以宏基因組技術(shù)探討渤海秋冬季節(jié)病毒多樣性*

夏 駿 汪 岷 宮 政 姜 勇 馬 玉 汪 儉邵紅兵 王多兵 許志夢

(中國海洋大學海洋生命學院病毒實驗室 青島 266003)

海洋環(huán)境中的病毒數(shù)量極為豐富, 總共有將近4×1030個, 平均豐度約 3×109ind./L (Suttle, 2005)。海洋病毒以微食物環(huán)、侵染微生物等形式影響海洋生物群落組成和碳氮循環(huán)(Wilhelm et al, 1999), 浮游病毒優(yōu)先殺死占優(yōu)勢宿主的特性能使海域富營養(yǎng)區(qū)的赤潮快速消散(Brussaard et al, 2005, 2008)。渤海的浮游病毒數(shù)量相當豐富, 2010年從春季至冬季數(shù)量變化范圍是(6.40×108—3.59×1010)ind./L, 并且呈現(xiàn)出中部海域豐度高于近岸海域的情況(王健等, 2013)。本文所研究的站位 B47(38.66°N, 118.97°E)處于渤海遠離岸邊的海域, 受近岸的環(huán)境因素影響較小, 2011年12月以流式細胞儀測得的病毒豐度為 8.97×109ind./L, 因此選擇這個點的數(shù)據(jù)來代表渤海浮游病毒群落的大致情況。

宏基因組學(metagenomics)作為研究環(huán)境總基因組的有效方法在1998年第一次提出(Handelsman et al,1998), 可以直接對環(huán)境樣品中未經(jīng)培養(yǎng)的微生物群落復雜的總基因組進行分析, 通過遺傳物質(zhì)的提取、測序、拼接、注釋、統(tǒng)計分析等步驟(Thomas et al,2012), 了解環(huán)境微生物群落的物種組成、功能基因結(jié)構(gòu)、進化地位、種間關(guān)系以及與環(huán)境因子的相關(guān)性(Handelsman, 2004)。

近十多年來, 有多個探索海洋病毒宏基因組的研究成果被發(fā)表。有針對海水中病毒組的相關(guān)研究(Angly et al, 2006; Steward et al, 2011; Williamson et al, 2012; Hurwitz et al, 2013; Winter et al, 2014; Brum et al, 2015), 從病毒物種組成和多樣性、各大洋病毒宏基因組之間的關(guān)系、病毒種之間的進化關(guān)系、病毒群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境因子之間以及地域、水深、離岸距離的相關(guān)性等方面全面闡述了大洋海水中的病毒宏基因組特征; 也有針對海洋沉積物病毒組的相關(guān)研究(Breitbart et al, 2004; Yoshida et al, 2013), 對近岸海域以及深海的沉積物病毒組作出具體分析。

目前還沒有針對渤海這一海域的病毒宏基因組的相關(guān)報道。本文所涉及的綜合分析內(nèi)容可為國內(nèi)海域真光層病毒群落、微生物、海洋生態(tài)系統(tǒng)等各類研究提供相關(guān)數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 采樣和病毒宏基因組樣品的預處理

于2010年9月和2011年12月東方紅2號國家自然科學基金開放航次中, 用潛水泵在渤海 B47站(38.66°N, 118.97°E)(圖 1)采集表層海水樣各 150L。海水潤洗塑料桶三次后泵入海水。先使用直徑 300mm,孔徑 3μm 的混合纖維素膜進行第一次過濾, 再使用直徑300mm、孔徑0.22μm的混合纖維素膜進行第二次過濾, 去除非病毒生物顆粒。濾過液經(jīng)中型切相流系統(tǒng)(膜包: Pellicon? 2 Cassette, 材質(zhì): 聚醚砜, 孔徑:50kDa)濃縮至 0.5L, 再用小型切相流系統(tǒng)(膜包:Pellicon? XL Cassette, 材質(zhì): 聚醚砜, 孔徑: 50kDa)濃縮至0.01L。將高度濃縮后的樣品置入液氮中速凍,船上-20°C儲存, 實驗室提取DNA前-80°C儲存。

