乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離鑒定試劑盒的建立

乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞分離鑒定試劑盒的建立

張健1，馮曉燕2，孫亭亭3，王凱4，張希銳3，高杰鋒3，

梁曉飛4，康向東5，彭俊杰6，張賀秋2，苗朝良7，沈鶴柏3

(1.上海市臨床檢驗(yàn)中心，上海 2001262；2.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所生物診斷研究室，

北京 100850；3.上海柏慧康生物科技有限公司，上海 201900； 4.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬

仁濟(jì)醫(yī)院上海市腫瘤研究所，上海 200032；5.上海市普陀區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200062；

6.復(fù)旦大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院大腸科，上海 200032；7.聊城市腫瘤醫(yī)院，山東 聊城 252000)

摘要：目的探討乳腺癌循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTC)分離鑒定試劑盒中上皮細(xì)胞黏附分子(EpCAM)免疫脂質(zhì)磁球及人乳腺珠蛋白(hMAM)單克隆抗體在乳腺癌CTC分離鑒定中的應(yīng)用價(jià)值。方法將乳腺癌MCF-7細(xì)胞混于健康志愿者的新鮮血樣中，采用免疫磁球分離技術(shù)分析EpCAM免疫脂質(zhì)磁球?qū)θ橄侔┘?xì)胞的分離效果。在強(qiáng)生CellTracks`(?) AutoPrep`(?) CTC檢測(cè)儀(簡(jiǎn)稱強(qiáng)生Cellsearch`(TM)系統(tǒng))上進(jìn)行EpCAM免疫脂質(zhì)磁球和強(qiáng)生磁球?qū)CF-7細(xì)胞捕獲效率的模擬實(shí)驗(yàn)及乳腺癌患者血液的臨床檢測(cè)。結(jié)果熒光顯微鏡的觀察結(jié)果顯示EpCAM免疫脂質(zhì)磁球的細(xì)胞捕獲能力明顯強(qiáng)于無抗體修飾的納米磁球。激光共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果顯示EpCAM抗體修飾可顯著增強(qiáng)磁球捕獲MCF-7細(xì)胞的效率和特異性。模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EpCAM免疫脂質(zhì)磁球?qū)?0、20、40、80、150、200個(gè)MCF-7細(xì)胞的捕獲結(jié)果與強(qiáng)生磁球接近；對(duì)乳腺癌患者血液中的CTC捕獲效率與強(qiáng)生磁球相當(dāng)，部分病例要明顯優(yōu)于強(qiáng)生磁球。結(jié)論構(gòu)建的基于EpCAM免疫脂質(zhì)磁球和hMAM單克隆抗體的CTC分離鑒定試劑盒對(duì)乳腺癌患者血液中的CTC具有較高的捕獲效率，這將為實(shí)現(xiàn)乳腺癌早期診斷、術(shù)前、術(shù)后分析及治療效果檢測(cè)提供了有力的支撐。

關(guān)鍵詞：循環(huán)腫瘤細(xì)胞；上皮細(xì)胞黏附分子；免疫磁球；人乳腺珠蛋白

中圖分類號(hào)：

文章編號(hào)：1673-8640(2015)10-1011-06R446.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2015.10.012

基金項(xiàng)目：上海市科委生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)處產(chǎn)學(xué)研項(xiàng)目(12DZ1941702)；上海市中小企業(yè)技術(shù)創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目(1302H159400)；第2屆中國(guó)創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)大賽上海張江扶持資金資助項(xiàng)目

作者簡(jiǎn)介：張健，男，1970年生，主任技師，博士，主要從事免疫檢驗(yàn)及質(zhì)量控制。

Abstract:ObjectiveTo investigate the clinical application significance of epithelial cell adhesion molecule (EpCAM)lipid immune magnetic particles and human breast mammaglobin (hMAM) monoclonal antibody in breast cancer circulating tumor cell (CTC) isolation and identification kit. MethodsBreast cancer MCF-7 cells were mixed in healthy fresh blood samples, and the isolation ability of EpCAM lipid immune magnetic particles on breast cancer was analyzed by immune magnetic particle isolating technique. A comparison between EpCAM lipid immune magnetic particles and Cell Tracks? AutoPrep`(?) System (CellSearch`(TM)) magnetic particles for the capture efficiency of MCF-7 cells was performed in a simulation experiment, and the hematological items were determined. ResultsThe results of fluorescence microscopy showed that the capture ability of EpCAM lipid immune magnetic particle was significantly stronger than that of nanoparticles without antibody. The results of laser scanning confocal microscopy showed that the modification of EpCAM lipid immune magnetic particle antibody significantly enhanced the efficiency and specificity of magnetic particles capturing MCF-7 cells. Simulation experiment results showed that the capturing results of EpCAM lipid immune magnetic particles of 10, 20, 40, 80, 150 and 200 MCF-7 cells were close to CellSearch`(TM) magnetic particles. In the blood samples from patients with breast cancer, the CTC capturing efficiencies of EpCAM lipid immune magnetic particles and CellSearch`(TM) magnetic particles were almost the same, in some cases, the CTC capturing efficiency of EpCAM lipid immune magnetic particles was significantly better than that of CellSearch`(TM) magnetic particles. ConclusionsThe research on the establishment of EpCAM lipid immune magnetic particles and hMAN monoclonal antibody based on CTC isolation and identification kit has high capturing efficiency of CTC in blood samples from patients with breast cancer. It will provide a strong support for the early diagnosis, pre-operation and post-operation analysis and treatment effect evaluation.

