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    樹脂固定化β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖

    2016-01-14 03:34:23費俊杰,李冰冰,陳勇
    生物加工過程 2015年4期
    關(guān)鍵詞:樹脂

    樹脂固定化β-半乳糖苷酶制備低聚半乳糖

    費俊杰,李冰冰,陳勇,應(yīng)漢杰

    (南京工業(yè)大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院國家生化工程技術(shù)研究中心,南京211800)

    摘要:以樹脂為載體研究β-半乳糖苷酶固定化條件,來改善酶性質(zhì)。以吸附率和回收率最高的離子交換樹脂I002為載體,通過先吸附后交聯(lián)的方法固定β-半乳糖苷酶,優(yōu)化固定化條件。結(jié)果表明:加酶量為51.8 U(以1 g樹脂計),固定pH為6.5,溫度是25 ℃,吸附時間12 h,戊二醛體積分?jǐn)?shù)為4%,交聯(lián)溫度是40 ℃,時間是6 h時,固定化效果最好。獲得的固定化酶活可達(dá)16.2 U,固定酶回收率為39.1%,得到低聚半乳糖(GOS)的產(chǎn)率為24.2%。該研究為工業(yè)化利用固定化乳糖酶連續(xù)生產(chǎn)低聚半乳糖提供了技術(shù)依據(jù)。

    關(guān)鍵詞:β-半乳糖苷酶;固定化;低聚半乳糖;樹脂

    doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2015.04.004

    收稿日期:2014-04-23

    基金項目:國家杰出青年基金(21025625);國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2012AA021203);國家支撐計劃(2012BAIG4001);國家自然科學(xué)基金青年基金(21106070);長江學(xué)者和創(chuàng)新發(fā)展計劃(PCSIRT);江蘇省高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程;江蘇自然科學(xué)基金(SBK201150207)

    作者簡介:費俊杰(1989—),男,江蘇啟東人,碩士研究生,研究方向:酶催化;應(yīng)漢杰(聯(lián)系人),教授,E-mail:yinghanjie@njtech.edu.cn

    中圖分類號:Q814文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

    Galactooligosaccharides production byβ-galactosidase immobilized onto resins

    FEI Junjie,LI Bingbing,CHEN Yong,YING Hanjie

    (National Engineering Technique Research Center for Biotechnology,College of Biotechnology

    and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 211800,China)

    Abstract:We used resin as a carrier to immobilize β-galactosidase for the production of galactooligosaccharides. Cation exchange resin with the highest absorption rate and recover rate was selected as the carrier. The immobilization condition was optimized through cross-linking after immobilization of β-galactosidase.The best condition was enzyme load 51.8 U/g resin,pH 6.5,25 ℃, time 12 h; and the concentration of glutaraldehyde of 4%(v/v); the temperature in cross-linking action was 40 ℃,the time was 6 h. Under the conditions, the activity of immobilized enzyme was 16.2 U/g resin,the recovery of enzyme fixed was 39.1%,the galactooligosaccharides (GOS) production was 24.2%. The method provides technical basis for continuous production of GOS.

    Keywords:β-galactosidase;immobilized;galactooligosaccharides;resin

    低聚半乳糖(GOS)屬于益生元,是近年來備受關(guān)注的功能性低聚糖,并且是眾多功能性低聚糖中獲得最廣泛認(rèn)可、最為安全的低聚糖之一。它不僅可以促進(jìn)人體腸道內(nèi)益生菌增殖,調(diào)整腸道菌群平衡,增強人體免疫機能和機體的非特異和特異性免疫反應(yīng)等功能,還有低甜度、低能量、非消化性、安全性高等特點,是其他低聚糖無法相比的,可以說是促進(jìn)人體健康的重要功能性食品成分,可廣泛應(yīng)用于食品加工業(yè)中。

