太平洋雙色鰻鱺(Anguilla bicolor pacifica)致病性類志賀鄰單胞菌的鑒定和中藥敏感性研究*

賴曉健 楊方園 李忠琴①

(1. 集美大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院 廈門 361021; 2. 鰻鱺現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)教育部工程研究中心 廈門 361021)

太平洋雙色鰻鱺(Anguilla bicolor pacifica)隸屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、鰻鱺目(Anguilliformes)、鰻鱺科(Anguillidae)、鰻鱺屬(Anguilla), 主要分布于西太平洋的赤道地區(qū), 其中從婆羅洲東海岸、新幾內(nèi)亞北部到菲律賓的呂宋島分布最多, 在我國臺(tái)灣地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)(Han et al, 2001)。東南亞太平洋雙色鰻鱺的苗種資源豐富, 鰻苗價(jià)格較日本鰻鱺(A. japonica)和美洲鰻鱺(A. rostrata)低, 而生長速度與日本鰻鱺和美洲鰻鱺接近, 具有較高的市場(chǎng)潛力。近年來我國各地陸續(xù)從菲律賓和印度尼西亞等地引進(jìn)了鰻鱺苗種(主要是太平洋雙色鰻鱺和花鰻鱺(A. marmorata))進(jìn)行養(yǎng)殖, 取得了一定的效果。但太平洋雙色鰻鱺的養(yǎng)殖技術(shù)還不成熟, 成活率不高, 且病害較多。目前,國內(nèi)外還未見關(guān)于太平洋雙色鰻鱺細(xì)菌性病原的鑒定和藥物敏感性方面的報(bào)道。

本課題組前期對(duì)日本鰻鱺、歐洲鰻鱺(A. anguilla)和美洲鰻鱺的主要病原及防治藥物進(jìn)行了大量的基礎(chǔ)研究(佟延南, 2009; 汪黎虹, 2010; 楊求華, 2012),在此基礎(chǔ)上針對(duì)鰻鱺養(yǎng)殖種類的變化, 逐步對(duì)新引進(jìn)的花鰻鱺和太平洋雙色鰻鱺的主要病原開展研究(楊方圓等, 2013)。

近年來, 由于中草藥含具增強(qiáng)免疫功能的生物活性分子, 同時(shí)也有來源廣泛、價(jià)格便宜和不易受生物排斥等不同于傳統(tǒng)漁藥和疫苗的優(yōu)點(diǎn), 其作為漁用藥物已被廣泛的研究 (Galina et al, 2009; Bulfon et al, 2015)。目前, 中草藥的體外抑菌研究已在嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、遲緩愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)、維氏氣單胞菌(A. veronii)和鰻弧菌(Vibrio anguillarum)等常見水產(chǎn)病原菌中開展, 研究表明五倍子(Galla chinensis)、石榴皮(Runica Granatum)和大黃(Rheum palmatum)等中藥對(duì)常見的水產(chǎn)病原菌具有較好的體外抑殺效果(表1)。

2012年5月, 福清市某鰻魚養(yǎng)殖廠養(yǎng)殖的太平洋雙色鰻鱺暴發(fā)疾病, 病鰻漂浮于水面, 死亡鰻鱺主要癥狀為肛門有黃色粘液流出, 腸粘膜充血糜爛, 肝臟腫脹。本文對(duì)該病病原進(jìn)行了分離和鑒定, 并研究了其毒力和中藥敏感性, 旨在為該病的防治提供參考依據(jù)。

表1 中藥對(duì)常見水產(chǎn)致病菌的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度(mg/mL)Tab.1 Minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of Chinese herbs on common aquatic pathogenic bacteria (mg/mL)

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

健康太平洋雙色鰻鱺購于某鰻魚養(yǎng)殖廠, 平均體重為(10±2)g, 暫養(yǎng)于集美大學(xué)水產(chǎn)試驗(yàn)場(chǎng), 水溫26—28℃, 溶氧＞5mg/L。

M-H培養(yǎng)基(上海博微生物科技有限公司);BIOLOG專用培養(yǎng)基(美國BIOLOG公司); GYZ-15eV發(fā)酵型革蘭氏陰性桿菌生化編碼鑒定管(杭州濱和微生物試劑有限公司); 細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)。

