2種外周血涂片血小板估測(cè)方法的評(píng)價(jià)

2種外周血涂片血小板估測(cè)方法的評(píng)價(jià)

朱建鋒，張莉，王蓓麗，郭瑋，潘柏申

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032)

摘要：目的探討2種外周血涂片血小板估測(cè)方法在血小板減少標(biāo)本中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法收集227份乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)抗凝靜脈血標(biāo)本，采用Sysmex XE-2100全自動(dòng)血液分析儀進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)，同時(shí)采用Sysmex SP1000i自動(dòng)血液制片儀制作血涂片并染色，使用血涂片A、B方法進(jìn)行血小板結(jié)果估測(cè)。2種血涂片法與血液分析儀法結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性與Bland-Altman一致性分析。結(jié)果血涂片A、B方法與血液分析儀法之間相關(guān)良好，相關(guān)系數(shù)分別為0.894、0.867， P<0.000 1；Bland-Altman分析表明2種方法與血液分析儀法無(wú)系統(tǒng)偏差，對(duì)血小板檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性。結(jié)論對(duì)血小板低值標(biāo)本，血涂片法間接進(jìn)行血小板估測(cè)具有直觀、簡(jiǎn)便，且與血細(xì)胞分析法的結(jié)果相關(guān)性及一致性均較好，可用于血液分析儀血小板結(jié)果的復(fù)核，有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：外周血涂片；血小板估測(cè)計(jì)數(shù)；全自動(dòng)血液分析儀

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)10-1027-03R446.11

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.015

Abstract:ObjectiveTo evaluate the clinical significance of 2 platelet estimation methods using peripheral blood smear in thrombocytopenia patients. MethodsA total of 227 ethylene diamine tetraacetic acid-K2 (EDTA-K2) anticoagulant blood samples were collected and performed by Sysmex XE-2100 automatic hematology analyzer. The blood smears were completed and stained by Sysmex SP1000i automatic blood smear instrument. Method A and B were used to estimate platelet count. The results of 2 platelet estimation methods were compared, and the correlations and Bland-Altman consistency analysis were performed. ResultsPlatelet counts from Method A and B showed correlation coefficients of 0.894 and 0.867 when compared with automatic hematology analyzer (P<0.000 1). Bland-Altman analysis showed that 2 methods and automatic hematology analyzer had no systematic bias, and it had consistency for platelet count. ConclusionsBlood smear platelet estimation shows good correlation and consistency with automatic hematology analyzer. It is useful for the verification of the low platelet results of automatic hematology analyzer in clinical practice.

作者簡(jiǎn)介：朱建鋒，男，1977年生，主管技師，主要從事外周血與骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查。

通訊作者：潘柏申，聯(lián)系電話：021-64041990-2376。

收稿日期：(2014-12-25)

Evaluation of 2 platelet estimation methods using peripheral blood smearZHUJianfeng,ZHANGLi,WANGBeili,GUOWei,PANBaishen.(DepartmentofClinicalLaboratory,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

Key words: Peripheral blood smear; Platelet estimation count; Automatic hematology analyzer

血小板計(jì)數(shù)作為血常規(guī)項(xiàng)目之一，其結(jié)果準(zhǔn)確性對(duì)化學(xué)治療或血小板輸注的患者而言顯得十分重要，并為臨床診斷與治療決策提供依據(jù)，因此檢驗(yàn)科與臨床都非常關(guān)心檢測(cè)的準(zhǔn)確性。但目前自動(dòng)血液分析儀在檢測(cè)血小板計(jì)數(shù)上存在一些方法學(xué)固有缺陷，以及一些影響血小板準(zhǔn)確性的標(biāo)本因素，尤其對(duì)需要采取臨床決策的低血小板計(jì)數(shù)值，血小板計(jì)數(shù)準(zhǔn)確性顯得更為重要。我們探討2種間接的顯微鏡下外周血涂片估測(cè)血小板方法，將2種方法與自動(dòng)血液分析儀結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，評(píng)價(jià)血小板估測(cè)法在血小板計(jì)數(shù)中的臨床價(jià)值。