    目前,低聚半乳糖的制備主要有5種方法[2-3]:①天然提取法。在自然界中,低聚半乳糖含量較少,并且不帶電荷,分離提取較為困難;②酸水解多糖法。酸水解多糖轉(zhuǎn)化率低,產(chǎn)品成分復(fù)雜,難以得到含量較高的低聚半乳糖;③化學(xué)合成法?;瘜W(xué)合成法試劑毒性大,易殘留,不適用食品級低聚半乳糖生產(chǎn);④發(fā)酵法。直接用微生物發(fā)酵制備低聚半乳糖目前研究較少,該方法需要從發(fā)酵液中分離提取低聚半乳糖,發(fā)酵液成分復(fù)雜,分離較為困難。以上4種方法由于產(chǎn)物成分復(fù)雜,分離成本高,目前不適合工業(yè)化生產(chǎn);⑤酶法合成。酶法合成低聚半乳糖主要以牛乳來源的乳糖為底物,利用微生物β-D-半乳糖苷酶催化合成,乳糖來源充足,而β-D-半乳糖苷酶主要由微生物發(fā)酵制得,生產(chǎn)成本較低,是目前工業(yè)化生產(chǎn)低聚半乳糖的主要方法。酶法合成GOS分為游離酶和固定化酶兩種。固定化酶法合成GOS具有酶利用率高,穩(wěn)定性好,產(chǎn)率高, 產(chǎn)物后處理工藝少等優(yōu)點,已成為合成研究的熱點。樹脂是一種廉價的材料,具有機械強度好,物化性能穩(wěn)定,容易再生等特點。

    本文采用樹脂作為β-半乳糖苷酶的固定化載體,分別對酶固定化的條件及固定化酶的性質(zhì)進(jìn)行研究,以期為酶法合成低聚半乳糖提供新的思路。

    1材料與方法

    1.1實驗材料

    低聚半乳糖標(biāo)品,上?;菡\生物科技有限公司;諾維信(Novozymes)乳糖酶Lactozym Pure 6 500 L,北京嘉瑞富德食品科技公司;葡萄糖、戊二醛(體積分?jǐn)?shù)50%),國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;乳糖、半乳糖、牛血清白蛋白(BSA),上?;菖d生化試劑有限公司;KH2PO4、K2HPO4、乙醇、正丙醇、NaOH、無水Na2CO3,西隴化工股份有限公司;鄰硝基苯酚(ONP)、鄰硝基苯-β-D-半乳糖糖苷(ONPG)、考馬斯亮藍(lán)G250,Sigma公司;98%濃硫酸、鹽酸,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司。

    D113樹脂、D001-CC樹脂、HPD300樹脂、DA201-A樹脂,南開大學(xué)化工廠;I002樹脂、HZ004樹脂,由筆者所在課題組制備。

    ZQZY-C型恒溫?fù)u床,上海知楚儀器有限公司;HH-2型恒溫水浴鍋,國華電器有限公司;UV-2600型紫外-可見分光光度計,上海尤尼柯儀器有限公司;1200 series高效液相色譜儀,安捷倫公司;HPX-87H型 Aminex色譜柱,Bio-Rad公司。

    1.2實驗方法

    1.2.1樹脂預(yù)處理方法

    D113、D001-CC、HZ004和I002樹脂是陽離子交換樹脂,HPD300、DA201-A樹脂是大孔吸附樹脂。先在乙醇里浸泡8 h,用去離子水洗滌,再浸入1 mol/L NaOH浸泡8 h,用去離子水洗至中性,最后浸入1 mol/L HCl浸泡8 h,用去離子水洗至中性,去離子水浸泡備用。

    I002樹脂的活化:10 g樹脂加入到40 mL的0.1 mol/L pH 8.0的磷酸緩沖液中,攪拌15 min后,測pH,維持 pH 7.8.0~8.2,1 h后過濾抽干。