圖1 渤海病毒宏基因組采樣站位圖Fig.1 Sites map for sampling viral metagenome in Bohai Sea

1.2 DNA的提取

樣品37°C水浴解凍, 加入聚乙二醇(終濃度10%)和NaCl(終濃度 0.6%), 4°C避光靜置24h。在4°C下以13500r/min離心40min, 去除上清液, 讓沉淀懸浮于 300μL 鈉-鎂離子緩沖液。加入 100μL KCl, 冰浴30min。4°C 12000r/min離心10min, 去除沉淀。加入10μL蛋白酶K, 混勻后再加入20μL 10%十二烷基硫酸鈉溶液, 56°C金屬浴1h(每10min震蕩搖勻一次)。連續(xù)兩次用215μL的平衡酚和215μL的氯仿-異戊醇萃取, 取上清液20°C 12000r/min離心4min, 去除有機相。加入43μL醋酸鈉, 860μL無水乙醇, -20°C靜置 3h。4°C 12000r/min離心15min, 去除上清液, 加入0.001L 70%乙醇, 使沉淀懸浮, 4°C 12000r/min離心 5min。去除上清液, 加入 0.001L無水乙醇, 吹打懸浮, 4°C 12000r/min離心5min。吹干, 使沉淀溶于30μL Tris-EDTA 溶液, 4°C 靜置 30min, -80°C 保存。

1.3 建庫、測序和拼接

利用 Hiseq 2000(Illumina)為樣品進行高通量測序, 2×100bp雙末端測序, 插入片段長度為170bp, 測序公司為深圳華大基因科技有限公司(BGI)。首先對樣品進行檢測, 然后根據(jù)Illumina標準建庫測序流程進行測序: (1) 電泳回收主要的DNA片段; (2) 用T4DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和 T4多核苷酸激酶將打斷形成的黏性末端修復成平末端; (3)通過 3′端加堿基“A”, 使得 DNA 片段能與 3′端帶有“T”堿基的特殊接頭連接; (4) 用合格的文庫進行cluster制備和測序。對得到的所有reads序列進行進一步處理: (1) 去除含N堿基數(shù)目總和達到3個或以上的reads; (2) 去除與reads序列有15bp的重疊區(qū)的接頭序列污染; (3) 去除質(zhì)量值連續(xù)(默認 reads中質(zhì)量值小于Q20的堿基數(shù)目大于36, 設(shè)置為84、36); (4)去除重復污染; (5) 對數(shù)據(jù)進行去宿主污染的分析,一致性大于等于 90%的條件下, 與宿主比對上的被認為是宿主污染reads。最終得到干凈數(shù)據(jù)。用SOAP denovo (1.06版)軟件對reads進行拼接, 設(shè)置多個K值選擇質(zhì)量最高的結(jié)果, 2010年9月樣品選擇K值為59, 2011年 12月樣品選擇 K值為 47, 參數(shù)設(shè)置為“SOAP denovo-63mer all-K*–p8–F–M2–d1–R–u–k–o”。拼接完成后過濾掉長度小于500bp的scaffold。

1.4 病毒組物種組成分析

上傳拼接好的scaffold序列, 利用 MetaVir網(wǎng)站平臺(http://metavir-meb.univ-bpclermont.fr/)在病毒基因組參考序列蛋白庫(Refseq complete viral genomes protein sequences database)中 進 行 Blastp 比 對(e-value＜10–3)。用 GAAS(Genome relative Abundance and Average Size)軟件進行病毒物種分類統(tǒng)計(Roux et al, 2014)。

1.5 功能基因分析

使用MetaGeneMark(2.10版)軟件預測scaffold中的開放閱讀框(ORF)(Zhu et al, 2010), 再用 CD-HIT(4.6版)軟件去除冗余的ORF。將非冗余的ORF利用Blastp(e-value＜10–3)在 WebMGA 網(wǎng)站上進行 COG 功能基因數(shù)據(jù)庫比對(Wuet al, 2011)。