材料和方法

一、材料

1. 對(duì)象收集復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院2014年5月至9月門(mén)診與住院血小板減少患者的乙二胺四乙酸二鉀抗凝血標(biāo)本231例，其中4例因在顯微鏡觀察血涂片時(shí)發(fā)現(xiàn)異常，未列入本次評(píng)價(jià)(2例血小板假性減低，1例巨大血小板，1例急性白血病)，本次實(shí)驗(yàn)實(shí)際標(biāo)本數(shù)量為227例，血小板范圍3×109/L至101×109/L之間。

2. 儀器與試劑Sysmex XE-2100全自動(dòng)血液分析儀與SP1000i自動(dòng)血液制片儀及其配套試劑，均為日本Sysmex 公司生產(chǎn)；Olympus CX-31型普通光學(xué)顯微鏡，購(gòu)自日本Olympus公司；瑞氏-姬姆薩染色試劑，購(gòu)自珠海貝索生物科技有限公司。

二、方法

1. 血液分析儀法Sysmex XE-2100全自動(dòng)血液分析儀以電阻抗法原理檢測(cè)血小板，血液中的血細(xì)胞成分通過(guò)檢測(cè)通道時(shí)產(chǎn)生脈沖信號(hào)，根據(jù)白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板的脈沖信號(hào)強(qiáng)弱歸類收集，計(jì)數(shù)2～20 fl的脈沖信號(hào)數(shù)值為血小板數(shù)值。2臺(tái)XE-2100儀器使用E-cal(Sysmex America Inc)校準(zhǔn)，每日進(jìn)行3個(gè)水平E-check(Sysmex America Inc)質(zhì)控，在控。所有標(biāo)本均于采集后4 h內(nèi)完成檢驗(yàn)。

2. 外周血涂片法SP1000i自動(dòng)血液推片儀完成所有涂片標(biāo)本的制作，每份標(biāo)本制作2張血涂片，并由該儀器自動(dòng)進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色。血涂片由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的檢驗(yàn)工作人員(10年以上工作經(jīng)驗(yàn))進(jìn)行血小板的結(jié)果估測(cè)與形態(tài)觀察。2種評(píng)估法按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法進(jìn)行。分別為血涂片方法A：即傳統(tǒng)方法，選取紅細(xì)胞平均分布且細(xì)胞間無(wú)重疊區(qū)域計(jì)數(shù)10個(gè)油鏡視野(oil immersion field, OIF)下血小板總數(shù)，除以10即為平均血小板數(shù) /OIF，乘以20 000得到血涂片的血小板估測(cè)值(單位：/μL)[1]；血涂片方法B：在油鏡視野下找到紅細(xì)胞平均分布且細(xì)胞間無(wú)重疊的區(qū)域，計(jì)數(shù)1 000個(gè)紅細(xì)胞的同時(shí)記錄血小板數(shù)值，求得血小板與紅細(xì)胞之比值，將此比值乘以Sysmex XE-2100檢測(cè)同一份標(biāo)本的紅細(xì)胞總數(shù)，得到血小板估測(cè)值(單位：/μL)[2]。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行相關(guān)分析及MedCalc 11.4.2.0 軟件進(jìn)行Bland-Altman統(tǒng)計(jì)。

結(jié)果

一、相關(guān)性分析

血涂片方法A、B與血液分析儀法計(jì)數(shù)血小板結(jié)果相關(guān)性曲線分別見(jiàn)圖1, 2。血涂片A、B法與血液分析儀法比較，結(jié)果顯示相關(guān)系數(shù)分別為0.894，0.867，差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)。兩者在估測(cè)血小板結(jié)果與血液分析儀均有較好的相關(guān)性。