    1.2.2固定化乳糖酶的制備

    取1 g樹脂加入到5 mL的酶液里,在30 ℃條件下吸附12 h后,加入200 μL戊二醛溶液,25 ℃、150 r/min固定化處理6 h。固定化結(jié)束后,固定化酶用去離子水洗滌,晾干,測定固定化酶活和上清液酶活。

    1.2.3酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    稱取28 mg的鄰硝基苯酚(ONP),1 mL的甲醇溶解,再用pH為6.5、濃度0.1 mol/L的磷酸緩沖液定容至100 mL,配制成2 mmol/L的ONP原液,加入不同體積的ONP和磷酸緩沖液,總量為4 mL。在40 ℃條件下反應(yīng)20 min,加入2 mL的1 mol/L的Na2CO3滅活測定波長420 nm處的吸光度OD420,并繪制乳糖酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.2.4乳糖酶酶活的測定

    游離酶活力測定:取3 mL含有4 g/L ONPG的磷酸緩沖溶液于試管中,在40 ℃條件下水浴7 min,加入1 mL稀釋過的酶液,振蕩,40 ℃條件下反應(yīng)10 min,再加入2 mL濃度為1 mol/L的Na2CO3終止反應(yīng),搖勻,在420 nm處測定OD420。

    固定化酶活的測定:稱取1 g的固定化酶顆粒,加入10 mL pH 6.5的磷酸緩沖溶液溶解的底物ONPG,于40 ℃反應(yīng)20 min,加入1.5 mL濃度為1 mol/L的Na2CO3來滅活,測定滅活結(jié)束后OD420。

    酶活的定義:在特定的反應(yīng)條件下(40 ℃、pH 6.5、反應(yīng)10 min),每分鐘催化生成1 μmol的ONP所需的酶量定義為一個酶活單位(U),即

    (1)

    式中:N為游離酶的稀釋倍數(shù);0.714為換算系數(shù),即ONP濃度為1 μmol/L的OD420;t為反應(yīng)時間(min)。

    1.2.5產(chǎn)物定量方法

    使用美國安捷倫1200系列HPLC檢測乳糖和轉(zhuǎn)苷反應(yīng)后的物質(zhì)(GOS,D-半乳糖和D-葡萄糖)。檢測條件:流動相為5 mmol/L硫酸,柱溫為65 ℃,色譜柱為Aminex HPX 87H,流速0.6 mL/min,示差折光檢測器檢測,每次進(jìn)樣量10 μL。

    1.2.6固定化酶活性吸附率和回收率計算

    固定化酶活性吸附率和回收率的計算方法分別見式(2)和式(3)。

    (2)

    固定化酶回收率=

    (3)

    2結(jié)果與討論

    2.1β-半乳糖苷酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線

    按照實驗方法中酶活標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制來測定吸光值OD420,繪制β-半乳糖苷酶的標(biāo)準(zhǔn)曲線。ONP原液添加量與測到的OD420的數(shù)據(jù)見表1。

    表1 OD 420數(shù)值

    由表1數(shù)據(jù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,標(biāo)準(zhǔn)方程為Y=0.714 34X,R2=0.999 2。

    2.2乳糖酶固定化條件的優(yōu)化

    2.2.1固定化樹脂的選擇確定

    純酶液酶活為51.796 U,加各種樹脂1 g,按照1.2.4節(jié)實驗方法測其上清液的酶活和固定化酶活,然后根據(jù)式(2)、式(3)來計算吸附率和回收率,結(jié)果見表2。

    由表2可知:大孔吸附樹脂I002、HPD300、DA201-A的吸附率相對比較高,可能原因是大孔吸附樹脂的表面積大且吸附量大。離子交換樹脂固定化乳糖酶時,酶蛋白與樹脂進(jìn)行離子交換的機率比較高,對酶活的影響較小,因此,其固定化酶活回收率較高。在6種樹脂中,I002樹脂對乳糖酶的吸附率和回收率最高,分別為80%和38.5%,故選擇I002交換樹脂作為乳糖酶固定化載體。

