青魚(yú)(Mylopharyngodon piceus)新發(fā)病病原類(lèi)志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)的分離鑒定*

葉 鍵 劉曉寧 王 曉 徐 慧 沈文英 高敏杰 章曉棟①

(1. 紹興文理學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 紹興 312000; 2. 杭州市水產(chǎn)技術(shù)推廣總站 杭州 310001; 3. 杭州大江東產(chǎn)業(yè)集聚區(qū)農(nóng)業(yè)局 杭州 311222; 4. 紹興出入境檢驗(yàn)檢疫局 紹興 312000)

青魚(yú)(Mylopharyngodon piceus)亦稱(chēng)黑鯇、螺螄青, 屬硬骨魚(yú)綱、鯉科魚(yú)類(lèi)。個(gè)體大, 生長(zhǎng)迅速, 最大個(gè)體可達(dá)70kg, 肉味美。分布于中國(guó)各大水系, 主產(chǎn)于長(zhǎng)江以南平原地區(qū), 為中國(guó)主要淡水魚(yú)類(lèi)養(yǎng)殖對(duì)象, 是我國(guó)淡水養(yǎng)殖的“四大家魚(yú)”之一(Li et al,1995)。近年來(lái)由于環(huán)境、飼料、養(yǎng)殖管理等因素導(dǎo)致的青魚(yú)病害問(wèn)題不斷, 已經(jīng)報(bào)道的可引發(fā)青魚(yú)大規(guī)模病害的主要病原菌有嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)等(Wang et al, 2009; 張波等, 2010), 尤其是前者容易引起急性暴發(fā), 造成青魚(yú)大規(guī)模死亡。由于兩者均可引發(fā)其它大宗淡水魚(yú)類(lèi)死亡, 因而對(duì)青魚(yú)的感染及致病機(jī)理研究不深入。目前專(zhuān)門(mén)針對(duì)青魚(yú)病害的研究涉及較少, 由類(lèi)志賀鄰單胞菌引發(fā)的青魚(yú)病害也未見(jiàn)報(bào)道。

2015年8月, 杭州市一養(yǎng)殖場(chǎng)青魚(yú)暴發(fā)病情, 發(fā)病魚(yú)不分個(gè)體大小, 行動(dòng)緩慢, 反應(yīng)遲鈍, 常離群獨(dú)游; 體表出現(xiàn)潰爛, 位置不一; 解剖可見(jiàn)腸道充血,腎臟腫大, 呈紫紅色, 日死亡率達(dá)5%以上。本實(shí)驗(yàn)自病癥典型患病魚(yú)體內(nèi)分離到1株可疑菌株, 經(jīng)生化和分子生物學(xué)方法鑒定其為類(lèi)志賀鄰單胞菌, 并進(jìn)一步通過(guò)回歸感染確定了其病原性, 同時(shí)檢測(cè)了其毒力和藥物敏感性, 為生產(chǎn)中正確預(yù)防及治療該菌的感染提供了科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

藥敏紙片購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;Premix Ex Taq, PCR產(chǎn)物純化試劑盒購(gòu)自TaKaRa公司(日本); 細(xì)菌基因組抽提試劑盒購(gòu)自 Qiagen公司(德國(guó)); 健康青魚(yú)(1000—1200g)購(gòu)自杭州市某青魚(yú)養(yǎng)殖場(chǎng), 體表無(wú)傷, 隔天喂食, 養(yǎng)殖一周確認(rèn)健康后用于致病性實(shí)驗(yàn); 40日齡SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠購(gòu)自浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 病原菌分離及保存

將患病的青魚(yú)用 75%的酒精進(jìn)行體表消毒處理,用手術(shù)刀刮除潰爛處腐肉后, 從肌肉處分離接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上; 解剖后從肝臟、腎臟處分離接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)基置于37°C培養(yǎng)36 h,挑取優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行分離純化, 然后接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂上培養(yǎng)。同時(shí)將純化后的菌液加入等體積的20% (V/V)甘油, 于–80°C超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌形態(tài)及生理生化特性檢測(cè)

將細(xì)菌菌株純化培養(yǎng)后, 經(jīng)涂片、固定和革蘭氏染色后, 使用光學(xué)顯微鏡觀察。用等滲的無(wú)菌生理鹽水洗下菌苔, 在JSM-6360LV掃描電鏡進(jìn)行觀察。對(duì)分離菌株用 API ID32E系統(tǒng)(Biomerieux, 法國(guó))進(jìn)行生化鑒定。

