紅景天苷對大鼠顱腦損傷的保護(hù)作用研究

李茂林 王祝峰 章薇 毛星剛 李劍 賀亞龍* 章翔* ( 武警陜西省總隊醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 70054; 第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 7003)

·論著·

紅景天苷對大鼠顱腦損傷的保護(hù)作用研究

李茂林1王祝峰1章薇2毛星剛2李劍2賀亞龍2*章翔2*
(1武警陜西省總隊醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710054;2第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西 西安 710032)

目的探討紅景天苷(Salidroside, Sal)對大鼠顱腦外傷的神經(jīng)保護(hù)作用及其機(jī)制。方法健康成年SD大鼠36只，隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham組)、對照組(TBI組)、Sal給藥組(TBI+Sal組)。通過Feeney's自由落體打擊法制作大鼠顱腦損傷模型，24 h后對大鼠神經(jīng)功能損傷評分，對神經(jīng)元行尼氏(Nissl)染色，檢測動物損傷腦組織中GSH、SOD及MDA的水平，Tunel染色檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果TBI+Sal組較TBI組，降低了神經(jīng)功能缺損評分、細(xì)胞凋亡數(shù)量、MDA水平，顯著增加了Nissl陽性細(xì)胞的數(shù)量、SOD的活性以及GSH的水平。結(jié)論Sal能減輕大鼠TBI后神經(jīng)功能缺損，具有神經(jīng)保護(hù)作用，此作用依賴于抗氧化及抗凋亡的作用機(jī)制。

紅景天苷; 顱腦外傷; 氧化應(yīng)激; 神經(jīng)保護(hù); 細(xì)胞凋亡

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury, TBI)在平、戰(zhàn)時發(fā)生率高，占全身損傷總數(shù)的10%～20%，其中重型顱腦損傷死亡率高達(dá)35%～60%，且戰(zhàn)傷陣亡中顱腦傷居首位，是青壯年人群的首要死亡原因[1]，而繼發(fā)性腦損傷的救治是目前研究的重點。顱腦創(chuàng)傷后，損傷灶部位腦組織產(chǎn)生大量的自由基和炎癥介質(zhì)引起神經(jīng)元水腫和壞死，是導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的一個重要因素。

紅景天是薔薇目景天科(crassulaceae)紅景天屬(rhodiola)[2]，主要生長在海拔1 600～4 000 m 的高寒、干燥、缺氧、強紫外線照射、晝夜溫差大的地區(qū)，它具備了其它植物所沒有的特殊適應(yīng)性的物質(zhì)。紅景天苷(salidroside, Sal)是草本植物紅景天的主要化學(xué)成份之一，生物學(xué)活性顯著，可有效清除機(jī)體內(nèi)過多自由基，有防輻射及抗疲勞的雙重作用以及很好的抗缺氧、抗衰老、抗心肌缺血、提高免疫力等作用[3]。本研究將采用大鼠TBI模型，探討Sal對TBI的神經(jīng)保護(hù)作用。

材料與方法

一、實驗動物

健康成年雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠36只，體質(zhì)量 260～300 g，購自第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心。由第四軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科研究所動物室飼養(yǎng),溫度、濕度可控，明暗環(huán)境12 h交替，自由覓食、水。

二、分組及大鼠TBI模型制作

本組大鼠隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組(Sham)、對照組(TBI組)、Sal給藥組(TBI+Sal組)，每組12只，其中6只用作神經(jīng)功能評分、尼氏染色、TUNEL染色；另外6只用作生化指標(biāo)檢測。TBI組與TBI+Sal組依據(jù)通過Feeney's自由落體打擊模型(Feeney's weight-drop model )制作大鼠顱腦損傷模型[4]。動物由10% 水合氯醛麻醉后(400 mg/kg, IP)，固定于 大鼠腦立體定向框架上，剪開右頂部皮膚，采用環(huán)鉆開圓形骨窗(前囟后3.5 mm，中線旁2.5 mm，直徑5 mm)，顯露硬腦膜，用20 g直徑4.5 mm砝碼由30 cm高處沿外周導(dǎo)管墜落，下壓腦組織2.5 mm；Sham組麻醉后僅行顱骨開窗后縫合傷口。所有動物術(shù)后都置于保溫毯上，直至其麻醉蘇醒。