    表2 不同樹脂載體的吸附率和回收率比較

    2.2.2戊二醛用量對酶固定化的影響

    吸附在離子交換樹脂I002上的乳糖酶容易受外界的影響而脫落,因此,可以用戊二醛作為交聯(lián)劑來進(jìn)一步提高固定化酶的穩(wěn)定性。取處理后的I002樹脂1 g加入到0.2 mol/L、pH 6.5磷酸緩沖液稀釋的酶液中,然后加入51.8 U/g(以1 g樹脂計)的β-半乳糖苷酶,在25 ℃條件下吸附12 h后,加入不同體積分?jǐn)?shù)的戊二醛,在40 ℃條件下150 r/min的搖床中交聯(lián)6 h,研究戊二醛用量對固定化酶活和固定化酶回收率的影響,結(jié)果如圖1所示。

    圖1  戊二醛體積分?jǐn)?shù)對酶固定化的影響 Fig.1  Effects of glutaraldehyde volume concentration on enzyme immobilization

    由圖1可知:固定化酶回收率和固定化酶活在戊二醛體積分?jǐn)?shù)為4%的時候最大。其中,戊二醛在用量不高時主要起分子間的交聯(lián)作用,可是當(dāng)戊二醛用量過高時,會導(dǎo)致酶分子自己的結(jié)合,從而改變蛋白質(zhì)分子的構(gòu)象,使得固定化酶活降低,所以最佳戊二醛用量確定為4%。

    2.2.3溫度對酶固定化的影響

    離子交換反應(yīng)需要一定的活化能,溫度的升高有利于交換速度的提高,影響分子熱運動的速度,但溫度過高會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的變性而失活,因此多種因素決定了溫度對酶的固定化過程的影響,綜上固定化乳糖酶存在一個最適溫度范圍。

    按實驗方法1.2.2節(jié)處理后的乳糖酶(戊二醛體積分?jǐn)?shù)4%),在不同溫度下交聯(lián)6 h,研究不同溫度對固定化酶回收率和固定化酶活的影響,結(jié)果見圖2。

    圖2  溫度對酶固定化的影響 Fig.2  Effects of temperature on enzyme immobilization

    由圖2可知:在40 ℃時固定化酶回收率和固定化酶活最大,固定化溫度在30~50 ℃時固定化回收率為39.1%和固定化酶活為16.2 U,且變化不大。酶蛋白在樹脂上的吸附是一個吸熱過程,在溫度較低時,酶不容易吸附到樹脂上,隨著固定化溫度的升高,分子運動逐漸加劇,載體對酶的吸附量也會有所提高。當(dāng)溫度超過50 ℃,固定化酶回收率和固定化酶活會降低且變化幅度很大,是由于溫度過高,導(dǎo)致戊二醛對酶變性作用過強,而且酶蛋白在較高的溫度下容易變性失活。綜上,最佳固定化溫度選擇為40 ℃。

    2.3固定化乳糖酶性質(zhì)的研究

    2.3.1pH對乳糖酶酶活的影響

    在0.2 mol/L磷酸緩沖鹽體系下(含1.5 mmol/L的MgCl2),在溫度40 ℃條件下,分別測固定化酶與游離酶相對酶活,結(jié)果見圖3。

    圖3  pH對β-D-半乳糖苷酶活性的影響 Fig.3  Effects of pH on activity of β-D-galactosidase

    由圖3可知:pH為5.0~8.3時,乳糖酶游離狀態(tài)下最適pH為6.2,乳糖酶固定在I002樹脂上后,pH為6.2~7.4時,酶活性很穩(wěn)定,即使在酸性條件下,酶的相對活力都比游離酶活高,這表明通過結(jié)合在載體后,酶分子穩(wěn)定性得到了提高[7-8]。這是因為酶固定過程中與載體多位點結(jié)合[9-10],構(gòu)象更加穩(wěn)定,減弱了外部溶液變化對酶分子構(gòu)象的影響。

