骨形態(tài)發(fā)生蛋白2/7異源二聚體治療骨缺損的研究進展

秦登科， 劉天一， 劉方軍

?

骨形態(tài)發(fā)生蛋白2/7異源二聚體治療骨缺損的研究進展

秦登科， 劉天一， 劉方軍

骨形態(tài)發(fā)生蛋白； 異源二聚體； 同源二聚體； 成骨分化

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic proteins, BMPs)除了BMP-1外，均屬于轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的成員，可以誘導(dǎo)骨和軟骨分化、促進新骨形成，在骨、軟骨的缺損修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用[1-3]。BMPs已知有十幾種，其中生物活性較高、成骨作用較強的為BMP 2、4、5、6、7、9蛋白[4]，其中BMP 2、7已獲美國FDA認證應(yīng)用于臨床特殊的病例，如脊柱融合術(shù)、長骨骨干缺損修復(fù)等[5]。然而，BMP蛋白的臨床應(yīng)用伴隨發(fā)生腫脹、積液及腫瘤發(fā)病率提高等不良反應(yīng)，這明顯與BMP蛋白的超高劑量的應(yīng)用有著密不可分的關(guān)系[3,6]。BMP通常以同源二聚體的形式存在，但研究發(fā)現(xiàn)，BMP 2/7異源二聚體的誘導(dǎo)成骨活性比其同源二聚體高4～6倍，誘導(dǎo)活性的提高可以減少BMP蛋白的使用劑量，進而減少炎癥、軟組織水腫以及異位再生骨等不良反應(yīng)的發(fā)生，同時也降低患者的經(jīng)濟負擔(dān)，因此是骨缺損修復(fù)的理想選擇[7]。筆者對BMP 2/7異源二聚體的基因結(jié)構(gòu)、其誘骨活性增強的可能機制等方面進行探討。

1 BMP 2/7異源二聚體的基因結(jié)構(gòu)

活性BMP分子多數(shù)為同源二聚體，即由二硫鍵連接2條氨基酸排列順序相同的肽鏈組成,而由2條氨基酸排列順序不同的肽鏈組成的為BMP異源二聚體。同時，BMP分子N-和O-末端的糖基化提高了其穩(wěn)定性并延長了半衰期。除了位于C-蛋白末端結(jié)構(gòu)域的成熟蛋白序列，BMP分子的400～500個氨基酸前體共用一個在N-末端的信號肽，包含從100～140個氨基酸殘基，有7個保守的半胱氨酸殘基，其中6個形成分子內(nèi)二硫鍵(胱氨酸)，最后1個殘基構(gòu)成分子間二硫化物橋梁，借以形成同源二聚體蛋白分子[8-9]。Dang等[10]通過設(shè)計BMP7及2的特異性引物，即攜帶有限制性內(nèi)切酶Nde Ⅰ序列的 5′-BMP7上游引物(5′-GGAATTCCATATGTCCACGGGGAGCAA ACAGCG-3′)和含接頭蛋白(Gly4Ser)3編碼序列的3′-BMP7下游引物(5′-CAGGCCCGGACACCGACGGTGCCTCCTCCTCCTAGCCCTCCTCCTCCTAGCCCTCCTCCTCCTAGC-3′)及攜帶有同樣連接蛋白編碼序列的5′-BMP 2上游引物(5′-GGAGGAGGAGGATCGGGAGGAGGAGGATCGGGAGGAGGAGGATCG

CAAGCCAAACACAAACAG-3′)和含有限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ編碼序列的3′-BMP 2下游引物 (5′-CTCCCAACACCCACAGCGATTCTTAAGG-3′)，將其用于重疊延伸基因擴增技術(shù)SOE-PCR，獲取了BMP7和BMP 2的雜交基因片段，繼而通過基因重組技術(shù)實現(xiàn)了由接頭蛋白(Gly4Ser)3串聯(lián)的BMP 2-7融合蛋白的表達。

