藍(lán)昭軍 李 強(qiáng) 舒 琥 谷平華 王杭軍 吳土金
(1. 韶關(guān)市漁業(yè)技術(shù)推廣站, 韶關(guān)市水產(chǎn)研究所 韶關(guān) 512006; 2. 廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510006)
光倒刺 鲃 (Spinibarbus hollandi)隸屬于鯉形目(Cypriniformes), 鯉科(Cyprinidae), 鲃亞科(Barbinae),倒刺 鲃 屬(Spinibarbus), 俗稱青娟、鰹中、坑娟等, 分布于長(zhǎng)江、錢塘江、閩江、九龍江、珠江、元江、臺(tái)灣島及海南島等諸水系(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所等, 1991; 樂佩琦, 2000)。 光倒刺 鲃 體厚肉肥,味鮮嫩, 是一種重要的經(jīng)濟(jì)魚類。目前, 隨著光倒刺鲃的人工馴養(yǎng)及繁育技術(shù)獲得成功(羅欽洪等, 1999)及多年的推廣養(yǎng)殖, 光 刺倒 鲃 已成為華南及華東等地重要的養(yǎng)殖魚類之一。了解其種群遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)等方面的特征, 可為其種質(zhì)資源的保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。然而, 目 前有關(guān)光倒刺 鲃 群體遺傳多樣性、遺傳結(jié)構(gòu)及親緣地理等方面的研究較少(唐瓊英等, 2003; 黃種持等, 2008), 且已有研究所涉及的種群較少。
線粒體DNA(mtDNA)遵循嚴(yán)格的母系遺傳, 無遺傳重組, 通常能夠全面反映種群內(nèi)和種群間的遺傳變異, 這對(duì)于探討種群遺傳結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系具有很高的價(jià)值(郭新紅等, 2004), 因此被廣泛用于探討種群遺傳結(jié)構(gòu)或有機(jī)體變異歷史(肖武漢等,2000; Liuet al, 2004), 且在水生動(dòng)物群體遺傳學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用(劉云國, 2009)。在線粒體DNA中, 細(xì)胞色素b基因(Cytb)是線粒體13 個(gè)蛋白編碼基因中結(jié)構(gòu)和功能被研究得最為清楚的基因之一, 且進(jìn)化速度適中, 適合種群水平差異的檢測(cè)(Mayeret al, 1990)。本研究中, 作者在中國南方采集了8個(gè)水系的光倒刺鲃樣本, 對(duì)其線粒體Cytb基因序列進(jìn)行了測(cè)定與分析, 旨在更全面地了解其遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu), 為其保護(hù)和利用提供科學(xué)依據(jù)。
本研究所用樣品均為2015年7—12月采自廣西壯族自治區(qū)、廣東省、湖南省、江西省、福建省和浙江省等地。將所有個(gè)體按所采樣的水系進(jìn)行種群劃分,即用水系名稱對(duì)種群進(jìn)行命名。具體的采樣點(diǎn)見圖1, 各采樣點(diǎn)樣品信息見表1。
圖1 光 倒刺 鲃 各水系的采樣點(diǎn)圖Fig.1 Sampling sites for S. hollandi
表1 光倒刺鲃的樣品信息及基于Cyt b基因的遺傳多樣性分析Tab.1 Sampling localities, numbers and genetic diversity of Cyt b gene of S. hollandi in different areas
