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    南極假絲酵母脂肪酶B催化3-(4-氟苯基)戊二酸酐不對(duì)稱醇解

    2016-01-14 03:30:23賈義剛,楊震炯,劉維明
    生物加工過(guò)程 2015年4期
    關(guān)鍵詞:?;?/a>苯基脂肪酶

    南極假絲酵母脂肪酶B催化3-(4-氟苯基)戊二酸酐不對(duì)稱醇解

    賈義剛1,楊震炯2,劉維明1,張洋1,黃和1,胡燚1

    (1. 南京工業(yè)大學(xué)材料化學(xué)工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京210009;

    2. 永康市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)中心,浙江永康321300)

    摘要:采用分子模擬技術(shù),研究了南極假絲酵母脂肪酶B(Candida antarctica lipase B,CALB)催化3-(4-氟苯基)戊二酸酐(3-FGA)不對(duì)稱醇解的分子機(jī)制。首先借助力場(chǎng)修改的Autodock 4.2軟件將過(guò)渡態(tài)底物與CALB進(jìn)行對(duì)接,根據(jù)對(duì)接自由能差異解析了CALB催化3-FGA與不同醇反應(yīng)的立體選擇性差異,得到的S型底物結(jié)合能小于R型底物;其次,基于扭轉(zhuǎn)角機(jī)制分析發(fā)現(xiàn),S型底物扭轉(zhuǎn)角小于R型底物,從分子水平上揭示了CALB對(duì)S型底物選擇性優(yōu)于R型底物的機(jī)制。

    關(guān)鍵詞:南極假絲酵母;脂肪酶; 3-(4-氟苯基)戊二酸酐;分子對(duì)接;分子動(dòng)力學(xué);對(duì)映選擇性

    doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.04.011

    收稿日期:2014-09-06

    基金項(xiàng)目:國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(863計(jì)劃)(2011AA02A209)

    作者簡(jiǎn)介:賈義剛(1989—),男,山東濟(jì)陽(yáng)人,碩士研究生,研究方向:生物催化;胡燚(聯(lián)系人),教授 ,E-mail:huyi@njtech.edu.cn

    中圖分類號(hào):Q71文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    Enantioselective alcoholysis of 3-(4-fluorophenyl)glutaric anhydride catalyzedbyCandidaantarcticalipase B

    JIA Yigang1,YANG Zhenjiong2,LIU Weiming1,ZHANG Yang1,HUANG He1,HU Yi1

    (1. State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Enqineering,Nanjing Tech University,Nanjing 210009,China;

    2. Quality and Technical Supervision and Inspection Center of Yongkang City,Yongkang 321300,China)

    Abstract:We studied enantioselective alcoholysis of 3-(4-fluorophenyl) glutaric anhydride(3-FGA) by Candida antarctica lipase B(CALB) through molecular simulation technology. The transition state substrates were docked with CALB by using Autodock 4.2 whose force file was modified. The enantioselective difference of the alcoholysis of 3-FGA with various alcohols catalyzed by CALB was proved by the differences of binding energy. The binding energy of S-enantiomer was smaller than R-enantiomer. Furthermore,we also found that the torsional angle of S-enantiomer was smaller than R-enantiomer through analyzing the torsional angle mechanism, CALB showed an S-enantiomer enantiopreference from the molecular level.

    Keywords:Candida antarctica; lipase; (3-(4-fluorophenyl)glutaric anhydride; molecular docking; molecular dynamics; enantioselectivity

