無機砷As(V)對牟氏角毛藻(Chaetoceros mulleri)生長、葉綠素a含量及抗氧化活力的影響*

李 斌 陳亞男, 齊占會 白艷艷 徐 東 馬元慶 張 娟李煥軍① 孫 珊 何 鑫 張昀昌

(1. 山東省海洋資源與環(huán)境研究院 山東省海洋生態(tài)修復重點實驗室 煙臺 264006; 2. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院 上海201306; 3. 中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所漁業(yè)生態(tài)環(huán)境重點實驗室 廣州 510300; 4. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島 266071)

隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展, 砷及其化合物的廣泛應用導致微量砷在水體、空氣及土壤中均有發(fā)現(xiàn); 因其較高毒性而被美國環(huán)保局(USEPA)列為水源地優(yōu)先控制污染物(Rahman et al, 2012)。砷是一種較常見且持久性的污染物, 在水體中的停留時間可達 50年

(Klein, 1975), 在海洋環(huán)境中的復雜生物地球化學過程決定了其理化形態(tài)、生物利用度和毒性效應等

(Smedley et al, 2002; Karadjova et al, 2008)。人類活動所產(chǎn)生的砷隨河流或降水入海, 海水中無機砷主要以五價砷酸鹽As(V)形式存在(趙艷芳等, 2009), 因此,As(V)在生態(tài)系統(tǒng)中的生物富集、轉(zhuǎn)化及其毒理效應成為研究熱點。

海洋微藻作為海洋態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)者, 對于許多毒物比魚類、甲殼類更為敏感, 在水污染生物監(jiān)測中具有十分重要的作用(Ma et al, 2002; 梁英等,2009)。砷對藻類的毒性作用也開展了相關研究, 已開展的研究主要集中在綠藻、藍藻等對砷的生物富集和轉(zhuǎn)化、生長抑制和代謝機理等(洪華生等, 1991;Karadjova et al, 2008; 龔艷等, 2011; 樊香絨等, 2013),而對硅藻的相關研究則極少。牟氏角毛藻(Chaetoceros mulleri)屬小型海洋浮游硅藻, 是我國沿海許多港灣的優(yōu)勢硅藻種群, 也是對蝦和貝類等經(jīng)濟動物天然的優(yōu)質(zhì)餌料; 其對環(huán)境變化的快速響應能力, 是研究海洋環(huán)境變化的重要生物指標(王艷等,2010)。本文以牟氏角毛藻為試驗材料, 研究了無機砷As(V)對其磷酸鹽吸收、葉綠素 a含量、生長速率及其抗氧化活性等的影響, 初步探討了 As(V)對海洋浮游硅藻營養(yǎng)鹽吸收、生長生理及毒性作用, 以期為闡明As(V)對水產(chǎn)養(yǎng)殖安全的影響及其海洋硅藻的生物生態(tài)效應提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與材料

牟氏角毛藻(Chaetoceros mulleri)藻種由山東省海洋資源與環(huán)境研究院藻類種質(zhì)庫提供。在實驗室用f/2培養(yǎng)基進行擴大培養(yǎng), 取對數(shù)生長期藻細胞進行暴露試驗。海水取自煙臺開發(fā)區(qū)自然海井水, 經(jīng)沉淀、0.45μm 濾膜過濾和煮沸消毒, 冷卻后備用。f/2培養(yǎng)液按照文獻方法(陳明耀, 1995)配制。As(V)貯存液為砷酸根溶液標準物質(zhì)(GBW08667) [(0.233±0.005)μmol/g Na3AsO4), 購自中國計量科學研究院。

1.2 方法與步驟

1.2.1 培養(yǎng)方法和試驗設計 培養(yǎng)液采用f/2營養(yǎng)鹽配方, 在指數(shù)生長期接種。暴露試驗中, As(V)添加濃度梯度按等比間隔設為 0、6.0、12.0、24.0、48.0和120.0μg/L(分別記為Ctr和V1—V5, 其實測濃度分別為 0、7.3、10.2、23.9、45.2 和 114.0μg/L)。培養(yǎng)溫度(19.7±0.8)°C, 光照強度 3000 lx, 光暗周期12:12。每組實驗同時設 3個平行樣。用于微藻培養(yǎng)的5 L三角瓶預先用1 moL/L的鹽酸浸泡24h, 消毒海水沖洗干凈后待用。