收稿日期：(2015-04-07)

Establishment on isolation and identification kit for circulating tumor cells in breast cancerZHANGJian1,FENGXiaoyan2,SUNTingting3,WANGKai4,ZHANGXirui3,GAOJiefeng3,LIANGXiaofei4,KANGXiangdong5,PENGJunjie6,ZHANGHeqiu2，MIAOChaoliang7,SHENHebai3.(1.ShanghaiCenterforClinicalLaboratory,Shanghai200126,China; 2.BiologicalDiagnosticLaboratory,InstituteofBasicMedicine,AcademyofMilitaryMedicalSciences,Beijing100850,China; 3.ShanghaiBaihuikangBio-Sci&TechCo.,Ltd.,Shanghai201900,China; 4.ShanghaiCancerInstitute,RenjiHospital,ShanghaiJiaotongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200032,China; 5.DepartmentofClinicalLaboratory,PutuoCentralHospital,Shanghai200062,China; 6.DepartmentofColorectalSurgery,ShanghaiCancerCenter,FudanUniversity,Shanghai200032,China; 7.LiaochengCancerHospital,ShandongLiaocheng252000,China)

Key words: Circulating tumor cell；Epithelial cell adhesion molecule；Immune magnetic particle；Human breast mammaglobin

遷移性是腫瘤的基本特征之一。腫瘤細(xì)胞在器官之間的轉(zhuǎn)移是許多癌癥致死的關(guān)鍵原因[1]。腫瘤組織活檢、影像學(xué)檢查等方法通常用于腫瘤的診斷及預(yù)后判斷，但均有一定的滯后性，難以做到早期篩查[2]。近年來早期篩查主要針對(duì)未表現(xiàn)出癥狀的癌癥患者，而這將增加癌癥防治的成功率。美國(guó)國(guó)家癌癥研究中心的統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明早期篩查能使大腸癌的致死率至少下降60%，使肺癌的致死率下降20%[3]。

上皮細(xì)胞黏附分子(Epithelial cell adhesion molecules，EpCAM)在上皮癌變過程中發(fā)揮重要作用，在多數(shù)上皮來源的腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，而在中胚層來源的血細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中不表達(dá)[4-7]。當(dāng)前多數(shù)研究基于EpCAM來初步判定是否為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)。人乳腺珠蛋白(human breast mammaglobin，hMAM)具有乳腺組織特異性，可應(yīng)用于乳腺癌早期診斷、判斷預(yù)后、微轉(zhuǎn)移的檢測(cè)等，具有很好的臨床應(yīng)用前景[8-12]。我們構(gòu)建了基于EpCAM免疫脂質(zhì)磁球和hMAM單克隆抗體的CTC分離鑒定試劑并進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)。

材料和方法

一、主要材料和儀器

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(American type culture collection，ATCC)細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)賽默飛世爾公司；EpCAM抗體購(gòu)于德國(guó)默克公司；藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標(biāo)記的CK 19抗體購(gòu)自強(qiáng)生Veridex公司；hMAM單克隆抗體由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院贈(zèng)送；4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；EpCAM抗體衍生物購(gòu)自上海銳勁生物技術(shù)有限公司；磁性納米顆粒購(gòu)自上海晟納實(shí)業(yè)有限公司；二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇(DSAPC-APCG)購(gòu)自Avanti公司；膽固醇、二氯甲烷、及其它常用試劑均購(gòu)自國(guó)藥公司。磁力架購(gòu)自上海柏慧康生物科技有限公司；OLYMPUS B 61熒光顯微鏡；PE標(biāo)記的CD45抗體(CD45-PE)和BD FACSEALIBUR流式細(xì)胞儀均為美國(guó)BD公司生產(chǎn)；強(qiáng)生CellTracks?AutoPrep?CTC檢測(cè)儀(簡(jiǎn)稱強(qiáng)生CellsearchTM系統(tǒng)，強(qiáng)生Veridex公司)。