大黃、連翹(Forsythia suspensa)、訶子(Terminalia chebula), 產(chǎn)地福建; 石榴皮、肉桂(Cinnamomum cassia), 產(chǎn)地甘肅; 生地榆(Sanguisorba officinalis)、五倍子, 產(chǎn)地湖北; 丁香(Eugenia caryophllata)、首烏藤(Polygonum multiflorum), 產(chǎn)地廣西; 檳榔(Areca catechu), 產(chǎn)地海南。

1.2 病原菌的分離純化和生理生化鑒定

取具有典型發(fā)病癥狀的病鰻鰓、體表粘液在顯微鏡下進(jìn)行寄生蟲和真菌排查, 用 75%酒精棉球擦拭體表消毒, 于無菌條件下取肝臟組織, 劃線接種于M-H培養(yǎng)基, 28℃培養(yǎng)24h后, 出現(xiàn)大量菌落, 挑取優(yōu)勢(shì)菌落, 經(jīng)2次純化培養(yǎng)后, 得到菌株AMSH1。將分離所得菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色, 根據(jù)結(jié)果,按照產(chǎn)品使用說明書運(yùn)用 GYZ-15eV生化檢測(cè)試劑盒和BIOLOG自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)該菌株進(jìn)行鑒定。

1.3 16S rDNA基因序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育分析

按試劑盒的說明書提取細(xì)菌基因組 DNA, 以此為模板, 用通用引物 27F: 5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′和 1492R: 5′-TACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3′擴(kuò)增細(xì)菌的16S rDNA基因片段。PCR反應(yīng)條件為: 94℃ 5min; 94℃ 1min, 53℃ 1min, 72℃2min, 33個(gè)循環(huán); 72℃ 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后, 送上海生工生物工程技術(shù)公司測(cè)序。

將菌株AMSH1的16S rDNA基因序列通過NCBI的 Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析, 從中選取與所獲序列同源性較高的同種細(xì)菌的16S rRNA基因序列, 并從 GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得氣單胞菌屬(Aeromonassp.), 愛德華氏菌屬(Edwardsiellasp.)和弧菌屬(Vibirosp.)細(xì)菌的 16S rDNA 序列, 采用ClustalX 1.83軟件進(jìn)行多序列匹配排列, 利用MEGA 5采用鄰位連接法(Neighbor-Joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 通過自舉分析進(jìn)行置信度檢測(cè), 自舉數(shù)集1000次。

1.4 人工感染試驗(yàn)

將分離純化的AMSH1菌株接種于M-H液體培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)24h后, 4000g離心10min沉淀菌體, 無菌生理鹽水清洗3次, McFarland比濁法調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×109CFU/mL, 用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋成濃度為 1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105CFU/mL的菌懸液。健康太平洋雙色鰻鱺隨機(jī)分成6組, 分 5個(gè)菌懸液濃度組和 1個(gè)對(duì)照組, 每組設(shè) 2個(gè)試驗(yàn)箱, 每箱放魚 5尾, 每尾魚腹腔注射 0.1mL,對(duì)照組注射生理鹽水。試驗(yàn)周期為 14d, 期間持續(xù)充氣、定時(shí)投喂和排污換水, 水溫26—28℃。觀察記錄各組魚的癥狀和死亡情況。對(duì)死亡魚進(jìn)行解剖和病原菌再分離、鑒定。根據(jù)Reed-Muench法測(cè)定半致死量(Wardlaw, 1985)。

1.5 中藥藥敏試驗(yàn)

將中藥進(jìn)行冷凍超微粉碎, 加工方法參見李忠琴等(2012)。將中藥超微粉以 1g/mL濃度進(jìn)行兩倍梯度稀釋, 加入 M-H培養(yǎng)基中, 配制成不同濃度的藥敏培養(yǎng)基, 每個(gè)藥物濃度梯度設(shè)置 2組平行, 空白對(duì)照組M-H培養(yǎng)基不加中藥。將菌懸液(濃度為1×107CFU/mL)接種于藥敏培養(yǎng)基平板上, 28℃恒溫培養(yǎng), 觀察菌落的生長情況。以24h無菌落形成的最低濃度為中藥對(duì)該菌株的最低抑菌濃度(MIC),以48h無菌落形成的最低濃度為中藥對(duì)該菌株的最低殺菌濃度(MBC)。雙聯(lián)用部分抑菌濃度(fractional inhibitory concentration, FIC)指數(shù)計(jì)算: FIC=MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用 + MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用; 三聯(lián)用FIC = MIC甲藥聯(lián)合/MIC甲藥單用+ MIC乙藥聯(lián)合/MIC乙藥單用 + MIC丙藥聯(lián)合/MIC丙藥單用。雙聯(lián)用和三聯(lián)用 FIC判讀標(biāo)準(zhǔn)見表 2。

