慢注射可以防止血液溢出到蛛網(wǎng)膜下腔和腦室內(nèi)，其過程也與腦出血過程非常接近。

2.細(xì)菌膠原酶腦內(nèi)注入法：細(xì)菌膠原酶是一組能特異降解間質(zhì)和基底膜膠原成分的金屬基質(zhì)蛋白酶，膠原酶有Ⅰ～Ⅷ型，其中Ⅳ型和Ⅶ型細(xì)菌膠原酶都可成功用于腦出血動物模型的制備。腦內(nèi)注入細(xì)菌膠原酶20 min后即可損傷腦血管基底膜上的膠原蛋白，破壞血腦屏障。血管壁受損后引起滲血，血液逐漸積聚，約4 h時(shí)出血區(qū)融合成片狀出血，出血區(qū)的大小由細(xì)菌膠原酶注入量的多少決定。

1990年，Rosenberg等[8]在立體定位下用微量注射泵在9 min內(nèi)向大鼠尾狀核注入含0.01～1.00 U細(xì)菌膠原酶(Ⅶ型)的生理鹽水2 μl，誘導(dǎo)大鼠腦出血，他們觀察到注入膠原酶10 min后即有血液滲出，在0.5 U細(xì)菌膠原酶組出血點(diǎn)周圍水腫明顯，且大鼠死亡率低，所以適合于腦出血的長期實(shí)驗(yàn)研究。這種模型的優(yōu)點(diǎn)是：他是腦實(shí)質(zhì)內(nèi)血管破裂導(dǎo)致的出血，模擬了自然患者持續(xù)出血所致血腫擴(kuò)大的自然過程，并且可控制出血的位置。但是該模型的不足之處在于細(xì)菌膠原酶可引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。此外，還有人在不斷改進(jìn)該模型，如改變注射的時(shí)間、注射量、在細(xì)菌膠原酶加入肝素等。

3.自發(fā)性腦出血動物模型：自發(fā)性腦出血動物模型主要有兩種：一種是改變遺傳基因獲得的易卒中自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive cerebral hemorrhage in rat, SHCHR)，1980年，Ogata等[9]報(bào)道了這種模型，將有惡性高血壓的大鼠的后代進(jìn)行近親交配獲得。這種模型卒中率高，能重現(xiàn)人類自發(fā)性腦出血發(fā)病過程，但因存在遺傳局限性，易變種、斷種，飼養(yǎng)困難，且價(jià)格高、來源少而限制了其在腦出血研究中的廣泛應(yīng)用。另一種是腎血管性高血壓大鼠(renovascular hypertensive rats, RHR)，1998年，Zeng等[10]用直徑為0.3 mm的銀夾鉗夾大鼠的雙側(cè)腎動脈，制作出了該模型。這種模型易于建立，無遺傳缺陷，無須人工遺傳誘導(dǎo)，可用一般正常大鼠作對照研究，且有與人類腦出血相似的高血壓動脈硬化病理生理基礎(chǔ)。但與易卒中型自發(fā)性高血壓大鼠(SHCHR)相比，其自發(fā)性腦出血的發(fā)生率較低，并且出血量及出血區(qū)域同樣無法控制。Chelko等[11]對腎動脈夾進(jìn)行改進(jìn)從而提高了造模成功率。相比于SHCHR，RHR廉價(jià)易得、造模簡單且易于飼養(yǎng)。但兩者都存在腦出血的部位和出血量不易控制的問題，所以目前應(yīng)用受到了限制。Wu等[12]在SHRSP基底節(jié)區(qū)注入自體血制作腦出血模型，將改變遺傳基因的方式和自體血注入法結(jié)合，但研究發(fā)現(xiàn)血壓的緩慢升高加重腦出血后神經(jīng)損傷，并不能使血腫和周圍水腫帶擴(kuò)大。Wakisaka等[13]報(bào)道了一種藥物誘導(dǎo)高血壓腦出血動物模型，給C57BL/6小鼠輸注人Ang II和一氧化氮合酶抑制劑誘導(dǎo)產(chǎn)生慢性高血壓，再通過注射Ang II進(jìn)而產(chǎn)生急性高血壓，從而發(fā)生高血壓腦出血。此外，基因工程實(shí)驗(yàn)動物模型也在逐步被人們研究，基因敲除小鼠使我們對腦出血后腦損傷機(jī)制有了進(jìn)一步了解。由于自發(fā)性腦出血動物模型在腦出血的部位和出血量方面都還不易控制，所以目前自發(fā)性腦出血模型應(yīng)用還不是很廣泛，但由于其更接近自然腦出血發(fā)生發(fā)展過程，所以如果能克服上述缺點(diǎn)，自發(fā)性腦出血模型應(yīng)該是最理想的腦出血模型。