    2.3.2溫度對乳糖酶酶活的影響

    在0.2 mol/L磷酸緩沖鹽體系下(含1.5 mmol/L的MgCl2),pH為6.5條件下考察溫度對游離酶和固定化酶的影響,結(jié)果見圖4。

    圖4  溫度對β-D-半乳糖苷酶活性的影響 Fig.4  Effects of temperature on activity of β-D-galactosidase

    由圖4可知:乳糖酶游離狀態(tài)下的適合溫度為40 ℃,乳糖酶固定在I002樹脂上后,溫度在30~50 ℃時相對酶活都較高。這表明通過載體的結(jié)合,酶分子穩(wěn)定性得到了提高。可能是因為酶分子結(jié)構(gòu)剛性增強,所以不易折疊變性。

    2.3.3固定化的轉(zhuǎn)苷反應(yīng)結(jié)果

    I002樹脂固定β-半乳糖苷酶,乳糖250 g/L,pH 6.5,比酶活為3 U/mL,在磷酸緩沖體系中40 ℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng),測定產(chǎn)物含量,在轉(zhuǎn)苷反應(yīng)形成GOS過程中,各個產(chǎn)物生成量與反應(yīng)時間的關(guān)系見圖5。

    圖5  反應(yīng)生成物濃度與時間之間的關(guān)系 Fig.5  Relationship of product concentration and reaction time

    由圖5可以看出,當(dāng)反應(yīng)時間低于60 min時,GOS的生成量急劇增加,三糖的合成速率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他糖的合成速率;當(dāng)反應(yīng)超過120 min,三糖、四糖的生成量趨于穩(wěn)定,但葡萄糖和半乳糖的量持續(xù)增加;盡管反應(yīng)至240 min時,GOS含量達(dá)到最大(60.5 g/L),相對乳糖的收率為24.2%,但是自從反應(yīng)超過120 min,GOS的生成量增加不明顯。因此,為了提高GOS的生產(chǎn)效率,確定60 min為合適的反應(yīng)時間。

    2.3.4固定化酶反應(yīng)的穩(wěn)定性

    固定化乳糖酶在pH 6.5和40 ℃的條件下連續(xù)操作9次,每次操作后測定固定化酶活,結(jié)果見圖6。

    圖6  固定化酶的操作穩(wěn)定性 Fig.6  Operational stability of immobilized enzyme

    由圖6可知:固定化酶的相對活性隨反應(yīng)次數(shù)的增加而逐漸降低,酶活的降低可能有兩方面原因,一方面是固定化酶在進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)過程中,長時間機械攪拌會導(dǎo)致部分乳糖酶的失活;另一方面在重復(fù)回收的過程中可能會有一些人為的損失。但結(jié)果表明:固定化乳糖酶重復(fù)使用9次后仍保留了較高的活性,β-半乳糖苷酶的相對活力仍為75%,可見固定化乳糖酶具有良好的反應(yīng)連續(xù)性和穩(wěn)定性。

    2.3.5固定化酶的儲存穩(wěn)定性

    考察乳糖酶在固定化和游離狀態(tài)下,在5 ℃冰箱內(nèi)的儲存穩(wěn)定性是衡量其商業(yè)化應(yīng)用的重要指標(biāo)。將固定化乳糖酶和游離乳糖酶置于5 ℃冰箱內(nèi)保存,每隔一段時間去測定乳糖酶活力,其酶活變化情況見圖7。

    圖7  乳糖酶的儲存穩(wěn)定性 Fig.7  Storage stability of β-D-galactosidase

    由圖7可知:固定化乳糖酶儲存90 d,其酶活力保持在89%,而游離酶保持在77%。與游離酶相比,固定化酶在5 ℃儲存時穩(wěn)定性增強,這可能是由于酶的固定化降低了蛋白酶對乳糖酶的降解能力。酶的低溫貯存穩(wěn)定性增強,可進(jìn)一步提高酶的應(yīng)用價值,為固定化酶的實際應(yīng)用提供了有利的數(shù)據(jù)參考。