表2 雙聯(lián)用和三聯(lián)用復(fù)方部分抑菌濃度(FIC)的判讀標(biāo)準(zhǔn)Tab.2 Benchmark for FIC (fractional inhibitory concentration) of double-compound and triple-compound prescriptions

2 結(jié)果

2.1 菌株生理生化鑒定

從病鰻肝臟中分離得到的致病菌菌株 AMSH1,利用GYZ-15eV系統(tǒng)鑒定, 結(jié)果顯示該菌尿素酶、磷酶、二磷酶、檸檬酸鹽、產(chǎn)H2S試驗(yàn)和V-P試驗(yàn)均為陰性, 鑒定結(jié)果為類志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides), 可信度為10.66%。利用BIOLOG自動(dòng)微生物系統(tǒng)進(jìn)行鑒定, 結(jié)果菌株AMSH1為類志賀鄰單胞菌, 鑒定結(jié)果相似性為 100%。該菌株能利用葡萄糖、麥芽糖、果糖、海藻糖、肌醇、天冬氨酸、L-谷氨酸和L-絲氨酸, 不能分解乳糖、蔗糖、甘露糖、巖藻糖、D-絲氨酸、L-組氨酸、L-丙氨酸和L-精氨酸。從人工感染死亡的太平洋雙色鰻鱺再分離到的細(xì)菌的鑒定結(jié)果與菌株AMSH1的鑒定結(jié)果一致。

2.2 16S rRNA基因序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

用通用引物擴(kuò)增菌株AMSH1的16S rDNA, 測(cè)序獲得長度為 1455bp的片段。經(jīng)過 GenBank進(jìn)行Blast同源性分析, 結(jié)果表明, AMSH1的16S rDNA與已登陸的類志賀鄰單胞菌16S rDNA序列的同源性均達(dá)到99%。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示其與類志賀鄰單胞菌聚為一支, 且置信度高達(dá) 100%。菌株 AMSH1與腸桿菌科的遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda,KC763831.1)的親緣關(guān)系比弧菌科的弧菌屬(Vibirosp.)和氣單胞菌屬(Aeromonassp.)的親緣關(guān)系近(圖1)。

2.3 人工感染

通過腹腔注射健康的太平洋雙色鰻鱺, 菌株AMSH1在1.0×106CFU/mL及以下濃度時(shí), 沒有出現(xiàn)死亡。1.0×108CFU/mL和1.0×107CFU/mL濃度組在48—120h出現(xiàn)死亡, 累計(jì)死亡率分別為80%和30%。注射最高濃度組1.0×109CFU/mL的太平洋雙色鰻鱺在24h后開始出現(xiàn)死亡, 并在 96h內(nèi)全部死亡。對(duì)照組魚未死亡(表3)。依據(jù)人工感染試驗(yàn)結(jié)果, 計(jì)算出該菌對(duì)太平洋雙色鰻鱺的半致死量LD50=3.52×105CFU/g。人工感染致死鰻鱺的癥狀為肛門有黃色粘液流出, 肝臟腫脹, 腸粘膜充血, 與養(yǎng)殖廠發(fā)病鰻鱺的癥狀相同(圖2)。

圖1 菌株AMSH1 16S rDNA基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA gene partial sequence of Stain AMSH1

表3 菌株AMSH1人工感染太平洋雙色鰻鱺試驗(yàn)Tab.3 Results of artificial infection of Strain AMSH1 to healthy A. bicolor pacifica

2.4 中藥敏感性

試驗(yàn)結(jié)果表明, 10味中藥對(duì)菌株AMSH1均有較好的抑制效果, MIC和MBC范圍為2—24mg/mL。其中五倍子、丁香和生地榆的抑菌效果最好, MIC范圍為2—4mg/mL(表4)。在10味中藥中選取5味效果較好的單方組合成 10種雙聯(lián)用復(fù)方進(jìn)行試驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)其中有7種雙聯(lián)用復(fù)方對(duì)菌株AMSH1具有協(xié)同抑菌作用, 含有五倍子的 4種雙聯(lián)用復(fù)方均有協(xié)同抑菌作用(表5)。4種三聯(lián)用復(fù)方僅五倍子復(fù)方A具有協(xié)同抑菌作用, 另外 3種均為相加抑菌作用(表 6)。中藥敏感性試驗(yàn)表明五倍子的抑菌效果最顯著, 含有五倍子的4種雙聯(lián)用復(fù)方和1種三聯(lián)用復(fù)方均有協(xié)同抑菌效果。