    手性3-(4-氟苯基)戊二酸單酯是一種重要的藥物中間體,可用于合成抗抑郁藥帕羅西汀以及P2X7受體抑制劑[1-3]。酶法因其催化效率高、立體選擇性強(qiáng)和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛應(yīng)用于手性單酯的合成。目前,酶法制備3-氟苯基戊二酸單酯的方法主要是脂肪酶催化3-(4-氟苯基)戊二酸二酯的不對(duì)稱水解和3-(4-氟苯基)戊二酸酐(3-FGA)的不對(duì)稱醇解[4-6]。在前期工作中,筆者所在課題組的Liu等就南極假絲酵母脂肪酶B(CALB)催化3-FGA的不對(duì)稱醇解反應(yīng)的工藝條件進(jìn)行了系統(tǒng)研究,在研究中發(fā)現(xiàn),當(dāng)采用不同鏈長(zhǎng)和結(jié)構(gòu)的醇作為酰基受體與3-FGA反應(yīng)時(shí),脂肪酶表現(xiàn)出不同的催化性能,如脂肪酶活性和選擇性隨?;荏w鏈長(zhǎng)增加而降低。然而,目前CALB在采用不同鏈長(zhǎng)的醇作為酰基受體時(shí)表現(xiàn)出的對(duì)映選擇性差異機(jī)制尚不清楚,近年來(lái),分子模擬作為一種輔助技術(shù),為酶的催化機(jī)制解析提供了強(qiáng)大支持[8-9]。

    為此,從分子模擬的角度對(duì)3-(4-氟苯基)戊二酸酐的去對(duì)稱醇解反應(yīng)進(jìn)行研究,從分子水平解析酶催化3-FGA去對(duì)稱醇解的分子機(jī)制,揭示酶與不同醇之間的相互作用,對(duì)研究醇解反應(yīng)具有重要的意義。

    1材料與方法

    1.1分子對(duì)接

    1.1.1受體酶分子準(zhǔn)備

    CALB的pdb結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)RCSB(Protein Data Bank,PDB)獲取(PDB ID:1TCA)。首先利用Autodock 4.2刪除晶體結(jié)構(gòu)中水分子,添加缺省的H及其原子的部分電荷;為了保證對(duì)接過(guò)程真實(shí)于反應(yīng)條件,筆者采用過(guò)渡態(tài)對(duì)接,將活性中心的絲氨酸Ser質(zhì)子化,刪除—OH中的H原子,并利用RESP對(duì)其電荷分布重新擬合(電荷:-1)。將處理后的結(jié)構(gòu)保存為pdbqt格式,以備下一步對(duì)接工作。

    1.1.2配體的準(zhǔn)備

    利用ChemOffice 3D 軟件構(gòu)建過(guò)渡態(tài)底物。在構(gòu)建的過(guò)渡態(tài)底物過(guò)程中,將其羰基中的O 原子設(shè)置成帶一個(gè)單位負(fù)電荷。進(jìn)而,利用MM2 模塊對(duì)底物結(jié)構(gòu)進(jìn)行能量最小化。用Chimera1.8添加缺省的氫原子及部分原子電荷,并手動(dòng)刪除底物上與?;荏w相連的羰基O原子的H原子,得到分子總電荷為-1,保存為mol2格式,以備下一步工作使用。

    1.1.3力場(chǎng)修改

    為實(shí)現(xiàn)底物與受體CALB活性口袋部位的成功對(duì)接,底物與受體必須滿足四面體過(guò)渡態(tài)對(duì)接條件??紤]到過(guò)渡態(tài)對(duì)接時(shí),配體分子中羰基的O原子遠(yuǎn)離Thr40氧負(fù)離子,無(wú)法形成氫鍵,因而對(duì)配體絲氨酸的OG 與配體CT 的范德華力(vdW) 及范德華勢(shì)能ε參數(shù)進(jìn)行修正。一方面,通過(guò)減小OG與CT的間距來(lái)降低OG和CT的范德華作用,另一方面,通過(guò)OG 和CT 的相互作用力提高范德華勢(shì)能ε值,以降低對(duì)接勢(shì)能。本研究最終將絲氨酸OG原子的原子類型改為非鍵類型,范德華參數(shù)修正:ε=2.93×105J、半徑σ=0.15 nm;對(duì)接過(guò)程中,所有配體分子的CT 原子范德華參數(shù)修正為ε=1.26×105J、半徑σ=0.15 nm;同時(shí),受體與配體分子的O1、O2 原子形成的氫鍵ε值修正為1.26×105J[10-11]。