分別在0、2、3、5、7、14和21d取樣, 測定水中磷酸鹽含量、藻細胞密度和葉綠素a含量, 并在2d時取藻細胞測定其GSH含量與谷胱甘肽還原酶活性,用于分析As(V)暴露對牟氏角毛藻營養(yǎng)鹽吸收能力、生長速度、光合作用及其抗氧化活性的影響。

1.2.2 測定方法 用Lugol碘液固定微藻樣品, 血球計數(shù)板計數(shù); 磷酸鹽(PO4-P)、葉綠素a (chl-a)含量測定均參照《海洋監(jiān)測規(guī)范》(GB17378-2007)方法進行; 還原型谷胱甘肽(GSH)含量測定按張宗申等(2001)的方法進行測定, 以DTNB顯色, 在412nm波長下檢測; 谷胱甘肽還原酶(GR)活性測定參照 Foyer和 Halliwell的方法(Foyer et al, 1976)。利用日立U-2900型紫外可見分光光度計測定吸光值。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)均為 3次重復的平均值, 采用 SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析、回歸分析和差異顯著性分析(One-way ANOVA,Tukey)。

2 結果與分析

2.1 對牟氏角毛藻培養(yǎng)水體中磷酸鹽含量的影響

由表1可知, 第3天時對照組水體中磷酸鹽含量比 2d時顯著降低(P＜0.01), 之后 1周內(nèi)變化不明顯(P＞0.01); 第 14天時, 比 7d時明顯減小(P＜0.01), 但至試驗結束時降低不顯著(P＞0.01)。而V2和V5組磷酸鹽含量變化與對照相似, 且隨時間降低的趨勢更明顯, 在2d時均顯著低于其初始值。表明, 在與適當濃度 As(V)共存條件下, 會促進牟氏角毛藻對磷酸鹽的吸收速度。而V1、V3和V4三組均在實驗過程中出現(xiàn)磷酸鹽含量升高的現(xiàn)象, 且隨著 As(V)暴露濃度的升高出現(xiàn)的時間越晚, 三組分別在2、14和21d時顯著升高。各組水體中磷酸鹽含量與時間均呈顯著負相關關系, V5組相關系數(shù)和回歸方程的斜率最高, 而V3組均最低。表明, 試驗條件下適當濃度As(V)暴露會促進牟氏角毛藻對磷酸鹽的吸收速度, 而較低暴露濃度時則反之。

2.2 對牟氏角毛藻細胞密度的影響

由圖 1可知, 未進行 As(V)暴露處理時, 第 1周牟氏角毛藻密度增加緩慢, 之后的兩周則增長較快,21d時達到最高值63×104ind./mL, 明顯高于試驗初始值(P＜0.01)。而所有暴露處理組在2d或3d時即顯著高于各初始值(P＜0.05), 藻細胞密度在 3—5d時均有所降低, 且降低的程度具有隨著 As(V)暴露濃度升高而增加的趨勢。整個試驗期間, V2組藻細胞密度均高于其它組, 且14d時為最大值71×104ind./mL, 明顯高于其它組(P＜0.05)。表明, As(V)暴露初期牟氏角毛藻細胞分裂加快, 但隨之出現(xiàn)較大波動, 長期高濃度暴露對藻細胞繁殖具有一定的抑制作用。