基因組 DNA的提取參考慶寧等(2010)的方法,即采用從生工生物工程(上海)股份有限公司購買的“基因組 DNA 抽提試劑盒”所示方法, 略有改動(dòng)。PCR反應(yīng)體系: 反應(yīng)體系約 25μL, 按順序分別將PCR Master Mix12.5μL、Primer F 1μL、Primer R 1μL、模板 DNA 3μL及滅菌雙蒸水 7.5μL混合, 每一次反應(yīng)都用ddH2O代替模板DNA做陰性對(duì)照。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在TaKaRa(TP600型)PCR儀上進(jìn)行, 具體擴(kuò)增程序如下: ①95°C 預(yù)變性 3min, ②94°C 變性 30s, ③58°C退火 30s, ④72°C延伸 80s, 重復(fù)步驟②—④35次; 最后72°C延伸10min。利用Primer Primer 5軟件設(shè)計(jì)PCR及測(cè)序所用引物 L14322和 H15638, 由生工生物工程(上海)股份有限公司合成, 其序列分別為:L14322: 5′-ACTGAGACCAATGATTTGAAGAAC-3′;H15638: 5′-TTAGAACTCTGGCTT TGGGAG -3′。PCR產(chǎn)物用 1%瓊脂糖電泳檢驗(yàn)?zāi)康钠魏? 由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行純化并測(cè)序。
對(duì)測(cè)得的序列使用Clustal X 1.81 軟件進(jìn)行排序比對(duì), 并輔以人工校對(duì)。利用軟件 MEGA 5.0的Kimura’s two-parameter模型計(jì)算種群間的遺傳距離,并采用鄰接法(Neighbor-joining method, NJ)構(gòu)建分支系統(tǒng)樹(Kumaret al, 2008)。利用 Mrbayes 3.1.2 和Modeltest v3.7 構(gòu)建貝葉斯樹。用軟件DNAsp 5.0統(tǒng)計(jì)各種群的核苷酸多樣性(Nucleotide diversityπ)與單倍型多樣性(Haplotype diversityh)(Libradoet al, 2009);并利用該軟件進(jìn)行錯(cuò)配分布(Mismatch- distribution)分析及Tajima’sD和Fu’s Fs檢驗(yàn), 以檢驗(yàn)種群是否發(fā)生過擴(kuò)張。使用Network 5 軟件, 以Median-joining法構(gòu)建各單倍型之間的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系圖。利用Arlequin Ver 2000軟件進(jìn)行分子變異分析(AMOVA), 分析種群間與地理區(qū)間遺傳變異程度(Excoffier et al, 1992)。
本研究共得到191尾 光 倒刺 鲃 的Cytb基因全序列, 序列長(zhǎng)1141bp, 無堿基的插入或缺失, Cytb基因所有序列中, 共51個(gè)變異位點(diǎn), 約占全序列的4.47%,其中4個(gè)為單個(gè)多態(tài)位點(diǎn), 47個(gè)為簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。在Cytb序列中A、C、T、G平均含量分別為29.4%、27.8%、28.5%和14.4%, G的含量明顯低于其他三種堿基含量, 表現(xiàn)出很強(qiáng)的堿基組成偏向性。
在191尾樣本中, 共檢測(cè)出了16個(gè)單倍型, 單倍型多樣性為 0.761, 核苷酸多樣性為 0.0120。單倍型多樣性(h)分析表明(表 1), 北江、柳江及資江種群的單倍型多樣性顯著地高于其他種群, 均在0.500以上,其他種群的單倍型多樣性較低, 其中錢塘江種群只有一個(gè)單倍型,h值為0; 而在核苷酸多樣性方面, 北江、贛江及九龍江種群較其他種群高,π值均在0.005以上, 而東江、郁江、柳江、資江、九龍江及錢塘江的核苷酸多樣性較低,π值均在0.001以下, 其中錢塘江的π值為0。