二、Bland-Altman一致性分析

Bland-Altman一致性分析是一種定量資料的一致性分析方法，通過(guò)繪制Bland-Altman散點(diǎn)圖觀察2種方法的差值與均值之間的關(guān)系，從而進(jìn)行一致性判斷[3-4]。圖3、4分別是本次研究的血涂片方法A、B與血液分析儀法計(jì)數(shù)血小板結(jié)果的Bland-Altman散點(diǎn)圖。從圖中可以看出，227個(gè)點(diǎn)中分別有9個(gè)點(diǎn)(9/227)與14個(gè)點(diǎn)(14/227)落在95%的一致性界限(Limits of agreement, LoA)以外，比例分別為4.0%和6.2%，均<10%。圖3顯示方法A與血液分析儀法差值的均數(shù)為7.34×103/μL，差值的標(biāo)準(zhǔn)差為12.56×103/μL，則95%一致性界限為7.34±1.96×12.56×103/μL，即(-17.27×103/μL，31.97×103/μL)。圖4顯示方法B與血液分析儀法差值的均數(shù)為2.12×103/μL，差值的標(biāo)準(zhǔn)差為13.02×103/μL，則95%一致性界限為2.12±1.96×13.02×103/μL，即(-23.40×103/μL，27.64×103/μL)。這些表明2種方法與血液分析儀法一致性較好。

圖1　血涂片方法A與血液分析儀法相關(guān)性曲線

圖2　血涂片方法B與血液分析儀法相關(guān)性曲線

圖3　血涂片A法與血液分析儀血液分析儀法

圖4　血涂片B法與血液分析儀血液分析儀法檢測(cè)血小板結(jié)果的Bland-Altman圖

討論

目前，全自動(dòng)血液分析儀在血細(xì)胞計(jì)數(shù)應(yīng)用中的優(yōu)勢(shì)是簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，是其它手工方法無(wú)法比擬的。但是血小板具有體積小、易黏附等特性，對(duì)此類血小板數(shù)量減少或形態(tài)異常的標(biāo)本而言，血液分析儀對(duì)血小板計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確性往往存在一些不足，無(wú)論是阻抗法或光學(xué)法。此外血液中存在一些“非血小板顆?！?，小紅細(xì)胞與紅細(xì)胞碎片等情況，這些都是影響血液分析儀計(jì)數(shù)血小板準(zhǔn)確與否的因素之一[5]。所以如何準(zhǔn)確做好血小板的計(jì)數(shù)一直是檢驗(yàn)科工作人員關(guān)注與急需解決的問(wèn)題。

血液分析儀對(duì)血小板計(jì)數(shù)減少，尤其是極低值血小板標(biāo)本，不能很好地反映血小板的真實(shí)數(shù)量，此時(shí)診斷血小板減少癥往往需要依靠顯微鏡血涂片觀察輔助。文獻(xiàn)報(bào)道血涂片法血小板計(jì)數(shù)與相差顯微鏡計(jì)數(shù)結(jié)果差別不大[6]。國(guó)內(nèi)也有報(bào)道，認(rèn)為儀器法對(duì)檢測(cè)血小板低值標(biāo)本的可信度較差，應(yīng)以血小板手工計(jì)數(shù)法復(fù)檢，以保證準(zhǔn)確性[7]。近來(lái)有報(bào)道使用細(xì)胞成像系統(tǒng)進(jìn)行血小板計(jì)數(shù)的估測(cè)研究[8-9]。本實(shí)驗(yàn)采用血涂片方法來(lái)估測(cè)血小板數(shù)量，通過(guò)在顯微鏡下仔細(xì)辨認(rèn)與識(shí)別血小板的形態(tài)，而后進(jìn)行估測(cè)計(jì)數(shù)。我們對(duì)227例血小板減少標(biāo)本，血液分析儀法計(jì)數(shù)血小板同時(shí)進(jìn)行了2種血涂片方法估測(cè)。相關(guān)性與Bland-Altman分析可以看出2種血涂片血小板估測(cè)法與血液分析儀法的相關(guān)性很好，方法A相關(guān)系數(shù)略高于方法B，分別為0.894，0.867；Bland-Altman一致性分析顯示對(duì)超過(guò)95%一致性界限的點(diǎn)，分別為4.0%(9/227)與6.2%(14/227)，A法略好于B法，A法低于5%，表明2種方法與血液分析儀血液分析儀法具有較好的一致性。同時(shí)從操作上而言，A法計(jì)數(shù)10個(gè)OIF中血小板總數(shù)，除10換算成平均血小板數(shù)/OIF，乘20 000得到血小板估測(cè)值；而B(niǎo)法計(jì)數(shù)1 000個(gè)紅細(xì)胞的同時(shí)計(jì)數(shù)血小板數(shù)值，求得血小板/紅細(xì)胞比值，乘紅細(xì)胞總數(shù)得到血小板估測(cè)值?？梢?jiàn)A法在實(shí)際操作中較B法簡(jiǎn)便、省時(shí)，更利于年輕檢驗(yàn)人員掌握操作，容易推廣。