2 BMP 2/7異源二聚體誘導(dǎo)成骨的研究

2.1 體外實驗

一些體外實驗研究證實了BMP異源二聚體具有更強的誘骨活性，然而，針對不同的靶細胞，其誘骨活性也是有差別的。早在1995年，A Aono等通過桿狀病毒表達系統(tǒng)獲得BMP 4/7異源二聚體，利用膠原蛋白作為載體將其導(dǎo)入小鼠的骨髓基質(zhì)細胞中，它所表現(xiàn)出的誘骨活性是BMP 4和BMP7同源二聚體的3倍以上。而Zhao等培養(yǎng)多品種的細胞系如 C3H10T1/2、ST2、C2C12等，通過檢測ALP活性發(fā)現(xiàn)，BMP 2/7、BMP 4/7組表現(xiàn)出的活性遠遠高于對照組的同源二聚體[11]。Zheng等[12]建立破骨細胞系的模型，同時通過控制調(diào)節(jié)BMP 2/7異源二聚體的濃度，發(fā)現(xiàn)在低劑量(5～50 ng/ml)時更能有效的提高破骨細胞的功能，這可能有助于更快速和更早期的誘導(dǎo)和重塑新骨。Myllyl?等[13]將BMP 4和BMP 2/7導(dǎo)入小鼠皮膚來源的成纖維細胞和真皮乳突細胞，均表現(xiàn)出了成骨現(xiàn)象，說明實驗時不僅可以選擇干細胞，還可以尋找一些其他的細胞替代。通過培養(yǎng)蟾蜍的干細胞系，Neugebauer等[14]發(fā)現(xiàn)BMP 4在穩(wěn)定BMP 4/7異源二聚體配體和提高其成骨活性方面均有重要的作用。Carpenter等[15]采用人源及馬源性BMSC作為靶細胞，卻未發(fā)現(xiàn)有明顯的誘骨活性；同樣，Zhang等[16]利用人脂肪來源干細胞作為靶細胞時，BMP 2/7異源二聚體卻并未表現(xiàn)出優(yōu)于同源二聚體的誘骨活性，這可能是由于BMP 2/7異源二聚體對人源性干細胞的不敏感所致，據(jù)此推測，BMP異源二聚體的誘骨活性可能存在著種屬特異性，這需要在以后的實驗中進一步研究證實。

2.2 體內(nèi)實驗

Zhu等[17]構(gòu)建了大鼠的脊柱融合實驗?zāi)Ｐ?，利用腺病毒介?dǎo)BMP 2、7基因共轉(zhuǎn)染的方法來獲得BMP 2/7異源二聚體蛋白，并與其同源二聚體相比較，發(fā)現(xiàn)BMP 2/7異源二聚體明顯提高了大鼠的脊柱融合率，增加了骨體積，同時也提高了骨形成率。Zhao等[11]通過腺病毒載體將BMP 2、7靶基因共轉(zhuǎn)移至靶細胞，并移植到C57BL6小鼠皮下，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因修飾組的小鼠骨缺損處產(chǎn)生了更多的骨組織并且新生骨皮質(zhì)內(nèi)可見成熟骨小梁及骨髓結(jié)構(gòu)，而且Ad-BMP 2/7組新生骨組織的骨量和缺損修復(fù)的骨痂總面積都遠遠大于非Ad-BMP 2/7組；同時，該研究小組在修復(fù)小鼠顱骨缺損實驗中也發(fā)現(xiàn)，BMP 2/7異源二聚體在缺損部位誘導(dǎo)形成的新生骨骨量是對照組骨量的2倍，然而，骨缺損邊緣部位亦出現(xiàn)了骨增生過多的現(xiàn)象，推測這與局部BMP 2/7異源二聚體的過分泌表達有關(guān)[18]。Wang等的實驗研究卻發(fā)現(xiàn)只有低劑量BMP 2/7異源二聚體的局部應(yīng)用才更有利于缺損部位的誘骨效果[19]。Sun等[20]發(fā)現(xiàn)，BMP 2/7異源二聚體能在大型哺乳動物豬的顱骨缺損區(qū)誘導(dǎo)產(chǎn)生更多的新生骨組織，定量分析結(jié)果顯示新生骨的總面積及其成骨分化指標(biāo)，如COLI、ALP、OCN等靶基因的表達量明顯優(yōu)于對照組。