二、方法

1.乳腺癌CTC分離鑒定試劑盒的組裝采用反向蒸發(fā)法制備EpCAM免疫脂質(zhì)磁球，用粒徑分析儀對(duì)EpCAM免疫脂質(zhì)磁球進(jìn)行粒徑分析。乳腺癌CTC分離鑒定試劑盒的主要成分包括EpCAM免疫脂質(zhì)磁球、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的hMAM單克隆抗體(hMAM-FITC)、DAPI染色液、CD45-PE、0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS；pH值7.4)、去離子水。乳腺癌CTC分離鑒定步驟：收集腫瘤患者7.5 mL抗凝血，1000×g離心10 min；小心取中上層液置于EP管中，加入與其等量的PBS充分混勻；加入免疫脂質(zhì)磁球30 μL，室溫孵育30 min，每10 min混勻1次；將EP管插入磁分離架上吸附5 min，吸棄上清液；PBS洗滌3次；加DAPI染色液30 μL、hMAM-FITC染色液10 μL、CD45-PE染色液10 μL混勻避光染色15 min；PBS洗滌3次；向EP管中加入30 μL 去離子水重懸，均勻涂于防脫載玻片，待液滴干后熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。

2. EpCAM免疫脂質(zhì)磁球與納米磁球的對(duì)比試驗(yàn)將計(jì)數(shù)后的1 000個(gè)MCF-7細(xì)胞分別放入7.5 mL PBS中，分別加入30 μL納米磁球和EpCAM免疫脂質(zhì)磁球，混勻后進(jìn)行磁分離。經(jīng)DAPI染色后制作細(xì)胞涂片，在熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，計(jì)算磁球?qū)CF-7細(xì)胞的捕獲效率。將制備的細(xì)胞涂片進(jìn)行hMAM-FITC抗體染色，染色后采用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)一步觀察細(xì)胞的形態(tài)大小。

3. EpCAM免疫脂質(zhì)磁球捕獲效率及hMAM-FITC染色效果檢測(cè)取3只離心管，分別加入7.5 mL PBS，再分別加入10 000個(gè)MCF-7細(xì)胞和EpCAM免疫脂質(zhì)磁球30 μL，混勻。作用20 min后以1 000×g離心10 min。小心將上清移入EP管中，置磁分離架上10 min后用PBS清洗3次。將EP管自磁分離架上取下分別標(biāo)記為1號(hào)、2號(hào)、3號(hào)。1號(hào)不染色(對(duì)照組)，2號(hào)加入10 μL hMAM-FITC染色液，3號(hào)加20 μL hMAM-FITC染色液，室溫避光染色15 min。染色結(jié)束后磁分離，用PBS洗3次，每次2 min。用BD FACSEALIBUR流式細(xì)胞儀分析MCF-7細(xì)胞熒光信息并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞個(gè)數(shù)。

4.體外模擬循環(huán)腫瘤細(xì)胞的捕獲實(shí)驗(yàn)按乳腺癌CTC分離鑒定步驟進(jìn)行MCF-7細(xì)胞的磁分離操作，制作涂片，于熒光顯微鏡下觀察計(jì)數(shù)。在7.5 mL健康供者的新鮮血樣中分別加入10、40、80、150、200個(gè)MCF-7細(xì)胞，加入20 μL磁球后在強(qiáng)生CellsearchTM系統(tǒng)上進(jìn)行分離鑒定，比較EpCAM免疫脂質(zhì)磁球與強(qiáng)生磁球?qū)CF-7細(xì)胞的捕獲效率。

5.CTC捕獲與鑒定的臨床應(yīng)用為對(duì)比臨床試驗(yàn)中自制EpCAM免疫脂質(zhì)磁球與強(qiáng)生磁球的捕獲效率的差異，將乳腺癌患者血樣等分，每份7.5 mL，分別用EpCAM免疫脂質(zhì)磁球和強(qiáng)生磁球在強(qiáng)生CellsearchTM系統(tǒng)上進(jìn)行臨床樣本分析。同時(shí)按乳腺癌CTC分離鑒定步驟檢測(cè)多例乳腺癌患者樣本，并與其臨床其它檢查指標(biāo)綜合分析，為臨床醫(yī)生判斷治療效果提供依據(jù)。