在所有 16個(gè)單倍型中, 有4個(gè)為兩個(gè)或兩個(gè)以上種群共享的單倍型, 其中, 北江、郁江及柳江種群共享單倍型 H1, 北江、東江及贛江種群共享單倍型H2, 郁江及柳江種群共享單倍型 H8, 贛江、九龍江及錢塘江種群共享單倍型H11。
表2 顯示了不同水系的光倒刺 鲃 基于Cytb基因的遺傳距離和遺傳分化指數(shù)。由表2可知, 東江種群與北江種群的遺傳關(guān)系較近, 兩者的遺傳距離為0.0127, 但北江及東江種群與其他種群的遺傳距離均相對(duì)較高, 北江種群與其他種群的遺傳距離均大于0.0150, 而東江種群與其他種群的遺傳距離均大于0.0200; 除了北江及東江種群外, 其他種群間的遺傳距離均相對(duì)較低, 其中贛江、資江、九龍江及錢塘江兩兩之間的遺傳距離均小于0.0100。
在遺傳分化指數(shù)方面, 北江種群與其他種群的遺傳分化指數(shù)均較低; 東江種群除了與北江種群遺傳分化指數(shù)較低外, 與其他種群均較高; 錢塘江種群除與北江、贛江及九龍江的遺傳分化指數(shù)較低外, 與其他種群均較高。
表2 不同水系的光倒刺鲃Cyt b基因遺傳距離(對(duì)角線下方)和遺傳分化指數(shù)(%, 對(duì)角線上方)Tab.2 Genetic distance(below diagonal)and genetic variation value (above diagonal) of Cyt b gene of S. hollandi between different drainage systems
為更好地了解光倒刺 鲃 各種群之間的親緣關(guān)系, 利用鄰接法(NJ)對(duì)16個(gè)單倍型進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析, 構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(圖 1), 以 Mrbayes 3.1.2構(gòu)建的貝葉斯樹與 NJ樹的結(jié)果基本一致。在光倒刺 鲃 各種群間, 聚成Ⅰ和Ⅱ兩支。資江、錢塘江、郁江和柳江的全部樣本以及北江、贛江和九龍江的部分樣本組成了Ⅰ支, 而東江水系的全部樣本及北江、贛江和九龍江水系的部分樣本則組成了Ⅱ支。在Ⅰ支中, 又可分為A和B兩個(gè)姐妹群。A群全部為珠江水系的樣本, 包含了柳江、郁江的全部樣本及北江的部分樣本; B群則包含了資江、錢塘江的全部樣本及贛江和九龍江的大部分樣本。在支系Ⅱ中, 又可分為C和D兩個(gè)姐妹群。C群為九龍江的兩尾樣本; D群則為東江種群的全部樣本及北江、贛江種群的部分樣本。
圖2 光 倒刺 鲃 種群基于Cyt b基因的NJ樹Fig.2 Neighbor-joining tree of S. hollandi populations based on Cyt b gene
圖2 顯示了光倒刺 鲃 基于Cyt b基因的單倍型網(wǎng)絡(luò)親緣關(guān)系, 珠江水系的北江、柳江及郁江種群與長(zhǎng)江水系資江和贛江種群的親緣關(guān)系十分密切, 兩者各個(gè)單倍型之間的變異不大; 北江、東江及贛江種群的親緣關(guān)系亦較為密切, 三者存在共享單倍型; 贛江、九龍江及錢塘江種群共享單倍型H11與資江種群的單倍型變異僅 3—4步, 親緣關(guān)系亦較近。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖還揭示, 北江種群的特有單倍型H6與北江、東江、贛江共享的單倍型H2之間的變異達(dá)29步, H6與九龍江的特有單倍型 H16的變異達(dá) 28步, H2與H16的變異達(dá) 15步, 表明這些種群的單倍型間發(fā)生了較顯著的遺傳分化。
為了解 光 倒刺 鲃 種群分子變異的分布模式, 根據(jù)水系的不同將光倒刺 鲃 種群分成4個(gè)地理區(qū), 進(jìn)行分子變異分析(AMOVA)。其中珠江水系為一地理區(qū), 包括西江支流柳江、郁江、北江及東江; 長(zhǎng)江水系為一地理區(qū), 包括資江及贛江; 九龍江為一地理區(qū); 錢塘江為一個(gè)地理區(qū)。AMOVA分析分析表明, 光 倒刺 鲃 地理區(qū)之間變異占 1.61%, 地理區(qū)內(nèi)種群間約占 56.47%, 種群內(nèi)的變異占 45.14%(表3)。 這說明光倒刺 鲃 地理區(qū)之間的分化變異率低,其Cyt b基因的遺傳分化主要來自地理區(qū)內(nèi)的種群之間及種群內(nèi)。