4.微球囊充脹法：這是一種純機(jī)械性的腦出血模型，主要用來模擬腦出血的占位效應(yīng)。該法是1987年，由Sinar等[14]發(fā)明，他們在SD大鼠顱骨上定位鉆孔，將微球囊置于25號鈍性針頭上，插入大鼠右側(cè)尾狀核，靜置30 min后，在平均壓為13.3 kPa下，20 s內(nèi)將微球囊充脹至50 μl，保留10 min后抽出。通過調(diào)節(jié)球囊內(nèi)液體量，可模擬不同血腫大小，從理論上講可用于研究腦出血血腫的占位效應(yīng)和血腫后神經(jīng)行為學(xué)的改變。Lopez Valdes等[15]在此基礎(chǔ)上采用微球囊充氣和放氣的方法模擬血腫形成和清除的過程，研究外科血腫清除術(shù)的最佳治療時(shí)機(jī)及臨床療效。但是這種模型僅僅只能模擬腦出血后占位病變引起的的各種病理生理改變，有許多研究證實(shí)腦出血后還有其他因素造成的損害，如：血腫的血管活性物質(zhì)釋放、血液本身的成分如凝血酶、血紅蛋白、血漿蛋白、缺氧及氧化應(yīng)激等。因此，由于以上三種研究的發(fā)展，目前已較少使用該方法了。

三、各模型對比及存在問題

以上動物模型各有優(yōu)缺點(diǎn)，血液注入法和膠原酶注入法在技術(shù)上很相似，他們都容易制作、可復(fù)制性好，對血腫大小和血腫部位比較容易控制，而細(xì)菌膠原酶注入法更容易模擬自然腦出血發(fā)生發(fā)展過程，但目前缺乏兩者注入后的恢復(fù)情況的對比研究。細(xì)菌膠原酶相對于自體血來講是異物，而自體血注入可以避免這個(gè)問題，從而更好的模擬出血后對腦的損傷。這兩種模型在目前應(yīng)該是最廣泛的。自發(fā)性腦出血動物目前也常用于腦損傷后腦出血機(jī)制的研究，由于難以控制出血量和出血部位，相對于前兩種模型這種模型應(yīng)用還不多。微球囊充脹法在模擬腦出血發(fā)生發(fā)展和損傷及其治療上顯然不及前三種模型，故已較少應(yīng)用了。

到目前為止，沒有哪一種模型可以十分理想的模擬真實(shí)的自然腦出血，這些動物模型對我們了解腦出血的病理生理機(jī)制等必不可少，但是它們不能取代更多的臨床相關(guān)模型。目前腦出血實(shí)驗(yàn)動物模型標(biāo)準(zhǔn)還不夠標(biāo)準(zhǔn)，許多實(shí)驗(yàn)動物模型還存在問題，比如我們在實(shí)驗(yàn)中常常用健康年幼雄性大鼠，沒有考慮到年齡性別并發(fā)癥等對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，有的實(shí)驗(yàn)沒有使用隨機(jī)性分組，缺乏隨機(jī)對照等，還有一些統(tǒng)計(jì)學(xué)上的問題也常常出現(xiàn)，因此，目前應(yīng)該建立一個(gè)更加嚴(yán)格的腦出血模型評價(jià)體系。

四、未來展望

盡管目前的動物模型還有許多需要改進(jìn)的地方，但是也有許多治療性的探討研究已在動物模型上得到證實(shí)，如：Bao等[16]在大鼠腦出血模型上研究出了骨髓間充質(zhì)細(xì)胞中的Flk-1(+)對大鼠腦出血后行為恢復(fù)、減輕炎癥反應(yīng)及促進(jìn)血管生成的作用；Yang等[17]研究了他汀類藥物對自體血注入大鼠模型的血腦屏障的保護(hù)作用；Zhou等[18]研究了止血劑聯(lián)合利伐沙班對注入細(xì)菌膠原酶的大鼠腦出血模型的治療作用；Rolland等[19]研究了芬戈莫德減少嚙齒類動物腦出血后淋巴細(xì)胞的滲透作用。近兩年來，有關(guān)腦出血的相關(guān)動物研究越來越多，但是還有許多未知的潛在因素可能還未被發(fā)現(xiàn)，所以，不斷改進(jìn)動物模型，解決腦出血從實(shí)驗(yàn)研究到臨床應(yīng)用的轉(zhuǎn)化才是未來研究的關(guān)鍵。

綜上所述，腦出血動物的選擇各有特點(diǎn)，造模方法各有優(yōu)劣，但是沒有哪一種動物模型可以完全模擬人腦出血發(fā)生發(fā)展過程及其損傷機(jī)制，只有研究者不斷探索，積極發(fā)現(xiàn)，才能找到一種更好的模擬腦出血機(jī)制的動物模型，并推動腦出血的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，最終轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用。

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魯華山，醫(yī)師，E-mail: starry_sky_1986@yeah.net

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