    1.1.4底物對(duì)接

    本文采用半柔性對(duì)接方式,對(duì)接過(guò)程中配體小分子的可旋轉(zhuǎn)鍵由系統(tǒng)自動(dòng)分配,但受體酶為剛性結(jié)構(gòu)。在對(duì)接前,設(shè)置4.0 nm×4.0 nm×4.0 nm 大小的搜索網(wǎng)格,其格點(diǎn)步長(zhǎng)為0.037 5 nm,盒子中心為Ser105的OG 原子坐標(biāo)(坐標(biāo):-7.320,22.766,16.938),其他參數(shù)默認(rèn)。通過(guò)拉馬克(Lamakian) 遺傳算法獲得100個(gè)最優(yōu)的對(duì)接構(gòu)象。根據(jù)文獻(xiàn)[11]報(bào)道,筆者設(shè)定一個(gè)篩選條件作為構(gòu)型篩選標(biāo)準(zhǔn):①絲氨酸的OG原子與羰基的CT原子之間的鍵長(zhǎng)小于0.2 nm;②配體分子必須與“氧負(fù)離子洞”形成2個(gè)的氫鍵;③配體分子與His224的咪唑環(huán)NE2原子形成1個(gè)氫鍵。

    1.2分子動(dòng)力學(xué)模擬

    采用Gromacs 4.5.4軟件進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,具體操作如下:采用Prodrg進(jìn)行處理對(duì)接底物力場(chǎng)參數(shù)[12-13]。所有模擬過(guò)程均在pH7.0、溫度300 K 下,GROMOS96 53a6力場(chǎng)、SPC216水模型、PME(particle mesh Ewald) 算法處理靜電作用、遠(yuǎn)程靜電截?cái)嘀禐?.2 nm、遠(yuǎn)程范德華力的截?cái)嘀禐?.2 nm,進(jìn)行15 ns動(dòng)力學(xué)模擬。體系采用立方體盒子,每個(gè)模擬周圍填充1.0 nm 的水分子,模擬體系首先采用1 000 步的能量最小化;之后進(jìn)行壓力與溫度平衡模擬500 ps;最后進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬,放松蛋白,進(jìn)行非限制性模擬。等壓模擬體系下,溫度模擬采用V-rescale 算法,耦合常數(shù)為0.1 ps。動(dòng)力學(xué)模擬的數(shù)據(jù)借助OriginPro 8.0處理分析。

    2結(jié)果與討論

    2.1對(duì)接結(jié)果分析

    與其他脂肪酶一樣,脂肪酶CALB活性口袋由底物?;糠纸Y(jié)合的疏水性口袋和醇基部分結(jié)合的親水性口袋兩部分組成,CALB對(duì)S型底物選擇性與底物的醇基部分能否分布在親水性口袋有關(guān),如圖1所示。

    圖1  底物(?;荏w甲醇)在活性腔中的分布 Fig.1  Distribution of substate(acyl acceptor methanol) in the active site

    利用分子對(duì)接,分別將5種不同的手性醇過(guò)渡態(tài)底物對(duì)接到酶的活性口袋,考察其對(duì)接結(jié)合能數(shù)據(jù),結(jié)果見表1。由表1可知:CALB對(duì)不同底物的S構(gòu)型優(yōu)于R型構(gòu)象,這一現(xiàn)象與之前課題組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)報(bào)道相一致(表1)。

    表1 3-FGA與不同酰基受體的去對(duì)稱作用及結(jié)合能

    由表1可知:CALB對(duì)3-FGA的S型構(gòu)象底物具有優(yōu)先選擇性。隨著碳鏈的增長(zhǎng),轉(zhuǎn)化率和對(duì)映體消旋(e.e.)值逐漸降低,這可能是由于構(gòu)成活性口袋的殘基對(duì)長(zhǎng)鏈底物更易形成空間位阻,使酶不能很好地分布在活性口袋,導(dǎo)致轉(zhuǎn)化率和e.e.值降低。從結(jié)合能發(fā)現(xiàn),?;荏w丁醇底物小于丙醇底物,由于空間位阻,使?;荏w1-丁醇的CT原子更靠近Ser105上的OG原子,導(dǎo)致氫鍵OG—CT=0.16 nm小于?;嫉孜镄纬傻臍滏IOG—CT=0.21 nm,進(jìn)而結(jié)合能低于?;嫉孜?。同樣,林明等[10]在研究洋蔥假單胞菌脂肪酶去對(duì)稱水解N-(2-甲基-6-乙基苯基) 丙氨酸(NEMPA)制備R-NEMPA時(shí)認(rèn)為醇解部分相對(duì)較窄,對(duì)底物的選擇性強(qiáng),而?;糠謩t相對(duì)較弱。為了從動(dòng)態(tài)上進(jìn)一步研究CALB對(duì)底物選擇性差異,筆者采用分子動(dòng)力學(xué)就底物與口袋動(dòng)態(tài)結(jié)合情況進(jìn)行研究。