1.4 16S rDNA的PCR 擴(kuò)增、測(cè)序和分析

以細(xì)菌基因組為模板, 應(yīng)用16S rRNA通用引物(8F: 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′; 1492R: 5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物用 PCR產(chǎn)物純化試劑盒回收后, 交Invitrogen公司測(cè)序。將測(cè)序所得到菌株 16S rRNA序列通過(guò)NCBI的Blast檢索系統(tǒng)進(jìn)行序列同源性分析。選取同源性較高的同種菌株的 16S rRNA序列,設(shè)置外群, 使用 MEGA4.0軟件, 采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。通過(guò)自舉分析進(jìn)行置信度檢測(cè), 自舉數(shù)集1000次。

1.5 藥敏實(shí)驗(yàn)

采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行細(xì)菌藥敏性試驗(yàn),培養(yǎng)24h的細(xì)菌以無(wú)菌生理鹽水洗下, 制備成濃度約1×107CFU/mL, 均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上, 用無(wú)菌鑷子將藥敏紙片均勻貼在平板上, 37°C培養(yǎng)24h后測(cè)量抑菌圈直徑。

1.6 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

取純化的菌株劃線接種于LB平板, 30°C下培養(yǎng)18h。用生理鹽水將菌苔洗下, 稀釋成四個(gè)濃度的細(xì)菌懸液: 1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/mL,用于感染試驗(yàn)。

1.6.1 細(xì)菌回歸實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)用青魚(yú)在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前48h停食。將青魚(yú)分為兩組, 每組10條。陽(yáng)性組每條青魚(yú)注射0.1mL菌液; 陰性組每只注射0.1mL生理鹽水?？刂扑疁貫?8°C, 期間充氧, 不換水。感染后記錄發(fā)病死亡情況。死亡魚(yú)進(jìn)行解剖, 隨機(jī)選取兩條進(jìn)行病原菌分離鑒定。

1.6.2 毒力實(shí)驗(yàn) 健康小鼠25只平均分成5個(gè)組。4個(gè)陽(yáng)性組每只小鼠腹腔注射0.1mL菌液, 菌液濃度分別為 1.0×106、1.0×107、1.0×108、1.0×109CFU/mL。陰性對(duì)照組小鼠每只注射0.1 mL無(wú)菌生理鹽水。觀察記錄發(fā)病和死亡情況, 并用改良寇氏法計(jì)算LD50值。

2 結(jié)果

2.1 菌株形態(tài)

分離菌株培養(yǎng)18h后形成的菌落低凸, 圓形, 直徑 1—2mm, 邊緣光滑, 表面濕潤(rùn)(圖 1), 有刺激性氣味。光鏡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)分離菌株革蘭氏染色為陰性, 短鏈狀桿菌, 呈單個(gè)或成對(duì)分布。透射電鏡觀察, HZ2015菌株呈末端圓形直桿狀, 無(wú)芽孢和莢膜, 兩端有叢生鞭毛, 大小(短徑×長(zhǎng)徑)為 0.7—0.9μm×1.5μm (圖 2)。

圖1 營(yíng)養(yǎng)瓊脂上菌落形態(tài)Fig.1 Arrangement of the colonies shown on nutrient agar

圖2 菌株透射電鏡圖像Fig.2 TEM image of the strain

2.2 病原菌的生化鑒定

ATB ID 32E生化鑒定系統(tǒng)表明(表1), HZ2015屬于類(lèi)志賀鄰單胞菌屬, 準(zhǔn)確率為99.9%。

表1 病原菌的生化特征Tab.1 Major biochemical characteristics of the pathogenic bacteria strains

2.3 分離菌株的16S rRNA基因序列測(cè)定與分析

將測(cè)序所得序列輸入到 NCBI進(jìn)行 Blast檢索,發(fā)現(xiàn)菌株HZ2015與類(lèi)志賀鄰單胞菌自然聚類(lèi), 同源性百分比 98.5%—99.9%。選取同源性較高的類(lèi)志賀鄰單胞菌的16S rRNA基因序列, 并以腸桿菌科的沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)、愛(ài)德華氏菌屬(Edwardsiella)和腸桿菌屬(Enterobacter)等菌株為外群, 進(jìn)行分子系統(tǒng)發(fā)育分析, 結(jié)果如圖3所示。