2.3 對牟氏角毛藻細胞中葉綠素a含量的影響

As(V)暴露條件下牟氏角毛藻細胞葉綠素a含量隨時間的變化分析表明, 2d時各組均顯著降低, 且均顯著低于對照(圖 2), 其中 V4組降低最明顯, 由114.13μg/108cell降至 23.64μg/108cell; 3 d 時僅 V2、V4組較之前明顯升高(P＜0.01), 其它組變化均不大(P＞0.01); 與初始值相比, 5d時除對照變化不明顯外,V5組顯著升高(達 102.16μg/108cell), 而其它處理組卻仍明顯低于其初始值。之后, 對照呈逐漸降低趨勢,而處理組中除 V1呈波動性變化外, 其它各組均呈先降低后升高的趨勢; 三個低濃度組在7 d時出現(xiàn)低值,而兩個高濃度組均在14 d時出現(xiàn)低值。21 d時, 除V1組外各處理組均明顯高于對照(50.63μg/108cell),其中 V3組(87.22μg/108cell)最高, V5組次之(P＜0.01)。結果表明, 在As(V)暴露初期藻細胞葉綠素a合成明顯受到抑制, 而長期暴露時藻細胞會產(chǎn)生適應性, 且適當濃度的As(V)會促進藻細胞葉綠素a合成。

表1 As(V)處理牟氏角毛藻培養(yǎng)水體中磷酸鹽含量(μg/L)變化及回歸分析Tab.1 Variation in PO4-P content (μg/L) in C. mulleri culture water after As(V) exposure and regression analysis

圖1 As(V)暴露條件下藻細胞密度的變化Fig.1 Effect of As(V) exposure on C. mulleri cell density

圖2 As(V)暴露條件下藻細胞葉綠素a含量的變化Fig.2 Effect of As(V) exposure on Chl-a content in C. mulleri

2.4 對牟氏角毛藻細胞GSH含量及谷胱甘肽還原酶活性的影響

圖3顯示, 在As(V)暴露48 h時, 牟氏角毛藻細胞GSH含量分析結果發(fā)現(xiàn), 處理組GSH含量均明顯低于對照(3.23μg/108cell)(P＜0.01), 且隨著 As(V)暴露濃度的升高呈先升高后逐漸降低的趨勢; 其中, V2組(1.91μg/108cell)為各處理組中的最高值(P＜0.01), V5組最低, 但與V4組差異不明顯。結果表明, As(V)暴露對藻細胞 GSH含量具有顯著的抑制作用; 但在低濃度范圍的 As(V)暴露對 GSH含量的抑制作用隨著As(V)濃度的升高而減弱, 而暴露濃度超過一定限值時則反之。

As(V)暴露條件下, 藻細胞谷胱甘肽還原酶活性基本呈隨著As(V)濃度升高而降低的趨勢。其中, V1組谷胱甘肽還原酶活性(3.80U/106cell)最高, 明顯高于對照(2.47U/106cell), 但與V3差異不顯著; V5明顯低于對照, 僅為 2.01U/106cell, 其它兩個處理組與對照差異不明顯。較低濃度的As(V)暴露會誘導谷胱甘肽還原酶活性升高, 而 As(V)暴露濃度過高時則抑制了谷胱甘肽還原酶酶活性。

3 討論

3.1 As(V)脅迫對牟氏角毛藻培養(yǎng)水體中磷酸鹽含量的影響

砷與磷同處元素周期表的第 V主族, 因此砷酸鹽與磷酸鹽具有許多相似的化學性質(zhì)。As(V)與磷酸鹽在生物吸收過程中存在明顯競爭, 少磷條件下淡水浮游植物細胞合成更多的磷/iAsv轉(zhuǎn)運體而增加對iAsv的吸收(Zhaoet al, 2009); As(V)與細胞的結合常數(shù)也遠遠低于無磷條件(龔艷等, 2009)。本研究表明,在長期共存條件下, 適當濃度 As(V)會促進牟氏角毛藻對磷酸鹽的吸收速度, 而較低暴露濃度時則反之(表 1)。適當濃度 As(V)可能促進了磷/iAsv轉(zhuǎn)運體合成而又尚未對磷酸鹽吸收形成明顯抑制, 從而增加表現(xiàn)為磷酸鹽的吸收速度升高。As(V)暴露條件下,不同供磷、氮及有機質(zhì)水平時牟氏角毛藻等海洋硅藻的營養(yǎng)鹽吸收及砷富集動力學有待進一步研究, 海洋微藻細胞對的砷的轉(zhuǎn)運、轉(zhuǎn)化的生化、分子機理研究也有待加強。