1.6 系統(tǒng)進化分析

兩個樣品中的病毒超過97%屬于雙鏈DNA病毒,所以選擇以雙鏈 DNA病毒基因的保守結(jié)構(gòu)域(conserved domain)AVS、G20、GP23、MCP、PhoH、Polβ、Polβ2、T7gp17、TerL 作為待建樹的標記基因,用 Blastp(e-value＜10–3)在 ORF 中查找。其中屬于 Polβ和TerL保守結(jié)構(gòu)域中的各一條基因在樣品的ORF和GenBank NR 庫均有最好的比對結(jié)果(e-value＜10–10),被挑選出來進行系統(tǒng)進化分析, 分別是 DNA聚合酶Polβ中的CyPHP-SSM4(pfam編號: PF00136)和DNA末端酶大亞基TerL中的Q58LJ7_BPPRS(pfam編號:03237)。在用CLASTALW進行兩兩比對和多序列比對后, 用MEGA(6.06版)軟件建立鄰接樹(Hall, 2013)。

2 結(jié)果

2.1 病毒物種分類

2010年9月和2011年12月的樣品中各拼接得到 19875條、31319條 scaffold, 總長度分別為28.29Mbp、33.46Mbp, 拼接序列其它數(shù)據(jù)見表1。兩個樣品預測到非冗余ORF 48227個(2010年9月)、63660個(2011年12月)(表1)。

表1 reads拼接以及開放閱讀框預測結(jié)果Tab.1 Result of reads assembly and predicted ORF

在NR庫(non-redundant protein database, 非冗余蛋白庫)中比對上(blastx, e-value＜10–3)病毒序列的分別有9716條(48.89%)和13599條(43.42%)。兩個樣品共比對上1240個病毒種。與太平洋深海沉積物中大多數(shù)序列屬于單鏈 DNA病毒不同(Mitsuhiroet al,2013), 在兩個樣品比對上病毒基因組的序列中, 雙鏈DNA病毒占據(jù)主要地位, 2010年9月的樣品中占97.65%, 2011年12月的樣品中占97.51%。以病毒目來劃分, 有尾噬菌體目占據(jù)主導地位(81.19%、80.63%)。以病毒科來劃分, 除了有尾噬菌體目下的肌尾病毒科(2010年9月為27.26%, 2011年12月為21.08%)、長尾病毒科(27.83%和 25.34%)和短尾病毒科(23.64%和 30.90%)外, 藻類 DNA病毒科(3.04%和3.28%)和米米病毒科(1.38%和 0.83%)也占據(jù)一定的比例, 這五個科的病毒序列數(shù)量占到總病毒序列數(shù)的 83.15%(2010年9月)、81.43%(2011年12月)(圖 2)。

兩個樣品中總序列數(shù)排在前十的病毒種(圖 3)為Puniceispirillumphage HMO-2011(5.26%和 6.97%)、Pelagibacterphage HTVC008M(3.58%和 2.77%)、Pelagibacterphage HTVC010P(2.33%和 3.01%)、cyanophage KBS-S-2A(1.82%和 1.15%)、Cellulophagaphage phi38:1 (0.54%和 1.97%)、Prochlorococcusphage P-SSM2(1.17%和 1.52%)、Synechococcusphage S-SM2(1.86%和 0.51%)、Pelagibacterphage HTVC011P(0.60%和 1.38%)、Pelagibacterphage HTVC019P(0.70%和 1.17%)、Idiomarinaceaephage 1N2-2(0.98%和0.93%)。這十個種的病毒序列占到總序列數(shù)的20.32%。

序列按照主要宿主來劃分病毒大類(圖 4),Synechococcusphage (共 33 個種, 10.28%)、Pelagibacterphage (共 4 個種, 7.86%)和Puniceispirillumphage (共 1個種, 6.26%)為數(shù)量最多的三大類, 以這12類微生物為宿主的病毒序列占到兩個樣品總序列數(shù)的 52.01%。而其中在兩個樣品中差距最大的為Synechococcusphage, 2010年 9月樣品中所占比例為 12.75%, 而2011年 12月的為 8.52%。原綠球藻噬藻體(Prochlorococcusphage)所占比例為3.09%至3.73%。