    3結(jié)論

    選擇6種離子交換樹脂進(jìn)行固定化吸附率和回收率的比較實驗,并對吸附率和回收率最高的I002樹脂進(jìn)行吸附交聯(lián)固定化,用戊二醛作為交聯(lián)劑。處理后的1 g離子交換樹脂I002加入用pH 6.5、0.2 mol/L磷酸緩沖液稀釋的酶液,加酶量經(jīng)測定為51.8 U/g(以1 g樹脂計),在25 ℃吸附12 h后,加入體積分?jǐn)?shù)4%的戊二醛,在40 ℃條件下交聯(lián)6 h,最終獲得的固定化酶活為16.2 U,固定化酶回收率為39.1%。并且利用固定后的樹脂在比酶活為3 U/mL(磷酸緩沖鹽溶液),pH為6.5,溫度為40 ℃條件下進(jìn)行酶解反應(yīng),得到GOS產(chǎn)率為24.2%。

    參考文獻(xiàn):

    [1]鄭建仙,李旋.低聚半乳糖的制備.食品與機械,1999(1):20-21.

    [2]Neri D F M,Balcao V M,Costa R S,et al.Galacto-oligosaccharides production during lactose hydrolysis by freeAspergillusoryzaeβ-galactosidase and immobilized on magnetic polysiloxane-polyvinyl alcohol.Food Chem,2009,115(1):92-99.

    [3]Krajewska B.Application of chitin- and chitosan-based materials for enzyme immobilization.Enzyme Microb Technol,2004,35:126-139.

    [4]Neri D F M,Balc?o V B,Dourado F O Q,et al.Galactooligosaccharides production byβ-galactosidase immobilized onto magnetic polysiloxane-polyaniline particles.React Funct Polym,2009,69:246-251.

    [5]Chockchaisawasdee S,Athanasopoulos V I,Niranjan K,et al.Synthesis of galacto-oligosaccharide from lactose using beta-galactosidase fromKluyveromyceslactis:studies on batch and continuous UF membrane-fitted bioreactors.Biotechnol Bioeng,2005,89(4):434-443.

    [6]Kim S H,Lim K P,Kim H S.Difference in the hydrolysis of lactose and other substrates byβ-galactosidase fromK.lactis.J Dairy Sci,1997,80:2264-2269.

    [7]Parmjit S P.Production ofβ-D-galactosidase from whey usingKluyveromycesmarxianus.Res J Microbiol,2008,3(1):24-29.

    [8]Jochems P,Satyawali Y,Van R S,et al.Characterization and optimization of beta-galactosidase immobilization process on a mixed-matrix membrane.Enzyme Microb Technol,2011,49(6/7):580-588.

    [9]Pereira-Rodríguez,á Fernández-Leiro R,González-Siso M I,et al.Structural basis of specificity in tetramericKluyveromyceslactisβ-galactosidase.J Struct Biol,2012,177(2):392-401.

    [10]Song Y S,Lee J H,Kang S W,et al.Performance ofβ-galactosidase pretreated with lactose to prevent activity loss during the enzyme immobilization process.Food Chem,2010,123(1):1-5.

    [11]Sun S F,Li X Y,Nu S L,et al.Immobilization and characterization of beta-galactosidase from the plant gram chicken bean(Cicerarietinum):evolution of its enzymatic actions in the hydrolysis of lactose.J Agric Food Chem,1999,47(3):819-823.

    [12]Tu W X,Sun S F,Nu S L,et al.Immobilization of beta-galactosidase fromarietinum(gram chicken bean)and its catalytic actions.Food Chem,1999,64(4):495-500.

    (責(zé)任編輯荀志金)

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