圖 3 基于Cyt b 基因的光倒刺 鲃 種群?jiǎn)伪缎途W(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 The haplotype network of Cyt b sequences of S. hollandi populations
對(duì)所有種群進(jìn)行錯(cuò)配分析發(fā)現(xiàn), 其種群動(dòng)態(tài)呈現(xiàn)多峰分布; 而中性檢驗(yàn)也顯示, 全部種群的Fu’s Fs和Tajima’s D值均沒有呈現(xiàn)顯著的負(fù)值, 表明其在歷史上沒有發(fā)生過明顯的擴(kuò)張。
表3 光倒刺鲃分子變異分析Tab.3 Analysis on molecular variance among populations of S.hollandi
在各種群中, 除北江和錢塘江種群外,Tajima’sD值均為負(fù)值, 但其統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)均不顯著(P>0.05); 而在Fu’s Fs檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)中, 除郁江種群的Fu’s Fs值為顯著的負(fù)值(0.01<P<0.05)外, 其余種群為正值或?yàn)樨?fù)值但統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)不顯著。在錯(cuò)配分析(Mismatch-distribution)中, 各種群的歧點(diǎn)分布分析圖譜均呈現(xiàn)多峰型。因此, 綜合Tajima’sD檢驗(yàn)、Fu’s Fs 檢驗(yàn)及錯(cuò)配分析的結(jié)果, 說明這些種群相對(duì)穩(wěn)定, 沒有發(fā)生過擴(kuò)張。
表4 光倒刺鲃種群基于Cyt b基因的Tajima’s D 和Fu’s Fs 檢驗(yàn)Tab.4 Tajima’s D and Fu’s Fs test of S. hollandi populations based on Cyt b gene
遺傳多樣性即基因多樣性, 存在于生物個(gè)體內(nèi)、單個(gè)物種內(nèi)以及物種間, 是適應(yīng)性和進(jìn)化的基礎(chǔ), 種內(nèi)的遺傳多樣性與該物種對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力呈正向線性關(guān)系(胡靜等, 2014)。從遺傳和進(jìn)化角度看, 一個(gè)物種的遺傳多樣性與其適應(yīng)能力、生存能力和進(jìn)化潛力等密切相關(guān)(孫鵬等, 2011; 陳竹等, 2011)。豐富的遺傳多樣性可以維持種群的多樣性, 其表現(xiàn)出來的遺傳多樣性也越豐富, 對(duì)環(huán)境的適應(yīng)能力就越強(qiáng), 越容易擴(kuò)展分布范圍和新的生存環(huán)境, 而遺傳多樣性的貧乏或缺失會(huì)威脅到種群的生存(沈浩等, 2001)。單倍型間的核苷酸多態(tài)性(π) 和平均遺傳距離是衡量一個(gè)種群 mtDNA遺傳變異的兩個(gè)重要指標(biāo)(周慧等, 2006)。由于π值考慮各種mtDNA 單倍型在群體中所占比例的特性, 故其更能精確的揭示一個(gè)群體的mtDNA 的多態(tài)程度(肖明松等, 2013)。