另外, 對于存在于渤海病毒組中不占優(yōu)勢的病毒大類, 共有27條序列比對上單鏈DNA病毒的8個種, 5條比對上單鏈RNA病毒5個種。

物種多樣性指數(shù)采用 Shannon-Wiener指數(shù)H′,以序列的個數(shù)作為病毒個體數(shù)進行計算, 2010年9月病毒組為5.87nats, 2011年12月的為5.83nats。Pielou’s均勻度J′冬季為0.612, 秋季為0.639。

2.2 病毒功能基因多樣性

將所有預測到的 ORF在 COG(Clusters of Orthologous Groups of proteins, 直系同源蛋白簇)數(shù)據(jù)庫中進行比對(blastp, e-value＜10–3)。共有20.85%(2010年 9月)和 9.39%(2011年 12月)的 ORF在COG數(shù)據(jù)庫中比對上。在具有特定功能的基因中,以復制、結(jié)合和修復蛋白最為豐富, 其次為細胞壁/細胞膜/包膜合成蛋白, 以及轉(zhuǎn)錄蛋白等(表 2)。渤海冬季病毒群落復制、結(jié)合和修復蛋白所占比例遠高于秋季, 在北黃海的 9個病毒組中呈現(xiàn)相同的現(xiàn)象(汪儉, 2015)。

圖2 病毒物種科級分類Fig.2 Viral taxonomy in family

圖3 序列數(shù)量豐富度前十的病毒種Fig.3 The top 10 virus species in sequence abundance

2.3 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

將全部 ORF與各標記基因比對(blastp, e-value＜10–3), 有多個 ORF被比對上, 結(jié)果見表 3, 其中以DNA末端酶大亞基 TerL最多, 其次為 T7噬菌體尾絲蛋白 gp17和 DNA聚合酶 Polβ。選取比對結(jié)果最好的兩個標記基因Polβ和TerL建立N-J系統(tǒng)進化樹(圖5, 6)。結(jié)果顯示, 渤海病毒組的ORF在已分離的病毒基因中, 親緣關(guān)系與聚球藻噬藻體(Synechococcus phage)、原綠球藻噬藻體(Prochlorococcus phage)、根瘤菌噬菌體(Sinorhizobium phage)、遠洋桿菌噬菌體(Pelagibacter phage)較近。

在以Polβ建的系統(tǒng)進化樹中, 一支Cluster I與已知的藍藻噬藻體親緣關(guān)系較遠, 與之最近的一個種為Sinorhizobium phage phiM12。以TerL建的系統(tǒng)進化樹中, 渤海病毒組的序列較為分散, 其中Cluster II一支的 bootstrap值為 100%, 聚類極為可信, 其進化地位同樣在T4-like virus的HTVC008M與phiM12之間, 但不與phiM12在同一分支上。

圖4 以主要宿主分類的前12大類病毒Fig.4 The top 12 major viral groups classified in by hosts

表2 COG功能基因注釋結(jié)果Tab.2 Functional gene annotation by COG

3 討論

在渤海表層海水2010年9月和2011年12月的兩個病毒宏基因組中, 大部分的病毒序列屬于雙鏈DNA病毒, 其中肌尾病毒科、長尾病毒科、短尾病毒科、藻DNA病毒科占據(jù)主導地位。類似結(jié)果也出現(xiàn)在近期的印度洋和太平洋東北部真光層海水病毒組中, 渤海各級分類與太平洋物種分類結(jié)果接近一致,原因可能是均沒有對樣品 DNA進行擴增, 最大程度地還原了病毒群落結(jié)構(gòu)的真實情況(Stewardet al,2011)。而印度洋雖然同樣以雙鏈DNA病毒—有尾噬菌體目占絕對主導地位, 但其擴增后的病毒組中肌尾病毒科占據(jù) 54.3%與渤海病毒組相差較大(Williamsonet al, 2012)。

噬藻體(cyanophage)能夠侵染藍細菌中聚球藻屬和原綠球藻屬兩個重要的初級生產(chǎn)者, 在自然水體中數(shù)量極為豐富(Berghet al, 1989), 其對宿主的致死率在 1%至 8%(Garzaet al, 1998), 是微食物環(huán)(microbial loop)中的重要成員。噬藻體序列在病毒組序列中占有相當大的比例, 通過系統(tǒng)進化分析指明,渤海噬藻體中存在未知的物種分支 Cluster I(圖 5)和Cluster II(圖 6), 且很有可能屬于肌尾噬菌體—T4-like病毒。對未知物種分支的探索, 可為將來的病毒分離提供指導, 并完善病毒宏基因組中的“Unknown”物種部分。