2.3 BMP 2/7異源二聚體誘導(dǎo)成骨的生物學(xué)作用機制2.3.1 BMP 2/7異源二聚體受體的研究 BMP蛋白特異性受體通常以二聚體的形式在細胞表面形成跨膜受體復(fù)合物，該復(fù)合物主要由兩類受體組成，即BMPⅠ型和BMPⅡ型受體[21]。BMPⅠ型受體主要包括3種受體，即ALK2(ActR-IA)、ALK3(BMPRIA)和ALK6(BMPRIB)；而BMPⅡ型受體則包括ActR-Ⅱa、ActR-Ⅱb、AMHR-Ⅱ和 BMPR-Ⅱ型受體[22]。不同類型的BMP同源二聚體蛋白與不同類型受體的親和力也是不一樣的。Isaacs等利用表面等離子體共振技術(shù)發(fā)現(xiàn)，BMP 2/6異源二聚體蛋白與BMPⅠ型和BMPⅡ型受體的親和力均強于BMP 2和BMP 6同源二聚體，而且其激活Smad信號傳導(dǎo)通路的能力亦遠大于相應(yīng)的BMP同源二聚體蛋白[23]。Buijs等[24]的研究結(jié)果亦證明BMP 2/7異源二聚體對BMP受體的親和力明顯高于其相應(yīng)的同源二聚體蛋白，推測BMP 2/7異源二聚體蛋白所表現(xiàn)出的高效誘骨活性可能與其和BMP受體的親和力增加有關(guān)[25]。根據(jù)BMP作用靶細胞系的不同，BMP受體不僅可以激活傳統(tǒng)的Smad信號傳導(dǎo)通路， 亦可激活ERK、(MAPK)p38，JNK等非Smad信號傳導(dǎo)通路，從而參與其誘導(dǎo)成骨的生物調(diào)控作用[22,26-28]。Koh等[18]利用Ad-BMP 2、7基因共轉(zhuǎn)染技術(shù)成功制備重組BMP 2/7異源二聚體蛋白并作用于體外培養(yǎng)的小鼠成肌細胞株C2C12，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BMP 2/7異源二聚體更易于促進信號傳導(dǎo)因子Smad1/5/8的磷酸化,從而表現(xiàn)出更強的成骨誘導(dǎo)分化能力。然而是否存在其他因素激活Smad信號通路及是否存在其他未知可誘導(dǎo)骨生成的信號通路，需要在以后的實驗中加以研究[27]。

2.3.2 細胞信號傳導(dǎo)抑制因子 研究表明，細胞中存在信號傳導(dǎo)抑制因子，如負顯性受體BAMBI、競爭性受體抑制劑Noggin等參與BMPs信號傳導(dǎo)通路的調(diào)節(jié)，以防止其過度激活[28-29]。BMP 2/7異源二聚體的誘骨活性增強可能與其信號傳導(dǎo)通路中的信號抑制因子的反饋調(diào)控活性有關(guān)。Zhu等[29]研究發(fā)現(xiàn)，與BMP 2及BMP7的同源二聚體蛋白相比，BMP 2/7異源二聚體通過刺激靶細胞C2C12成肌細胞，能夠明顯下調(diào)競爭性受體抑制劑Noggin的表達，且添加外源性Noggin細胞因子也并未對BMP 2/7異源二聚體的誘骨能力產(chǎn)生明顯的影響，這可能與BMP 2/7異源二聚體對受體抑制劑Noggin的不敏感性有關(guān)。