    2.2動(dòng)力學(xué)分析

    根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,一些研究者認(rèn)為底物與酶形成復(fù)合物的扭轉(zhuǎn)角對(duì)酶選擇性具有很大影響(圖2)。如Jung等[14]研究CALB催化手性3-苯基戊二酸二元酯過(guò)渡態(tài)底物時(shí)發(fā)現(xiàn)R型底物與酶形成扭轉(zhuǎn)角為0°(O—H—O 或N—H—O),小于S型底物與酶形成的扭轉(zhuǎn)角60°。因而,筆者又將對(duì)接最優(yōu)構(gòu)象復(fù)合物進(jìn)行了15 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬。其中,選取了甲醇與乙醇為代表來(lái)研究扭轉(zhuǎn)角與選擇性的關(guān)系。

    圖2  酶與配體扭轉(zhuǎn)角圖 Fig.2  Torsional angle for enzyme and substrate

    首先對(duì)酰基受體甲醇和乙醇復(fù)合物進(jìn)行Cα均方根偏差(RMSD)15 ns分子動(dòng)力學(xué)模擬發(fā)現(xiàn),整個(gè)體系波動(dòng)較小,且都在5 ns后達(dá)到平衡狀態(tài),見圖3和4。由圖3和4可知:甲醇的RMSD約為0.2 nm,乙醇體系的RMSD約為0.18 nm。通過(guò)RMSD分析說(shuō)明,平衡后的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)構(gòu)象已趨向穩(wěn)定、合理。而在扭轉(zhuǎn)角分析中,對(duì)于?;荏w甲醇,體系約在5 ns平衡。模擬結(jié)果發(fā)現(xiàn),S型構(gòu)象底物與酶的扭轉(zhuǎn)角度約為90°,而R型底物則為110°。而酰基受體乙醇體系在5 ns平衡后的S型底物扭轉(zhuǎn)角度約為60°,R型底物扭轉(zhuǎn)角為150°(圖5),基于兩者發(fā)現(xiàn)S型底物的扭轉(zhuǎn)角度明顯小于R型底物。

    圖3  ?;荏w甲醇RMSD Fig.3  RMSD of acyl acceptor methanol

    圖4  酰基受體乙醇RMSD Fig.4  RMSD of acyl acceptor ethanol

    圖5  分子動(dòng)力學(xué)模擬?;荏w扭轉(zhuǎn)角 Fig.5  The simulation of torsional angle of acyl acceptor with molecular dynamics

    3結(jié)論

    基于分子模擬技術(shù)對(duì)CALB催化3-FGA的去對(duì)稱醇解反應(yīng)研究,通過(guò)結(jié)合能差異分析了酶與不同鏈長(zhǎng)的醇去對(duì)稱醇解的對(duì)映選擇性差異,發(fā)現(xiàn)S型底物結(jié)合能小于R型底物。同時(shí)通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬分析了扭轉(zhuǎn)角與不同醇對(duì)映選擇性的分子機(jī)制,證實(shí)S型底物與酶形成的復(fù)合物扭轉(zhuǎn)角小于R型底物。但是目前的模擬研究并不能證實(shí)哪幾個(gè)氨基酸在選擇性中起關(guān)鍵性作用,有必要在今后的研究中引入量子力學(xué)及MM-GBSA,對(duì)氨基酸的能量效應(yīng)進(jìn)行分析,確定對(duì)映選擇性的關(guān)鍵氨基酸,理性指導(dǎo)優(yōu)化酶的性能。

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    (責(zé)任編輯荀志金)

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