表3 保守結(jié)構(gòu)域在樣品開放閱讀框中比對的匹配結(jié)果Tab.3 The alignment between conserved domains and ORFs of samples

圖5 渤海病毒與已知病毒Polβ(DNA聚合酶β)保守結(jié)構(gòu)域基因的N-J系統(tǒng)進化樹Fig.5 Neighbor-joining tree based on conserved domain Polβ (DNA polymerase β) from known virus以Vibrio phage、Enterobacter phage、Proteus phage和Edwardsiella phage為外類群

圖6 渤海病毒與已知病毒TerL(DNA末端酶大亞基)保守結(jié)構(gòu)域基因的N-J系統(tǒng)進化樹Fig.6 Neighbor-joining tree based on conserved domain TerL (DNA terminase large subunit) from known virus以Rhizobium phage、Vibrio phage、Enterobacter phage、Erwinia phage、Aeromonas phage和Salmonella phage為外類群

聚球藻(Synechococcus)對于海洋初級生產(chǎn)力的貢獻為25%(Li, 1994; Smith et al, 2001), 是海洋中重要的微生物類群。在黃海海域, 由于水溫降低, 聚球藻冬季的數(shù)量小于秋季數(shù)量(Zhao et al, 2011)。聚球藻噬藻體呈現(xiàn)出與宿主相同的變化趨勢, 2011年 12月所占比例小于2010年9月。另一個重要的大類, 原綠球藻噬藻體(Prochlorococcus phage)所占比例為3.09%至3.73%。但相關(guān)研究指出, 原綠球藻僅分布于夏季水溫較高的亞熱帶和熱帶海域(焦念志, 2006),對中國海域原綠球藻生長的實驗研究也表明, 其最適生長水溫范圍在25—30°C(馮憲棟等, 2007)。渤海B47站 2011年夏季表層海水水溫為 18.0°C, 且本實驗室并沒有以流式細胞儀測出原綠球藻的存在?？赡艿脑蚴窃G球藻噬藻體宿主范圍較廣, 能夠侵染其他屬藍細菌, 或是對馬暖流分支將部分聚球藻從亞熱帶海域攜帶至渤海。

在冬季和秋季渤海病毒組中, 4個病毒種Puniceispirillum phage HMO-2011、Pelagibacter phage HTVC010P、Pelagibacter phage HTVC008M 和Synechococcus phage S-SM2占據(jù)優(yōu)勢地位。海洋真光層細菌其中一個主要分支為 SAR116(Candidatus Puniceispirillums類群), 它對于甲基營養(yǎng)和光合異養(yǎng)代謝有著潛在影響(Grote et al, 2011; Giovannoni et al,2012)。Puniceispirillum phage HMO-2011序列在印度洋的3個病毒組以及太平洋的4個病毒組中占到病毒序列總數(shù)的 10.3%—25.3%, 為豐富度第一或第二的病毒種(Kang et al, 2013), 與之前報道的太平洋病毒組(POV)中開闊海域和近岸的 SAR11噬菌體Pelagibacter phage HTVC010P總數(shù)結(jié)合來看(Zhao et al, 2013), 大洋真光層水體中最占優(yōu)勢的病毒種為HMO-2011和HTVC010P。其次為Pelagibacter phage HTVC008M和 Synechococcus phage S-SM2(Kang et al, 2014)。因此處于太平洋西岸的渤海, 樣品中這四種已分離純化病毒的基因序列比例占據(jù)相當大的優(yōu)勢應為正常現(xiàn)象。但渤海病毒組與其它海域不同的是,cyanophage KBS-S-2A(1.43%)、Cellulophaga phage phi38:1(1.38%)和Idiomarinaceae phage 1N2-2(0.95%)為序列數(shù)排在前十位的優(yōu)勢種。