表4 10味中藥對(duì)菌株AMSH1的最低抑菌濃度和最低殺菌濃度(mg/mL)Tab.4 The minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of 10 Chinese herbs on AMSH1 (mg/mL)

表5 10種中藥雙聯(lián)用復(fù)方對(duì)菌株AMSH1的抑菌效果(mg/mL)Tab.5 The inhibitory effect of 10 double-compound prescriptions on AMSH1 (mg/mL)

表6 4種中藥三聯(lián)用復(fù)方對(duì)菌株AMSH1的抑菌效果(mg/mL)Tab.6 The inhibitory effect of 4 triple-compound prescriptions on AMSH1 (mg/mL)

3 討論

本試驗(yàn)中, 從太平洋雙色鰻鱺病魚肝臟中分離得到的病原菌株經(jīng)回歸感染證實(shí)具有很強(qiáng)的致病性,半致死量LD50為3.2×105CFU/g。運(yùn)用BIOLOG自動(dòng)微生物系統(tǒng)鑒定結(jié)果顯示該菌株為類志賀鄰單胞菌,且相似性為100%。鑒定結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株能利用葡萄糖, 不能分解蔗糖和甘露糖, 此特征與從鱘魚(Huso husoa♀ ×Acipenser ruthenus♂) (王小亮等, 2013)和尼羅羅非魚(Tilapia) (劉志剛等, 2015)中分離得到的類志賀鄰單胞菌菌株一致。通過測(cè)序比對(duì)分析該菌株的16S rDNA基因序列與6株類志賀鄰單胞菌的相似性高達(dá)99%, 同時(shí)構(gòu)建的進(jìn)化樹也表明與這6株類志賀鄰單胞菌聚合為一支, 因此可判定該菌株為類志賀鄰單胞菌。

類志賀鄰單胞菌是一種革蘭氏陰性短桿菌, 能運(yùn)動(dòng), 需氧或兼性厭氧, 曾歸屬于弧菌科, 后研究發(fā)現(xiàn)其在分子水平跟鄰單胞菌和變形桿菌屬更為接近,歸入腸桿菌科, 鄰單胞菌屬(Ruimy et al, 1994)。類志賀鄰單胞菌廣泛存在于自然界, 可引起人的急性腹瀉和食物中毒等疾病。該菌作為病原菌可單獨(dú)或混合感染水生動(dòng)物, 已在日本鰻鱺等養(yǎng)殖魚類中發(fā)現(xiàn)(Cruz et al, 1986; 陳林等, 2009; 陸文浩等, 2009; Joh et al, 2012; 王小亮等, 2013; 劉志剛等, 2015), 但目前還沒有感染并導(dǎo)致養(yǎng)殖太平洋雙色鰻鱺死亡的報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)室從各地鰻魚養(yǎng)殖廠取樣檢測(cè)的結(jié)果表明, 類志賀鄰單胞菌在 0—100g/ind的小規(guī)格太平洋雙色鰻鱺中的檢測(cè)較高, 100g/ind規(guī)格以上的太平洋雙色鰻鱺中未檢測(cè)到該菌。同時(shí)類志賀鄰單胞菌的發(fā)病具有明顯的季節(jié)性, 夏季水溫較高的時(shí)候發(fā)病率高于水溫較低的春季和秋季。另外, 在與太平洋雙色鰻鱺同池養(yǎng)殖的花鰻鱺中未檢測(cè)到類志賀鄰單胞菌。Joh等(2012)對(duì)日本鰻鱺的病原調(diào)查發(fā)現(xiàn)在日本鰻鱺中類志賀鄰單胞菌的檢出率為 2.2%, 低于太平洋雙色鰻鱺中的檢出率。太平洋雙色鰻鱺作為新的鰻鱺養(yǎng)殖種類, 主要分布于熱帶, 對(duì)其細(xì)菌性病原的研究很少。同時(shí), 對(duì)類志賀鄰單胞菌感染魚類的報(bào)道集中在溫水性魚類(Cruz et al, 1986; 陳林等, 2009; 陸文浩等, 2009; Joh et al, 2012; 王小亮等, 2013)。因此, 研究從太平洋雙色鰻鱺分離的類志賀鄰單胞菌菌株的毒性及其對(duì)藥物的敏感性顯得更有意義。