結(jié)果

一、EpCAM修飾后免疫脂質(zhì)磁球粒徑變化

納米磁球在未經(jīng)EpCAM抗體修飾前的平均粒徑為(143.7±0.5)nm[見圖1(a)]，經(jīng)EpCAM抗體修飾后的免疫脂質(zhì)磁球平均粒徑為(192.1 ±0.7)nm[見圖1(b)]。較小的粒徑有助于抗體磁球保持在水相溶液中的穩(wěn)定性，本研究制備的抗體磁球滿足預(yù)期要求。

注：(a)未經(jīng)EpCAM抗體修飾的磁球粒徑分布；(b)經(jīng)EpCAM抗體修飾后的磁球粒徑分布 圖1　磁球粒徑分布

二、EpCAM免疫脂質(zhì)磁球與納米磁球?qū)Ρ仍囼?yàn)

在熒光顯微鏡下比較納米磁球和EpCAM免疫脂質(zhì)磁球?qū)CF-7細(xì)胞的捕獲能力。結(jié)果顯示EpCAM免疫脂質(zhì)磁球的細(xì)胞捕獲能力明顯強(qiáng)于沒有抗體修飾的納米磁球，見圖2。

注：(a)未修飾納米磁球的粒徑分布；(b)EpCAM免疫脂質(zhì)磁球修飾粒徑分布 圖2　納米磁球和EpCAM免疫脂質(zhì)磁球捕獲MCF-7細(xì)胞能力對(duì)比

在激光共聚焦顯微鏡下，EpCAM免疫脂質(zhì)磁球捕獲的細(xì)胞因與hMAM-FITC結(jié)合發(fā)出綠色熒光；納米磁球捕獲的細(xì)胞不顯示綠色熒光，提示所捕獲細(xì)胞可能為非特異性結(jié)合的血液細(xì)胞。見圖3。EpCAM抗體修飾可顯著增強(qiáng)磁球捕獲MCF-7細(xì)胞的效率和特異性。

注： WF為白場(chǎng)(white field)；Merge為DAPI及FITC-hMAM的疊加 圖3　納米磁球和EpCAM免疫脂質(zhì)磁球捕獲MCF-7細(xì)胞的激光共聚焦顯微鏡分析

三、EpCAM免疫脂質(zhì)磁球捕獲效率檢測(cè)

BD FACSEALIBUR流式細(xì)胞儀分析的10 000個(gè)細(xì)胞中大約有7 790～8 010個(gè)細(xì)胞為MCF-7細(xì)胞。對(duì)照組(不染色)、10 μL hMAM-FITC染色組和20 μL hMAM-FITC染色組的MCF-7細(xì)胞捕獲率較為接近，均值為79%。見圖4。

圖5(a)～圖5(c)顯示了對(duì)照組(不染色)、10 μL hMAM-FITC染色組和20 μL hMAM-FITC染色組框選的細(xì)胞的熒光值相對(duì)強(qiáng)度。對(duì)照組MCF-7細(xì)胞的背景熒光強(qiáng)度中位數(shù)為2.92[見圖5(e)]；采用hMAM-FITC染色的2個(gè)組隨著抗體用量的增加，熒光強(qiáng)度(中位數(shù))分別升高5.8倍和12.4倍[見圖5(e)]。表明hMAM-FITC的用量可影響MCF-7細(xì)胞的染色效果。

注：(a)對(duì)照組(不染色)；(b)10 μL hMAM-FITC染色組；(c)20 μL hMAM-FITC染色組 圖4　EpCAM免疫脂質(zhì)磁球捕獲MCF-7細(xì)胞的流式細(xì)胞術(shù)分析

注：(a)對(duì)照組(不染色)；(b)10 μL hMAM-FITC染色組；(c)20 μL hMAM-FITC染色組；(d)熒光信號(hào)強(qiáng)度比較；(e)熒光信號(hào)分析 圖5　EpCAM免疫脂質(zhì)磁球捕獲MCF-7細(xì)胞的流式熒光信號(hào)分析

四、模擬研究循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲與鑒定

EpCAM免疫脂質(zhì)磁球在檢出的細(xì)胞形態(tài)、染色狀況接近于強(qiáng)生磁球檢出的細(xì)胞，見圖6(a)。模擬實(shí)驗(yàn)顯示EpCAM免疫脂質(zhì)磁球?qū)?0、20、40、80、150、200個(gè)MCF-7細(xì)胞的捕獲結(jié)果與強(qiáng)生磁球接近，見圖6(b)。EpCAM免疫脂質(zhì)磁球具有較為理想的乳腺癌細(xì)胞捕獲能力。