3 展望

通過基因轉(zhuǎn)移技術(shù)獲取BMP生長因子基因修飾靶細胞，進而與可降解生物支架材料復(fù)合構(gòu)建組織工程骨并移植入骨缺損部位，是治療臨床大面積臨界骨組織缺損的一個新途徑。BMP 2/7異源二聚體蛋白因具有強效誘骨活性及使用劑量低等優(yōu)點，具有良好的臨床應(yīng)用前景，但是，由于目前仍存在一些問題而限制了其在組織工程中的廣泛應(yīng)用。在BMP因子導(dǎo)入的缺損部位常出現(xiàn)一些不良組織反應(yīng)，如骨吸收、異骨增殖、局部炎癥反應(yīng)等；BMP因子應(yīng)用的最適劑量濃度仍不清楚；過高劑量的應(yīng)用帶來的極大不良反應(yīng)；同時如何選取合適的組織工程支架材料作為載體，以模擬BMP生長因子在體內(nèi)的生理性釋放過程，都將是我們以后需要關(guān)注并研究的方向。

[1] Alden TD, Beres EJ, Laurent JS, et al. The use of bone morphogenetic protein gene therapy in craniofacial bone repair[J]. J Craniofac Surg, 2000,11(1): 24-30.

[2] Balmayor ER, van Griensven M. Gene therapy for bone engineering[J]. Front Bioeng Biotechnol, 2015,3:9.

[3] Oryan A, Alidadi S, Moshiri A, et al. Bone morphogenetic proteins: a powerful osteoinductive compound with non-negligible side effects and limitations[J]. Biofactors, 2014,40(5):459-481.

[4] Marsell R, Einhorn TA. The role of endogenous bone morphogenetic proteins in normal skeletal repair[J]. Injury, 2009,40 Suppl 3:S4-S7.

[5] Kofron MD, Laurencin CT. Bone tissue engineering by gene delivery[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2006,58(4):555-576.

[6] Carreira AC, Lojudice FH, Halcsik E, et al. Bone morphogenetic proteins: facts, challenges, and future perspectives[J]. J Dent Res, 2014,93(4):335-345.

[7] Morimoto T, Kaito T, Matsuo Y, et al. The bone morphogenetic protein-2/7 heterodimer is a stronger inducer of bone regeneration than the individual homodimers in a rat spinal fusion model[J]. Spine J, 2015,15(6):1379-1390.

[8] Valera E, Isaacs MJ, Kawakami Y, et al. BMP-2/6 heterodimer is more effective than BMP-2 or BMP-6 homodimers as inductor of differentiation of human embryonic stem cells[J]. PLoS One, 2010,5(6):e11167.

[9] Hinck AP. Structural studies of the TGF-βs and their receptors - insights into evolution of the TGF-β superfamily[J]. FEBS Lett, 2012,586(14):1860-1870.

[10] Dang J, Jing L, Shi W, et al. Expression and purification of active recombinant human bone morphogenetic 7-2 dimer fusion protein[J]. Protein Expr Purif, 2015,115:61-68.

[11] Zhao M, Zhao Z, Koh JT, et al. Combinatorial gene therapy for bone regeneration: cooperative interactions between adenovirus vectors expressing bone morphogenetic proteins 2, 4, and 7[J]. J Cell Biochem, 2005,95(1):1-16.

[12] Zheng Y, Wang L, Zhang X, et al. BMP2/7 heterodimer can modulate all cellular events of the in vitro rankl-mediated osteoclastogenesis, respectively, in different dose patterns[J]. Tissue Engineering Part A, 2012,18(5-6):621-630.

[13] Myllyl? RM, Haapasaari KM, Lehenkari P, et al. Bone morphogenetic proteins 4 and 2/7 induce osteogenic differentiation of mouse skin derived fibroblast and dermal papilla cells[J]. Cell Tissue Res, 2014,355(2):463-470.

[14] Neugebauer JM, Kwon S, Kim HS, et al. The prodomain of BMP4 is necessary and sufficient to generate stable BMP4/7 heterodimers with enhanced bioactivity in vivo[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2015,112(18):E2307-E2316.