僅有極少數(shù)的單鏈DNA病毒存在于渤海病毒組中, 這與MetaVir病毒宏基因組數(shù)據(jù)庫中大部分海域的病毒組相似, 但也與部分海域差異很大, 如 2005年馬尾藻海的 ssDNA序列占到了總病毒序列的22.43%。27條單鏈DNA序列中最豐富的病毒科為絲桿噬菌體(Inoviridae)。有研究表明, 海洋中存在大量單鏈DNA病毒(Labonté et al, 2013), 但由于其高突變率難以被分離純化, 數(shù)據(jù)庫中僅有少數(shù)病毒種的全基因組序列。在病毒組研究中, 將以發(fā)掘海水中未知單鏈DNA病毒種為未來的一個方向。

在冬季病毒種數(shù)(1093)高于秋季(1010)、病毒序列數(shù)(13599)也高于秋季(9716)的情況下, 冬季病毒物種多樣性低于秋季, 原因是冬季優(yōu)勢種的優(yōu)勢度更大。從 Pielou’s 均勻度 J′(冬季為 0.612, 秋季為 0.639)可以看出, 秋季各物種序列數(shù)更為平均。冬季功能基因中的復制、結(jié)合和修復基因所占比例卻是秋季的兩倍多, 說明渤海病毒群落(特別是劣勢種)在冬季水溫較低的情況下代謝活性減弱, 但以能夠適應低溫條件的微生物為宿主的病毒則更具優(yōu)勢。例如Puniceispirillum phage和Pelagibacter phage兩個主要的大類, 在冬季的比例明顯高于秋季。聚球藻噬藻體在冬季數(shù)量降低, 是由于宿主聚球藻的數(shù)量與水溫呈顯著相關(guān), 在中國海域數(shù)量有冬季＜秋季的規(guī)律(趙苑, 2010)。

進化關(guān)系中, 與 Cluster I最近的一個種為Sinorhizobium phage phiM12, 宿主 Sinorhizobium meliloti 1021能在土壤中與根系共生, 達到固氮的作用(Stroupe ME et al, 2014), 屬于有尾噬菌體目-肌尾噬菌體科-T4-like病毒屬。T4-like噬菌體有著可收縮尾部因而宿主范圍廣, 從腸桿菌至藍細菌噬藻體, 廣泛分布于海水和淡水中(Mann et al, 2005; Sullivan et al, 2005; Weigele et al, 2007; Dreher et al, 2011)。Cluster I可能代表海洋真光層中新的一類病毒, 從Polβ進化地位在同屬于 T4-like 病毒的 Pelagibacter phage HTVC008M與Sinorhizobium phage phiM12之間可以推斷, Cluster I所代表的一類病毒很可能屬于T4-like 病毒。Cluster II極為可信, 進化地位在HTVC008M與phiM12之間, 可能屬于Cluster I以外的另一支T4-like病毒類群。

在將來的海洋病毒宏基因組研究中, 采樣和實驗方法需要聯(lián)系最新的研究進展不斷改善, 如最近的Fe離子沉降病毒法(John et al, 2011)可使病毒宏基因組采樣步驟簡化。數(shù)據(jù)分析方面, 除了對群落的基礎(chǔ)分析, 更應在結(jié)合環(huán)境因子和宿主序列, 拓寬研究病毒大類領(lǐng)域, 明確病毒群落的海洋生態(tài)學地位方面有所突破。

4 結(jié)論

綜上所述, 渤海 B47站的表層海水病毒宏基因組中雙鏈 DNA病毒占據(jù)主要地位, 前五位的病毒科依次為肌尾病毒科、長尾病毒科、短尾病毒科、藻類DNA病毒科、米米病毒科, 病毒種類與太平洋、大西洋、印度洋等遠洋相比, 有一定的獨特性。渤海秋季病毒物種多樣性和均勻性都比冬季更高, 且功能基因分析結(jié)果表明秋季病毒代謝活性更強。原綠球藻一般情況下只存在于水溫較高的亞熱帶海域, 但在秋季和冬季水溫較低的渤海海域, 病毒組中卻存在原綠球藻噬藻體, 值得進一步研究探討原因。在系統(tǒng)進化分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)噬藻體中可能屬于未知 T4-like噬菌體的病毒分支, 可為噬菌體分離提供指導。

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