三、藥物準(zhǔn)備及給藥方法

Sal購自中國藥品生物檢定所 ，純度>99%。將 其溶于Tween 80 (Sigma, St. Louis, MO, USA)。TBI+Sal組動物術(shù)后立即給予Sal腹腔注射(40 mg/kg), SHAM組及TBI組手術(shù)則給予等體積不含Sal溶液腹腔注射。

四、神經(jīng)功能評分

利用肢體抓握試驗和平衡木試驗作為其傷后24 h神經(jīng)功能評估方法[4]。該評分方法分?jǐn)?shù)代表神經(jīng)功能缺損程度：0分代表無神經(jīng)功能缺損；8分代表嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損。

宜興湖父鎮(zhèn)民宿的弱點之一就是服務(wù)跟不上游客的需求，來這里旅游的游客大部分來自城市，他們一直以來都是接受大城市高星級酒店的優(yōu)質(zhì)服務(wù)，在服務(wù)質(zhì)量方面有較高的需要，而湖父鎮(zhèn)的民宿都是自體經(jīng)營，當(dāng)?shù)赝鶎⒚袼拮鳛楦睒I(yè)來經(jīng)營，民宿經(jīng)營者沒有專業(yè)的服務(wù)技能，沒有收到過系統(tǒng)的培訓(xùn)，也沒有相關(guān)的餐飲從業(yè)經(jīng)歷。所以湖父鎮(zhèn)民宿可以通過引進(jìn)專業(yè)的技能人才，來提高服務(wù)質(zhì)量，讓游客在享受自然地同時也能得到五星級酒店的服務(wù)感受。這樣專業(yè)的人才可以為宜興湖父鎮(zhèn)民宿樹立品牌形象，讓更多的游客知道宜興湖父鎮(zhèn)的民宿。

肢體抓握試驗：將大鼠置于120 cm長、離地80 cm高的拉緊之細(xì)繩上，并記錄其停留時間(0分=大鼠緊握繩索60 s以上并爬行迅速；1分=大鼠利用其后肢抓握繩索60 s以上爬行緩慢；2分=大鼠無法利用其后肢抓握繩索，無法爬行，但可停留60 s以上；3分=大鼠僅可在繩索上停留30～60 s；4分=大鼠30 s內(nèi)掉下繩索)。平衡木試驗：將大鼠置于寬1.5 cm平衡木上，觀察并記錄停留時間(0分=大鼠可以輕松行走并自由掉頭；1分=大鼠可于平衡木上保持60 s以上；2分=大鼠可利用肢體鉤掛于平衡木60 s以上；3分=大鼠30 s至60 s間于平衡木掉落；4分=大鼠30 s內(nèi)于平衡木掉落)。

五、尼氏染色

傷后24 h將大鼠麻醉、以生理鹽水、4%多聚甲醛順序灌注后，完整取腦，以4%多聚甲醛 固定過夜，水洗、石蠟包埋，石蠟切片機(jī)切片(Leitz 1512, Leica, Bensheim, Germany)，厚度為 4 μm。60℃ 烤片機(jī)拷片過夜后，梯度脫蠟、脫水，56℃溫箱內(nèi)焦油紫液 染色1 h，用蒸餾水沖洗，70%酒精分化。至顯微鏡下觀察時見背景無色 ，細(xì)胞及尼氏小體有明顯 的輪廓為度 ； 以無水酒精急速脫水 5 s，入氯仿 5 s，二甲苯透明 ，封片劑封片。