中藥敏感性試驗(yàn)表明, 10味中藥對(duì)類志賀鄰單胞菌均有抑菌和殺菌效果, MIC和 MBC范圍為2—24mg/mL。其中五倍子的效果最好, 其次是丁香和生地榆。五倍子對(duì)類志賀鄰單胞菌的MIC為2mg/mL,與弧菌屬的致病菌較為接近(梁利國等, 2010), 但高于嗜水氣單胞菌和遲緩愛德華氏菌(李忠琴等, 2011)。五倍子中鞣質(zhì)可能通過與類志賀鄰單胞菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的結(jié)合, 凝固微生物體內(nèi)原生質(zhì)(Sotohy et al,1995), 進(jìn)而達(dá)到抑殺作用。鞣質(zhì)在酸性條件下水解可得到?jīng)]食子酸。五倍子中所含的沒食子酸也具有較好的抑菌活性(鄭曙明等, 2010)。丁香中的主要抑菌成分為丁香酚(南京中醫(yī)藥大學(xué), 2005)。地榆的主要藥用化學(xué)成分為皂苷、鞣質(zhì)和黃酮類(旻夏紅等, 2009),其中皂苷有止血和造血作用(Sun et al, 2012; 鄒文俊等, 2012)。

10種中藥雙聯(lián)用復(fù)方的體外抑菌效果研究表明,有協(xié)同作用的復(fù)方有7種。進(jìn)一步研究4種中藥三聯(lián)用對(duì)類志賀鄰單胞菌的體外抑菌效果, 其中1種三聯(lián)用復(fù)方有協(xié)同的抑菌作用, 另外3種三聯(lián)用復(fù)方有相加的抑菌作用。表明中藥的合理聯(lián)用在一定程度上可以提高藥物之間的協(xié)同作用, 降低單味中藥的使用量, 增加藥效, 比如五倍子復(fù)方A中三味中藥的劑量比單用時(shí)分別降低了 87.5%, 75%和 75%。雙聯(lián)用五倍子復(fù)方1有顯著協(xié)同作用。五倍子復(fù)方1中兩味中藥主要抗菌成分不同, 分別為鞣質(zhì)和皂苷, 它們的抗菌機(jī)理也不相同, 將這兩味中藥進(jìn)行聯(lián)用就可以多位點(diǎn)、多途徑攻擊致病細(xì)菌的細(xì)胞, 提高藥物的殺傷力, 同時(shí)加快修復(fù)受損的組織和器官(李忠琴等,2012), 這樣不僅可以提高每味中藥的抗菌活性, 而且在較低濃度下就能夠起到抑制或殺滅細(xì)菌的作用。而三聯(lián)用五倍子復(fù)方A相比雙聯(lián)用五倍子復(fù)方 1添加了石榴皮, 石榴皮中的主要成分為鞣質(zhì), 安石榴苷甙(Punicalagin)是石榴皮鞣質(zhì)的主要成分(朱靜,2009)。鞣質(zhì)成分的增加, 起到了協(xié)同抑菌作用。復(fù)方不但能夠有效降低單味中藥的使用劑量, 降低經(jīng)濟(jì)成本, 而且可以達(dá)到更好的抑菌效果。中藥復(fù)方相對(duì)西藥具有藥殘小、天然、環(huán)保和不易產(chǎn)生耐藥性等眾多優(yōu)點(diǎn), 已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物病害防治研究中的熱點(diǎn)。同時(shí)中藥的推廣使用是符合目前健康養(yǎng)殖新形勢(shì)和無公害水產(chǎn)品開發(fā)的要求的。

4 結(jié)論

本研究從發(fā)病的鰻鱺養(yǎng)殖新種類太平洋雙色鰻鱺中分離得到一株優(yōu)勢(shì)菌AMSH1。經(jīng)BIOLOG微生物鑒定系統(tǒng)和16S rDNA序列分析鑒定該菌株為類志賀鄰單胞菌, 通過人工回歸感染試驗(yàn)表明該菌株具有致病性, 半致死量 LD50為 3.2×105CFU/g。中藥敏感性研究表明含有五倍子成分的 4種中藥雙聯(lián)用復(fù)方和 1種三聯(lián)用復(fù)方對(duì)類志賀鄰單胞菌有較好的協(xié)同抑制作用。本研究結(jié)果可為太平洋雙色鰻鱺類志賀鄰單胞菌病的防治提供參考。

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