五、臨床研究循環(huán)腫瘤細(xì)胞捕獲與鑒定

強(qiáng)生CellsearchTM系統(tǒng)的臨床檢測(cè)結(jié)果見圖7(a)，對(duì)臨床血樣的捕獲CTC成像結(jié)果顯示EpCAM免疫脂質(zhì)磁球與強(qiáng)生磁球近似。對(duì)3例乳腺癌患者血樣的檢測(cè)結(jié)果見圖7(b)A1～A3。

注：(a)細(xì)胞形態(tài)比較；(b)細(xì)胞數(shù)量統(tǒng)計(jì) 圖6　EpCAM免疫脂質(zhì)磁球與強(qiáng)生磁球捕獲MCF-7細(xì)胞總數(shù)的對(duì)比

注：(a)強(qiáng)生磁球和EpCAM免疫脂質(zhì)磁球捕獲的臨床血液樣品中CTC的形態(tài)；(b)強(qiáng)生磁球和EpCAM免疫脂質(zhì)磁球?qū)εR床血液樣本的檢查結(jié)果，A1～A3為乳腺癌患者，B1～B6為疑似乳腺癌患者，C1～C3為健康女性 圖7　強(qiáng)生磁球與EpCAM免疫脂質(zhì)磁球捕獲臨床血樣中CTC的對(duì)比

EpCAM免疫脂質(zhì)磁球?qū)?、2號(hào)患者的CTC檢出量明顯高于強(qiáng)生磁球，對(duì)3號(hào)患者的檢出量也高于強(qiáng)生磁球。EpCAM免疫脂質(zhì)磁球?qū)?例疑似乳腺癌患者和3名健康女性血液進(jìn)行CTC檢測(cè)的結(jié)果見圖7(b)B1～B6、C1～C3，其中3名健康女性的CTC檢測(cè)結(jié)果分別為0、0、1個(gè)，說明EpCAM免疫脂質(zhì)磁球具有較低的假陽性率；6例疑似乳腺癌患者的CTC檢測(cè)結(jié)果分別為0、2、8、28、121、93個(gè)。EpCAM免疫脂質(zhì)磁球具有較高的CTC檢出率和較低的假陽性率。

采用EpCAM免疫脂質(zhì)磁球構(gòu)建乳腺癌CTC分離鑒定試劑盒，手工操作捕獲乳腺癌患者血液中的CTC并在熒光顯微鏡下觀察。乳腺癌CTC被hMAM-FITC抗體染色顯綠色，同時(shí)DAPI染色為藍(lán)色熒光，CD45染色不顯示熒光，綜合判斷為乳腺癌陽性細(xì)胞。見圖8。

注：放大倍數(shù)為×400 圖8　EpCAM免疫脂質(zhì)磁球捕獲乳腺癌臨床血樣中CTC的免疫熒光觀察

討論

癌癥患者血液中存在CTC最早報(bào)道于1869年。癌癥早期階段CTC的數(shù)量是非常少的，每1 mL血液中CTC數(shù)量一般低于100個(gè)，正常血液細(xì)胞的數(shù)量一般多于109個(gè)[13]。近年來，探測(cè)、分離多個(gè)器官來源的CTC的方法不斷發(fā)展，使CTC的連續(xù)檢測(cè)成為可能。微流控芯片技術(shù)增強(qiáng)了血液中的CTC與基質(zhì)固定的抗體之間的結(jié)合效率。當(dāng)前檢測(cè)CTC的技術(shù)主要包括基于免疫磁分離技術(shù)捕獲血液中的CTC、基于癌細(xì)胞遠(yuǎn)大于正常血液細(xì)胞而設(shè)計(jì)的微芯片分離技術(shù)等方法[14-19]。

當(dāng)前多數(shù)免疫磁球法常以EpCAM抗體的磁球來捕獲富集CTC。hMAM是WATSON等1996年首次在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)的，只在乳腺上皮細(xì)胞中表達(dá)，并在乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)。hMAMmRNA 在乳腺癌患者的外周血、骨髓、胸腔積液中的陽性表達(dá)提示乳腺癌的轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后。因此，hMAM可作為一種潛在的采用血液學(xué)方法檢測(cè)乳腺癌患者CTC的標(biāo)志物。

本研究構(gòu)建的基于EpCAM免疫脂質(zhì)磁球和hMAM的CTC分離鑒定試劑盒對(duì)乳腺癌患者血液中的CTC具有較高的捕獲效率，手工操作能有效俘獲乳腺癌患者血液中的CTC，染色效果清晰可辨識(shí)。但該方法對(duì)乳腺癌早期診斷、術(shù)前、術(shù)后分析及治療效果評(píng)估需進(jìn)行更大樣本量的研究證實(shí)。

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(本文編輯：龔曉霖)