[15] Carpenter RS, Goodrich LR, Frisbie DD, et al. Osteoblastic differentiation of human and equine adult bone marrow-derived mesenchymal stem cells when BMP-2 or BMP-7 homodimer genetic modification is compared to BMP-2/7 heterodimer genetic modification in the presence and absence of dexamethasone[J]. Journal of Orthopaedic Research, 2010,28(10):1330-1337.

[16] Zhang X, Guo J, Wu G, et al. Effects of heterodimeric bone morphogenetic protein-2/7 on osteogenesis of human adipose-derived stem cells[J]. Cell Prolif, 2015,48(6):650-660.

[17] Zhu W, Rawlins BA, Boachie-Adjei O, et al. Combined Bone Morphogenetic Protein-2 and -7 Gene Transfer Enhances Osteoblastic Differentiation and Spine Fusion in a Rodent Model[J]. Journal of Bone and Mineral Research, 2004,19(12):2021-2032.

[18] Koh JT, Zhao Z, Wang Z, et al. Combinatorial gene therapy with BMP2/7 enhances cranial bone regeneration[J]. J Dent Res, 2008,87(9):845-849.

[19] Wang J, Zheng Y, Zhao J, et al. Low-dose rhBMP2/7 heterodimer to reconstruct peri-implant bone defects: a micro-CT evaluation[J]. J Clin Periodontol, 2012,39(1):98-105.

[20] Sun P, Wang J, Zheng Y, et al. BMP2/7 heterodimer is a stronger inducer of bone regeneration in peri-implant bone defects model than BMP2 or BMP7 homodimer[J]. Dent Mater J, 2012,31(2):239-248.

[21] Yao Y, Jumabay M, Ly A, et al. Crossveinless 2 regulates bone morphogenetic protein 9 in human and mouse vascular endothelium[J]. Blood, 2012,119(21):5037-5047.

[22] Sánchez-Duffhues G, Hiepen C, Knaus P, et al. Bone morphogenetic protein signaling in bone homeostasis[J]. Bone, 2015,80:43-59.

[23] Isaacs MJ, Kawakami Y, Allendorph GP, et al. Bone morphogenetic protein-2 and-6 heterodimer illustrates the nature of ligand-receptor assembly[J]. Mol Endocrinol, 2010,24(7):1469-1477.

[24] Buijs JT, van der Horst G, van den Hoogen C, et al. The BMP2/7 heterodimer inhibits the human breast cancer stem cell subpopulation and bone metastases formation[J]. Oncogene, 2012,31(17): 2164.

[25] Oryan A, Kamali A, Moshiri A. Potential mechanisms and applications of statins on osteogenesis: current modalities, conflicts and future directions[J]. J Control Release, 2015,215:12-24.

[26] Nohe A, Keating E, Knaus P, et al. Signal transduction of bone morphogenetic protein receptors[J]. Cell Signal, 2004,16(3):291-299.

[27] Hankenson KD, Gagne K, Shaughnessy M. Extracellular signaling molecules to promote fracture healing and bone regeneration[J]. Adv Drug Deliv Rev, 2015,94:3-12.

[28] Kawai M, Maruyama H, Bessho K, et al. Simple strategy for bone regeneration with a BMP-2/7 gene expression cassette vector[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2009,390(3):1012-1017.

[29] Zhu W, Kim J, Cheng C, et al. Noggin regulation of bone morphogenetic protein (BMP) 2/7 heterodimer activity in vitro[J]. Bone, 2006,39(1):61-71.

國家自然科學(xué)基金(81372091)

200040 上海,復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院 整形外科(秦登科，劉天一)；濰坊醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院(劉方軍)

秦登科(1992-)，男，河南商丘人，碩士研究生.

劉天一，200040，復(fù)旦大學(xué)附屬華東醫(yī)院 整形外科，電子信箱：tianyiliucn@126.com；劉方軍，261041，濰坊醫(yī)學(xué)院整形外科醫(yī)院，電子信箱：liufjmd@gmail.com

10.3969/j.issn.1673-7040.2016.10.018

2016-06-23)