在本研究中, 北江、贛江及九龍江種群的π值在0.005以上, 其中北江種群最高, 達(dá)0.0136; 而東江、郁江、柳江、資江、九龍江及錢塘江的核苷酸多樣性較低, 均在0.001以下, 其中錢塘江種群的π值為0。除北江、贛江和九龍江種群外, 其他種群均表現(xiàn)出了較低的核苷酸多樣性或單倍型多樣性。黃種持等(2008)基于cytb基因?qū)M江、九龍江、漓江等三個(gè)光倒刺 鲃 種群的研究亦表明其遺傳多樣性相對(duì)較低。這說明光倒刺 鲃 目前的遺傳多樣性較低。
造成此現(xiàn)象的原因之一可能是光倒刺 鲃 資源遭到了較嚴(yán)重的人為破壞, 導(dǎo)致遺傳多樣性降低。一方面, 光 倒刺 鲃 目前已成為一種重要養(yǎng)殖魚類, 然而目前其苗種來源仍以捕撈江河苗種為主, 導(dǎo)致補(bǔ)充群體數(shù)量嚴(yán)重不足, 且親本數(shù)量由于捕撈而日益減少,使其遺傳多樣性降低。另一方面, 隨著各個(gè)流域大量各種規(guī)格水利工程的建設(shè), 造 成光倒刺 鲃 的棲息地嚴(yán)重萎縮且成片段化、破碎化分布, 阻隔了其基因交流, 導(dǎo)致遺傳多樣降低。貧乏的遺傳多樣性必將給物種種質(zhì)資源的保護(hù)和利用帶來不利影響(肖志忠等,2013), 而最大限度地維持種內(nèi)遺傳多樣性水平, 是持續(xù)利用種質(zhì)資源的前提和基礎(chǔ)(韓承慧等, 2016)。因此, 應(yīng) 加強(qiáng)對(duì)光倒刺 鲃 種質(zhì)資源的保護(hù), 根據(jù)本研究的結(jié)果, 可將北江、贛江及九龍江種群作為重點(diǎn)保護(hù)單元。
本研究結(jié)果顯示, 在珠江水系中, 東江種群與北江種群的遺傳關(guān)系較近, 兩者的遺傳距離為 0.0127,但東江種群與西江水系支流郁江和柳江種群的遺傳距離分別為0.0279和0.0274, 大于東江與贛江、資江、九龍江和錢塘江的遺傳距離, 而系統(tǒng)樹和單倍型網(wǎng)絡(luò)圖均得出了類似的結(jié)果。這表明東江種群與西江種群存在較大的遺傳分化。這與斑 鱯 (Hemibagrus guttatus)(Yanget al, 2008)、寬鰭鱲(Zacco platypus)(梁曉旭等, 2010)等魚類不同, 這些魚類西江、北江及東江種群間的遺傳分化不大。從目前珠江水系三大支流的聯(lián)系來看, 除了西江和北江在廣東三水通過思賢滘連通之外, 東江被獅子洋將其與其他兩條支流隔離。因此, 造成東江種群與北江種群關(guān)系相對(duì)較近而與西江種群關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)的原因可能為在間冰期時(shí)由于海平面上升東江與北江隔離, 使得東江種群與北江、西江種群發(fā)生了分化, 而這三條河流在冰期海平面大幅下降的時(shí)候發(fā)生了匯聚(Wang et al, 1999;Liu et al, 2003), 使得東江與北江的種群得以交流。另一方面, 從單倍型分布特征及單倍型網(wǎng)絡(luò)圖可知, 東江水系種群與贛江水系種群存在共享單倍型, 而與九龍江種群的部分個(gè)體雖存在一定的遺傳分化(約 15步), 但兩者間的親緣關(guān)系較東江與西江、資江及錢塘江種群近。據(jù)此, 我們推測(cè)東江水系與九龍江水系種群有著較近的親緣關(guān)系, 而隨著華南大陸東部的蓮花山脈的隆起, 兩者間逐漸發(fā)生了分化; 而東江水系與贛江水系緊鄰, 水系間的襲奪及連接事件可促進(jìn)種群間的基因交流, 使得東江水系種群與贛江水系種群部分個(gè)體存在較近的親緣關(guān)系。這說明東江種群與其流域兩側(cè)水系的種群既存在一定程度的隔離,又存在著基因交流。這可從東江水系魚類組成特征得到印證: 東江水系既有珠江水系特有魚類, 如沙花鰍(Cobitis arenae)(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所等, 1991)、北江光唇魚(林小濤等, 2013)等; 亦有與韓江及九龍江等水系共同特有的魚類, 如裸腹原纓口鰍(Vanmanenia gymnetrus)(葉富良等, 1991)、帶刺光唇魚(Acrossocheilus spinifer)(藍(lán)昭軍等, 2015)等;還有東江水系特有的魚類, 如 三線擬 鲿 (Pseudobagrus trilineatus)、 白線紋胸 鮡 (Glyptothorax pallozonum)等(葉富良等, 1991; 褚新洛等, 1999)。