選取位于局灶傷下的海馬CA2區(qū)(前囟后3 mm 間隔選取6張冠狀面切片)進(jìn)行顯微鏡下采集圖像、神經(jīng)元計數(shù)(DP70, Olympus, Tokyo, Japan)，以神經(jīng)元胞體、胞核完整為計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。

六、 生化指標(biāo)檢測

大鼠傷后24 h處死，迅速取腦，于冰上分離右側(cè)海馬組織、-80℃保存，將組織用生理鹽水勻漿后進(jìn)行蛋白提取及濃度測定(考馬斯亮蘭法)。利用脂質(zhì)過氧化物、谷胱甘肽(GSH)、超氧化物岐化酶(SOD)檢測其氧化、抗氧化水平，脂質(zhì)過氧化物的評估由檢測丙二醛(MAD)進(jìn)行反應(yīng)。 依據(jù)各檢測試劑盒操作說明逐步施行，試劑盒購自南京建成生物工程公司。

七、 TUNEL染色

利用TUNEL染色檢測傷后24 h腦組織切片中細(xì)胞凋亡情況，選取 Dead End TM 熒光TUNEL 系統(tǒng) (Promega, Madison, WI, USA)。 碘化丙啶(Propidium iodide, PI)可將凋亡與非凋亡細(xì)胞均著紅色，熒光素-12-dUTP只將凋亡細(xì)胞胞核著綠色。共聚焦顯微鏡(FV1000, Olympus)600倍下每張切片，隨機(jī)選取10個視野進(jìn)行計數(shù)。

八、統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均用 mean±SD (standard deviation) 表示 ，采用 SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。統(tǒng)計分析選取單因素方差分析(one-way analysis of variance, ANOVA)，組間兩-兩比較采用 Tukey 檢驗法 ，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義 。

結(jié) 果

一、Sal對顱腦外傷后神經(jīng)功能缺損評分的影響

致傷前所有實驗動物都進(jìn)行訓(xùn)練，Sham組無神經(jīng)功能缺損，傷后24 h TBI組神經(jīng)功能缺損評分顯著增高，而TBI+Sal組神經(jīng)功能缺損評分明顯低于TBI組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖1)。

二、Sal對顱腦外傷后神經(jīng)元損傷的影響

神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能單位，尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一，存在于神經(jīng)元胞體和樹突內(nèi)。我們采用尼氏染色對神經(jīng)元損傷程度進(jìn)行評估， 與Sham組相比，傷后24 h TBI組CA2區(qū)神經(jīng)元數(shù)量顯著減少(P<0.01)，而TBI+Sal組神經(jīng)元數(shù)量明顯高于TBI組，且具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

三、Sal對顱腦外傷后氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響

我們利用丙二醛(MAD)、谷胱甘肽(Glutathione, GSH)、超氧化物岐化酶(SOD)檢測其抗氧化水平。 與Sham組相比，傷后24 h TBI組MDA水平升高、SOD活性、GSH水平顯著降低 (P<0.01)；而傷后給予Sal后，與TBI組相比明顯降低了MDA水平，增加了SOD活性和GSH水平(P<0.05 ) (圖3)。

四、Sal對顱腦外傷后細(xì)胞凋亡的影響

我們采用TUNEL染色對傷后細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行評估， 與Sham組相比，傷后24 h TBI組細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加(P<0.01)，而TBI+Sal組相應(yīng)區(qū)域凋亡細(xì)胞數(shù)量明顯低于TBI組 (P<0.05) (圖4)。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

圖1 傷后24 h紅景天苷對各組大鼠神經(jīng)功能缺損的影響 (n=6)

Fig 1 Effect of Sal on neurological deficits at 24 h following TBI in rats (n=6)

aP<0.05,vsTBI.