2.4 藥敏實(shí)驗(yàn)

對(duì)29種藥物的敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示(表2), 菌株HZ2015對(duì)頭孢哌酮、頭孢呋辛、慶大霉素、卡那霉素、先鋒霉素 5、先鋒霉素 6、復(fù)達(dá)欣、新霉素、強(qiáng)力霉素、美滿(mǎn)霉素、多粘霉素B和呋喃唑酮高度敏感;對(duì)青霉素、苯唑西林、氨芐西林、頭孢曲松、萬(wàn)古霉素、羧芐西林、和頭孢氨芐耐藥。

圖3 菌株HZ2015 16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain HZ2015 based on 16S rRNA gene sequence

表2 藥物敏感性試驗(yàn)Tab.2 Results of test for antibiotic susceptibility

2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

2.5.1 細(xì)菌回歸實(shí)驗(yàn) 結(jié)果顯示, 水溫升高至28°C, 感染后 36h, 開(kāi)始出現(xiàn)死亡, 到第 48小時(shí), 死亡率最高達(dá) 100%, 而對(duì)照組死亡率均為 0(表 3), 病死魚(yú)呈現(xiàn)出與自然發(fā)病類(lèi)似的癥狀(圖 4), 表現(xiàn)為體表潰爛, 腸道充血腫脹, 腎臟腫大。從死亡青魚(yú)的肝臟、肌肉等組織均能分離到形態(tài)一致的菌落, 對(duì)其進(jìn)行生化鑒定和16S rDNA同源性比對(duì), 結(jié)果顯示為同一菌株。

表3 回歸感染試驗(yàn)Tab.3 Results of artificial infection test

圖4 病魚(yú)體表潰爛Fig.4 Ulcerated body surface of diseased fish

2.5.2 毒力實(shí)驗(yàn) 小鼠于接種菌液后 12h開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀, 高劑量組小鼠在接種后 24h大量死亡,其它組死亡高峰出現(xiàn)在接種后48h (表4)。根據(jù)改良寇氏法計(jì)算, 菌株HZ2015 LD50值為106.6CFU/mL。

表4 HZ2015細(xì)菌毒力實(shí)驗(yàn)Tab.4 Pathogenic test of strain HZ2015 in mice

3 討論

青魚(yú)屬大宗淡水性魚(yú)類(lèi), 肉厚且嫩, 味鮮美, 富含脂肪, 刺大而少, 是淡水魚(yú)中的上品。目前青魚(yú)的研究結(jié)果主要集中于養(yǎng)殖及繁育技術(shù)、營(yíng)養(yǎng)需求等,而疾病學(xué)研究方面涉及較少, 已經(jīng)明確的病害, 很多也是作為與其它大宗淡水魚(yú)類(lèi)共有的疾病來(lái)研究,此次青魚(yú)的病害事件表明, 類(lèi)志賀鄰單胞菌對(duì)青魚(yú)的危害極大, 無(wú)論幼魚(yú)、成魚(yú)都無(wú)法幸免, 一定程度上威脅著青魚(yú)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。本研究從具有典型臨床癥狀的發(fā)病青魚(yú)腎臟分離到菌株 HZ2015, 經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定顯示該菌株為類(lèi)志賀鄰單胞菌,同時(shí)通過(guò)16S rDNA序列同源性分析, 構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù), 發(fā)現(xiàn)與類(lèi)志賀鄰單胞菌的同源性為 98.5%—99.9%。人工感染實(shí)驗(yàn)表明其對(duì)青魚(yú)具有較強(qiáng)的致病性, 感染魚(yú)體表潰爛, 體內(nèi)各器官不同程度損傷, 癥狀與自然發(fā)病魚(yú)類(lèi)似, 并能從肌肉和腎臟中分離到與注射菌形態(tài)及生化特性完全相同的細(xì)菌, 生化鑒定及16S rDNA同源性匹配表明為同一菌株, 從而確定該菌株HZ2015為青魚(yú)體表潰爛的致病菌。本文系類(lèi)志賀鄰單胞菌致青魚(yú)發(fā)病的首次報(bào)道。