NJ樹及單倍型網(wǎng)絡(luò)圖還顯示, 西江及北江種群與長(zhǎng)江水系的資江及贛江水系種群親緣關(guān)系較近,與馬口魚(Opsariichthys bidens) (Li et al, 2009)和大鰭鳠(Hemibagrus macropterus)(Yang et al, 2009)等魚類有相似之處。但 NJ樹亦顯示, 光 倒刺 鲃 西江及北江種群與長(zhǎng)江水系的資江及贛江水系種群分別位于不同的分支, 說明它們之間存在一定的遺傳分化, 其原因可能是南嶺山脈的隔離。有研究表明, 南嶺山脈在11.06—8.04百萬年前已經(jīng)形成(地質(zhì)礦產(chǎn)部《南嶺項(xiàng)目》構(gòu)造專題組, 1988)。南嶺的隆起, 限制了其南北兩側(cè)水系種群的基因交流, 使得其兩側(cè)的種群產(chǎn)生了一定程度的遺傳分化。
此外, 單倍型分布特征、系統(tǒng)發(fā)育分析及單倍型網(wǎng)絡(luò)圖均顯示贛江種群與九龍江、錢塘江種群之間的親緣關(guān)系較近。黃種持等(2008)的研究也顯示贛江與九龍江種群有著很近的親緣關(guān)系。造成此現(xiàn)象的原因可能是長(zhǎng)江水系與九龍江、錢塘江等東南沿海水系發(fā)生過襲奪或者連接, 促進(jìn)了這些種群間的基因交流。
根據(jù)單倍型分布的特征、單倍型網(wǎng)絡(luò)圖及NJ樹,可發(fā)現(xiàn)光倒刺 鲃 種群可分為兩支, 東江種群與西江種群之間的遺傳分化較大, 大于西江種群與長(zhǎng)江、錢塘江等種群的遺傳分化。而且, 在兩個(gè)支系中均含有北江水系的樣本, 即北江水系內(nèi)部不同個(gè)體存在較大的遺傳差異, 表明可能存在二次接觸事件。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖還顯示, 珠江水系的單倍型多位于網(wǎng)絡(luò)圖的中央。
據(jù)此, 我 們推測(cè)光倒刺 鲃 存在兩個(gè)擴(kuò)散中心: 北江、西江水系擴(kuò)散中心及東江水系擴(kuò)散中心。其擴(kuò)散路徑為: 西江及北江水系的種群往北向長(zhǎng)江水系擴(kuò)散, 長(zhǎng)江種群爾后往華東沿海的錢塘江及九龍江等水系擴(kuò)散; 東江水系的種群擴(kuò)散路徑可分為三支, 一支往北向長(zhǎng)江水系擴(kuò)散, 一支往東向北江水系擴(kuò)散,一支往西向九龍江等水系擴(kuò)散, 九龍江水系的種群爾后由于蓮花山隆起造成隔離, 與東江水系種群發(fā)生了一定程度的遺傳分化。
本研究基于線粒體Cyt b 基因分析光倒刺 鲃 的遺傳多樣性和群體遺傳結(jié)構(gòu), 為其種質(zhì)資源的遺傳多樣性評(píng)估、保護(hù)利用提供了科學(xué)依據(jù)。經(jīng)過遺傳多樣性分析顯示, 除北江、贛江和九龍江種群外, 其他種群均表現(xiàn)出了較低的核苷酸多樣性或單倍型多樣性。這對(duì) 光 倒刺 鲃 的保護(hù)和合理利用是十分不利的, 故應(yīng)加強(qiáng)對(duì)光倒刺 鲃 種質(zhì)資源的保護(hù), 建議將北江、贛江及九龍江種群作為重點(diǎn)保護(hù)單元。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分析、單倍型網(wǎng)絡(luò)分析, 光 倒刺 鲃 種群可劃分為兩支,據(jù)此我們推測(cè) 光 倒刺 鲃 存在兩個(gè)擴(kuò)散中心: 北江、西江水系擴(kuò)散中心及東江水系擴(kuò)散中心。本研究結(jié)果為了解光倒刺 鲃 的遺傳結(jié)構(gòu)和親緣地理模式提供了科學(xué)依據(jù)。
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