圖2 尼氏染色顯示傷后24 h大鼠CA2區(qū)神經(jīng)元數(shù)量 (n=6)

Fig 2 Nissl staining of the hippocampus in different groups (n=6)

A: Sham group; B: TBI group; C: 40 mg/kg Sal + TBI group; D: Number of neurons in CA2 area of the right side hippocampus.

aP<0.01,vsSham;bP<0.05,vsTBI.

Bar=100 μm.

圖3 傷后24 h各組大鼠生化指標(biāo)含量(n=6)

Fig 3 Effect of Sal on the contents of MDA and GSH, and the activity of SOD at 24 h post TBI (n=6)

A: The level of MDA; B: The activity of SOD; C: The level of GSH.

aP<0.01,vsSham;bP<0.05,cP<0.01,vsTBI .

圖4 傷后24 h各組大鼠致傷腦組織細(xì)胞凋亡情況 (n=6)

Fig 4 TUNEL staining of the cortex in different treatment groups (n=6)

A: TUNEL staining of the right side parietal cortex. Propidium iodide (PI) stains both apoptotic and nonapoptotic cells red. Fluorescein-12-dUTP incorporation results in localized green fluorescence within the nucleus of apoptotic cells only; B: Relative ratio of TUNEL positive cells.

aP<0.01,vsSham;bP<0.05,cP<0.01,vsTBI.

討 論

TBI在平、戰(zhàn)時發(fā)生率高，系全世界每年致殘、致死的重要原因，為一全球性的健康問題，但目前仍缺乏有效的治療手段來改善患者預(yù)后[6]。目前研究認(rèn)為，TBI致傷原因主要包括原發(fā)腦損傷和二次腦損傷：原發(fā)腦損傷多為腦挫裂傷、彌漫性軸索損傷(diffuse axonal injury, DAI)等；而二次腦損傷主要包括腦出血、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激以及神經(jīng)元死亡等。TBI的病理生理機(jī)制復(fù)雜，損傷灶部位腦組織產(chǎn)生大量的自由基引起氧化應(yīng)激反應(yīng)(reactive oxygen species, ROS) ，該產(chǎn)物可通過氧化脂質(zhì)、蛋白以及DNA最終使細(xì)胞損傷甚或死亡[7]。自由基所致脂質(zhì)過氧化物是TBI后二次腦損傷的重要影響因素，它可導(dǎo)致細(xì)胞損傷或繼發(fā)性死亡。如何預(yù)防及治療二次腦損傷是目前TBI研究的重點內(nèi)容[8]。因此，通過獲得外源性抗氧化物質(zhì)來支持內(nèi)源性防御機(jī)制，增強過氧化物的清除能力，是治療TBI的一大策略，而研究一種行之有效的抗氧化治療方法就顯得尤為重要了。

Sal是草本植物紅景天的主要化學(xué)成份之一，其生物學(xué)活性十分明顯。近年來研究還發(fā)現(xiàn)，它具有抗缺氧、抗疲勞、抗衰老、對心血管的保護(hù)作用、以及抗腫瘤、防輻射等多種生物作用[3]。Sal在鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型大鼠中具有提高海馬CA1區(qū)ChAT和BDNF陽性神經(jīng)元的表達(dá)，改善學(xué)習(xí)記憶的功能[9]。此外，Sal對百草枯誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，提升了細(xì)胞抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激損傷，維持了細(xì)胞線粒體正常功能[10]。但Sal是否具有TBI后的神經(jīng)保護(hù)作用，目前還未見報道。

本實驗采用Feeney's自由落體打擊法制作大鼠顱腦損傷模型[11]，該模型很好地模擬了現(xiàn)實臨床工作中TBI的損傷特點，包括行為學(xué)、組織病理學(xué)等。我們將成年大鼠致傷后，立即給予Sal腹腔注射治療，于24 h后發(fā)現(xiàn)，Sal能明顯地減輕大鼠神經(jīng)功能缺損程度，并降低了海馬區(qū)CA2區(qū)神經(jīng)元的損失。這表明了Sal對TBI的神經(jīng)保護(hù)作用，提示其具有改善TBI的預(yù)后功能。