類(lèi)志賀鄰單胞菌是一種廣泛分布在淡水環(huán)境中的細(xì)菌, 隸屬腸桿菌科, 鄰單胞菌屬, 能引起人的腹瀉, 是一種重要的腸道致病菌(Brenneretal, 2005),對(duì)3536例急性腹瀉患者的研究表明(Chenetal, 2013),7.3%的細(xì)菌性病例與類(lèi)志賀鄰單胞菌有關(guān)。類(lèi)志賀鄰單胞菌對(duì)鸕鶿的感染率較高(Matsuyamaetal, 2015),對(duì)水生動(dòng)物亦具有一定的致病力, 能引發(fā)暗紋東方鲀(Takifaguobscurus)、草魚(yú)(Ctenopharygodonidellus)、中華鱉(Trionyxsinensis)、黃顙魚(yú)(Pelteobagrus fulvidraco)、雜交鱘(Husohuso♀ ×Acipenserbaeri♂)、尼羅羅非魚(yú)(Tilapianilotica)、異育銀鯽(Carassius auratusgibelio♀ ×Cyprinuscarpio♂)、羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergiideman)、斑點(diǎn)叉尾(Ietaluruspunetaus)、亞洲龍魚(yú)(Scleropages macrocephalus)、革胡子鲇(Clariasleather)、鰻鱺(Anguillajaponica)及虹鱒(Oncorhynchusmykiss)的發(fā)病及死亡(Milleretal, 1986; 吳惠仙等, 2004; 楊鳶劼等, 2005; 潘璠等, 2007; 陸文浩等, 2009; 陳林等,2009; Salgado-Mirandaetal, 2010; Junetal, 2011;Parvezetal, 2011; Johetal, 2012; Linghametal, 2012;王小亮等, 2013; 左躍等, 2013; 胡錢(qián)東等, 2014; 劉志剛等, 2015)。尤其是對(duì)草魚(yú), 在夏秋季能引發(fā)類(lèi)似癥狀即體表潰爛(胡錢(qián)東等, 2014), 由于兩者同屬鯉形目鯉科雅羅魚(yú)亞科, 分布與赤眼鱒一起同屬東亞的單元群, 親緣關(guān)系較近, 具有較強(qiáng)的借鑒意義。該菌是否容易引發(fā)雅羅魚(yú)亞科魚(yú)類(lèi)的體表潰爛, 還需進(jìn)一步研究。

類(lèi)志賀鄰單胞菌在35—38°C溫度范圍內(nèi)生長(zhǎng)最佳(Lingham et al, 2012)。該菌對(duì)鹽度和酸堿度的適應(yīng)范圍較廣, 能在多種水體中存活, 往往在水溫較高時(shí)流行?；貧w實(shí)驗(yàn)表明, 水溫在25°C時(shí), 該菌不具備對(duì)青魚(yú)的致病性, 但水溫升高到 28°C 時(shí), 對(duì)青魚(yú)具有極強(qiáng)的毒力。我們?cè)谡{(diào)查中發(fā)現(xiàn), 該菌引起的疾病主要發(fā)生在夏季高溫季節(jié), 這一點(diǎn)與回歸實(shí)驗(yàn)的結(jié)論相一致。因此, 應(yīng)該尤其注重在高溫季節(jié)加強(qiáng)預(yù)防和控制, 合理控制飼料投喂, 改良底質(zhì)和水質(zhì), 做好水體的消毒工作。

本研究分離得到的類(lèi)志賀鄰單胞菌對(duì)頭孢哌酮、頭孢呋辛、慶大霉素、先鋒霉素、強(qiáng)力霉素等高度敏感; 對(duì)青霉素、氨芐西林、萬(wàn)古霉素、羧芐西林和頭孢氨芐等耐藥。這與以往從不同物種中得到的分離株不一致(吳惠仙等, 2004; 陸文浩等, 2009; Matsuyama et al, 2015)。尤其是從人身上分離的菌株對(duì)除氨芐青霉素外的大多數(shù)抗菌藥物敏感(Chen et al, 2013)。這可能由于地區(qū)、環(huán)境不同及接觸的藥物不同, 導(dǎo)致菌株的耐藥譜存在差異。因此, 正確治療因該菌引發(fā)的青魚(yú)疾病, 還應(yīng)在遵守《漁用藥物使用準(zhǔn)則》的同時(shí)根據(jù)藥敏試驗(yàn)得出的結(jié)果進(jìn)行施藥, 避免根據(jù)經(jīng)驗(yàn)盲目用藥。