圖3 As(V)暴露條件下藻細胞GSH含量與谷胱甘肽還原酶活性的變化Fig.3 Effects of As(V) exposure on GSH content and glutathione reductase activity in C. mulleri

3.2 As(V)脅迫對牟氏角毛藻生長、色素合成的影響及其機理研究

砷對微藻生長率的影響因藻種不同而有差異,As(V)對三角褐指藻的毒性作用隨磷酸鹽濃度降低受到抑制, 而對叉邊金藻的毒性作用不受磷酸鹽濃度影響。本結果發(fā)現(xiàn), 所有處理組藻細胞密度在整個試驗期間均呈波動性增長趨勢, 第 3—5天時均有所降低, 之后又出現(xiàn)恢復生長的現(xiàn)象(圖1)。這表明, 適當濃度 As(V)會促進牟氏角毛藻生長, 但高濃度、長期暴露對藻細胞繁殖具有一定的抑制作用, 這與肖虹濱等(1995)和龔艷等(2009)的結果一致。而As(V)對不同微藻的毒性作用會因藻種、磷酸鹽含量不同而有所差異, 其機理仍需進一步證實。本研究發(fā)現(xiàn), 在As(V)暴露初期牟氏角毛藻細胞葉綠素a含量顯著低于對照, 而長期暴露時一定濃度的 As(V)會促進藻細胞葉綠素a合成(圖2), 這與龔艷等(2011)的結果一致。無機砷對微囊藻葉綠素a含量的影響與砷形態(tài)有關,As(Ⅲ)長期暴露對微囊藻的光合作用有抑制效應(龔艷等, 2011); 暴露于 As(Ⅲ) 48h時, 銅綠微囊藻(Microcystis aeruginosa)細胞中葉綠素a合成明顯受到抑制, 且受抑制程度比類胡蘿卜素更顯著(Wanget al, 2012)。因此, As(Ⅲ)暴露對牟氏角毛藻細胞色素合成及光合作用的影響及其機理研究有待開展。

3.3 As(V)脅迫對牟氏角毛藻細胞抗氧化活性的影響及其解毒機制

GSH及植物鰲合肽(PCs)類物質(zhì)在植物的解毒過程中具有重要作用(Esterbaueret al, 1978), 但其解毒效果隨著毒性物質(zhì)種類、暴露濃度、暴露時間等不同而發(fā)生變化(田丹等, 2010)。砷可以刺激大葉井口邊草中 GSH 的產(chǎn)生, 并通過絡合作用與砷形成As-GSH; 植物體內(nèi) As(V)向 As(Ⅲ)的轉(zhuǎn)化也可能與GSH類物質(zhì)有關(黃澤春等, 2003)。本研究發(fā)現(xiàn), As(V)暴露對牟氏角毛藻 GSH含量具有顯著的抑制作用;但在低濃度范圍的 As(V)暴露對 GSH含量的抑制作用隨著 As(V)濃度的升高而減弱(圖 3右), 而高濃度的As(V)暴露可能會對牟氏角毛藻細胞造成氧化損傷,但損傷程度隨暴露時間的變化則有待進一步證實。較低濃度的As(V)暴露會誘導谷胱甘肽還原酶活性升高(圖 3左), 但 As(V)暴露濃度過高時導致牟氏角毛藻細胞損傷, 而抑制了谷胱甘肽還原酶基因的表達或其酶分子活性, 其具體機理有待進一步探究。綜上所述, 有關海洋浮游植物、大型藻類等的砷富集、轉(zhuǎn)化和解毒機制研究亟待加強, 這對近海砷污染的生物生態(tài)效應及其生物修復具有重要意義。

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