多項研究證實，Sal具有抗氧化作用，我們在研究中利用脂質(zhì)過氧化物、SOD活性以及GSH水平來評估Sal在氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用。MDA是一脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的副產(chǎn)物，可用來評估脂質(zhì)過氧化反應(yīng)程度。GSH為一種最重要的非蛋白硫醇，系ROS關(guān)鍵的清除劑。本研究發(fā)現(xiàn)，TBI組致傷24 h后MDA水平明顯升高，SOD活性及GSH水平顯著下降。而治療組Sal(40 mg/kg)則明顯地減弱了MDA的升高水平、增加了SOD活性和GSH水平。研究結(jié)果提示，Sal可降低ROS產(chǎn)物生成，提高了抗氧化能力，從而有效地減輕了TBI所致二次腦損傷。神經(jīng)元凋亡是TBI后遲發(fā)性細(xì)胞死亡重要的組成部分[12]，本研究結(jié)果顯示，TBI后腦挫傷皮層組織細(xì)胞大量凋亡，而Sal明顯地減少了TUNEL染色陽性細(xì)胞率，減輕細(xì)胞凋亡，提示Sal增強了TBI后腦組織的抗凋亡能力。

綜上所述，大鼠TBI后立即給予Sal進(jìn)行治療，可以減輕腦損傷(包括神經(jīng)功能缺損、海馬神經(jīng)元的損傷、遲發(fā)性的細(xì)胞凋亡以及氧化應(yīng)激反應(yīng))。我們認(rèn)為，Sal具有神經(jīng)保護(hù)作用，其主要保護(hù)機(jī)制可能是通過抗氧化和抗凋亡來實現(xiàn)的。因此，Sal為TBI所致二次腦損傷提供了一種潛在的治療策略。

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Theprotectionofsalidrosideagainsttraumaticbraininjuryofadultrats

LIMaolin1,WANGZhufeng1,ZHANGWei2,MAOXinggang2,LIJian2,HEYalong2,ZHANGXiang2

1DepartmentofNeurosurgery,ArmedPoliceCorpsHospitalofShaanxi,Xi'an710054;2DepartmentofNeurosurgery,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi'an710032, China

ObjectiveThe potential protection of salidroside on adult rats against the traumatic brain injury (TBI) was investigated.MethodsThirty-six adult rats were randomly divided into three groups, ie, sham group, TBI group and TBI+Sal group. We employed Feeney's weight-drop model to ascertain whether intraperitoneal administration of salidroside (40 mg/kg) post TBI could reduce the severity of neurological deficits and hippocampal neuron loss. The levels of malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH), the activity of superoxide dismutase (SOD), and the number of terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling (TUNEL)-positive apoptotic cells were also measured to characterize the antioxidative and antiapoptotic properties.ResultsA significant reduction of neurological deficits and hippocampal neuron loss was observed in the TBI+sal group (40 mg/kg) at 24 h after TBI compared with the TBI group. Furthermore, administration of salidroside (40 mg/kg) significantly increased the activity of SOD, the level of GSH, and also reduced the level of MDA and the number of apoptotic cells at 24 h after TBI.ConclusionIn summary, these results suggests that salidroside plays a neuroprotective effect against TBI, which may be associated with its antioxidative and antiapoptotic functions.

Salidroside; Traumatic brain injury; Oxidative stress; Neuroprotective effect; Apoptosis

1671-2897(2016)15-128-04

R 651

A

國家自然科學(xué)基金資助項目(81471266, 81302174)

李茂林，主任醫(yī)師，E-mail: 3355698699@qq.com

*通訊作者： 賀亞龍，講師、主治醫(yī)師，E-mail：471084676@qq.com；章翔，教授、主任醫(yī)師，博生生導(dǎo)師，E-mail: xzhang@fmmu.edu.cn

2016-02-06；

2016-02-25)