王小亮, 徐立蒲, 曹 歡等, 2013. 鱘致病性類(lèi)志賀鄰單胞菌的鑒定及藥物敏感性. 微生物學(xué)報(bào), 53(7): 723—729

左 躍, 易 弋, 夏 杰等, 2013. 2株黃顙魚(yú)源類(lèi)志賀鄰單胞菌的分離與鑒定. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 41(9): 199—201

劉志剛, 可小麗, 盧邁新等, 2015. 尼羅羅非魚(yú)致病性類(lèi)志賀鄰單胞菌(Plesiomonas shigelloides)的分離鑒定及其病理學(xué)觀察. 微生物學(xué)報(bào), 55(1): 96—106

楊鳶 劼 , 陳 輝, 方 蘋(píng)等, 2005. 工 廠化養(yǎng)殖暗紋東方 鲀 致病菌的分離和鑒定. 湛江海洋大學(xué)學(xué)報(bào), 25(4): 18—21

吳惠仙, 薛俊增, 2004. 中華鱉出血性腸道壞死癥病原及其藥敏性. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào), 24(4): 343—345

張 波, 曾令兵, 羅曉松等, 2010. 青魚(yú)腸道出血癥病原菌的分離與鑒定. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 29(5): 607—612

陸文浩, 楊家新, 陳 輝等, 2009. 異育銀鯽類(lèi)志賀鄰單胞菌的鑒定. 淡水漁業(yè), 39(2): 48—53

陳 林, 譚愛(ài)萍, 鄒為民, 2009. 斑點(diǎn)叉尾致病菌株的鑒定及特性. 大連水產(chǎn)學(xué)院院報(bào), 24(3): 200—205

胡錢(qián)東, 林 強(qiáng), 石存斌等, 2014. 草魚(yú)致病性類(lèi)志賀鄰單胞菌的分離與鑒定. 微生物學(xué)報(bào), 54(2): 229—235

潘 璠, 方 蘋(píng), 陳 輝, 2007. 羅氏沼蝦幾種病原菌防治藥物的篩選. 水產(chǎn)養(yǎng)殖, 28(6): 39—41

Brenner D J, Krieg N R, Staley J T, 2005. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology (Vol. 2): The Proteobacteria, Part B:The Gammaproteobacteria. New York, US: Springer,740—744

Chen X, Chen Y, Yang Q et al, 2013. Plesiomonas shigelloides infection in Southeast China. PLoS One, 8(11):e77877

Joh S J, Ahn E H, Lee H J et al, 2012. Bacterial pathogens and flora isolated from farm-cultured eels (Anguilla japonica)and their environmental waters in Korean eel farms.Veterinary Microbiology, 163(1—2): 190—195

Jun J W, Kim J H, Choresca Jr C H et al, 2011. Isolation and molecular detection of Plesiomonas shigelloides containing tetA gene from Asian arowana (Scleropages formosus) in a Korean aquarium. African Journal of Microbiology Research,5(28): 5019—5021

Li S F, Lu G Q, Zhou B Y, 1995. Evaluation on the potential capacity of the swan oxbow for the conservation of the major Chinese carps. Aquaculture, 137(1—4): 46—47

Lingham T, Besong S, Ozbay G et al, 2012. Antimicrobial activity of vinegar on bacterial species isolated from retail and local channel catfish (Ictalurus punctatus). Journal of Food Processing & Technology, 4(S11): S11-001

Matsuyama R, Kuninaga N, Morimoto T et al, 2015. Isolation and antimicrobial susceptibility of Plesiomonas shigelloides from great cormorants (Phalacrocorax carbo hanedae) in Gifu and Shiga Prefectures, Japan. Journal of Veterinary Medical Science, 77(9): 1179—1181

Miller M L, Koburger J A, 1986. Tolerance of Plesiomonas shigelloides to pH, Sodium chloride and temperature.Journal of Food Protection, 49(11): 877—879

Parvez N, Rathore G, Swaminathan T R et al, 2011. Isolation and characterization of bacteria associated with ulcerative disease of the fish, Clarias gariepinus. Bulletin of Pure &Applied Sciences-Zoology, 30(2): 85—92

Salgado-Miranda C, Palomares E, Jurado M et al, 2010. Isolation and distribution of bacterial flora in farmed rainbow trout from Mexico. Journal of Aquatic Animal Health, 22(4):244—247

Wang H R, Hu Y H, Zhang W W et al, 2009. Construction of an attenuated Pseudomonas fluorescens strain and evaluation of its potential as a cross-protective vaccine. Vaccine, 27(30):4047—4055