血涂片鏡檢的另一優(yōu)點(diǎn)是可直觀地觀察到巨大血小板、纖維蛋白絲、血小板假性聚集等，進(jìn)而采取其它方法及時(shí)校正血小板計(jì)數(shù)，得到真實(shí)的血小板結(jié)果。此次實(shí)驗(yàn)中我們還發(fā)現(xiàn)了乙二胺四乙酸二鉀引起的血小板假性減低2例，巨大血小板1例，急性白血病1例，對(duì)前2種情況分別采取枸櫞酸鈉抗凝管糾正法與網(wǎng)織通道檢測(cè)法，得到準(zhǔn)確的血小板結(jié)果；而1例急性白血病也因此得到了及時(shí)收住入院診治。這些情況僅通過(guò)儀器重新復(fù)做血小板是無(wú)法解決的。此外，對(duì)血小板減低的標(biāo)本進(jìn)行血涂片血小板估測(cè)，可在一定程度減少標(biāo)本的復(fù)做頻率，降低檢驗(yàn)成本，并能加快檢驗(yàn)周轉(zhuǎn)時(shí)間。

總之，血涂片估測(cè)血小板數(shù)量與儀器法相關(guān)性及一致性均較好，同時(shí)對(duì)血液分析儀有重要補(bǔ)充作用，是值得推廣應(yīng)用的快速、簡(jiǎn)便之方法。

參考文獻(xiàn)

[1]MALOK M, TITCHENER EH, BRIDGERS C, et al. Comparison of two platelet count estimation methodologies for peripheral blood smears [J]. Clin Lab Sci, 2007, 20 (3): 154-160.

[2]KUNICKA JE, FISCHER G, MURPHY J, et al. Improved platelet counting using two-dimensional laser light scatter [J]. Am J Clin pathol, 2000, 114 (2): 283-289.

[3]陳卉．Bland-Altman 分析在臨床測(cè)量方法一致性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用 [J]. 中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì), 2007, 24 (3): 308-309.

[4]薩建, 劉桂芬．定量測(cè)量結(jié)果的一致性評(píng)價(jià)及Bland-Altman法的應(yīng)用 [J]. 中國(guó)衛(wèi)生統(tǒng)計(jì), 2011, 28 (4): 409-411.

[5]SPRINGER W, VON RUECKER A, DICKERHOFF R. Difficulties in determining prophylactic transfusion thresholds of platelets in leukemia patients [J]. Blood, 1998, 92 (6): 2183-2184.

[6]SUTOR AH, GROHMANN A, KAUFMEHL K, et al. Problems with platelet counting in thrombocytopenia. A rapid manual method to measure low platelet counts [J]. Semin Thromb Hemost, 2001, 27 (3): 237-243.

[7]陳軍浩, 王以立, 顧光煜．血小板計(jì)數(shù)儀器法與手工法測(cè)定低血小板樣品的評(píng)價(jià) [J]．臨床檢驗(yàn)雜志, 1997, 15 (6): 364-365.

[8]HAGNER R. The manual differential enters the digital age [J]. MLO Med Lab Obs, 2012, 44 (5): 20-21.

[9]GAO Y, MANSOOR A, WOOD B, et al. Platelet count estimation using the CellaVision DM96 system [J]. J Pathol Inform, 2013, 4: 16.

(本文編輯：范基農(nóng))