A102/B301亞型血型特點(diǎn)分析

A102/B301亞型血型特點(diǎn)分析

胡彬，潘海平，朱于莉，馮智慧

(青島市中心血站輸血研究所，山東青島266071)

摘要：目的報(bào)告1例A102/B301亞型血型，分析其血型特點(diǎn)。方法對(duì)1例無(wú)償獻(xiàn)血者的全血標(biāo)本用血型血清學(xué)方法鑒定血型，對(duì)ABO基因第6、7外顯子核苷酸序列采用直接測(cè)序和克隆測(cè)序進(jìn)一步鑒定亞型。結(jié)果該樣本血清學(xué)結(jié)果顯示為AB亞型。測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列A101對(duì)比顯示，該樣本第6、7外顯子297A/G、467C/T、526C/G、657C/T、703A/G、796A/C、803C/G、930A/G、1054C/T、1096A/G雜合，進(jìn)一步針對(duì)第6、7外顯子克隆測(cè)序結(jié)果顯示該樣本為雜合序列，分別與標(biāo)準(zhǔn)序列A101對(duì)比顯示其中一條467為T，另外一條序列與B101序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，第1 054位堿基C>T導(dǎo)致第352位氨基酸由精氨酸變?yōu)樯彼幔_定為A102/B301亞型。結(jié)論 發(fā)現(xiàn)1例罕見(jiàn)的A102/B301亞型；對(duì)于正反定型不符的血清學(xué)表現(xiàn)血型，應(yīng)進(jìn)一步采用基因檢測(cè)以確定其血型亞型。

關(guān)鍵詞：ABO血型系統(tǒng)；AB亞型；基因型；測(cè)序

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.42.041

中圖分類號(hào)：R457.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

基金項(xiàng)目：山東省青島市市南區(qū)科技發(fā)展資金項(xiàng)目(2013-13-013-YY)。

收稿日期：(2015-05-20)

通信作者：馮智慧

ABO血型系統(tǒng)是最重要的血型系統(tǒng)。除標(biāo)準(zhǔn)的A、B、O和AB表型外，還可出現(xiàn)A1和A2亞型及其他罕見(jiàn)亞型。單堿基突變是大多數(shù)亞型產(chǎn)生的原因[1]。Salmon參照A變異型分類方法，將B亞型分為B3、Bx、Bm、Bel，不符合這4種類型的其他B亞型均歸為Bw[2]。目前,B3被認(rèn)為是最稀少的一種B亞型，中國(guó)人群中大約900個(gè)B型個(gè)體中有1例是B3，1 800例A1B獻(xiàn)血者中有1例是A1B3[3]。2014年11月，我們鑒定出1例呈A102/B301亞型的無(wú)償獻(xiàn)血者血型，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1材料1例健康男性無(wú)償獻(xiàn)血者的EDTA-Na2抗凝全血標(biāo)本，獻(xiàn)血者年齡26歲，無(wú)輸血史及重大疾病史。

1.2試劑及儀器試劑：?jiǎn)慰寺】笰、抗B、多克隆抗人球蛋白試劑、ABO細(xì)胞、抗體篩選細(xì)胞均為Sanquin公司試劑；抗H、抗A1、抗AB購(gòu)自上海生物制品有限公司；人源抗A、抗B購(gòu)自成都血研所；基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自Invirtrogen公司；Exon6、7測(cè)序引物(PAGE級(jí))、Ex-Taq試劑盒、LA-Taq試劑盒和及高效克隆PCR產(chǎn)物專用載體(pMD18-T vector)由TaKaRa公司提供。儀器：Kubo7A 2420細(xì)胞洗滌離心機(jī)；Bio-Rad C1000 PCR擴(kuò)增儀；美國(guó)AB公司3100-Avant型測(cè)序儀。

1.3血型血清學(xué)檢測(cè)EDTA-Na2抗凝外周靜脈血，采用試管法進(jìn)行ABO正反定型，用篩選細(xì)胞對(duì)樣本血清進(jìn)行抗體篩選，以明確或排除不規(guī)則抗體的存在。

1.4血型序列分析鹽析法提取血液標(biāo)本全基因組DNA，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明書。對(duì)ABO基因第6和第7外顯子進(jìn)行序列分析，引物設(shè)計(jì)參照Olsson[4]設(shè)計(jì)的兩對(duì)引物對(duì)Exon6和Exon7進(jìn)行擴(kuò)增，測(cè)序引物分別為：Exon Ⅵ正義鏈為5′-CGGAATTCACTCGCCACTGCCTGGGTCTC-3′，反義鏈為5′-CGGGATCCATGTGGGTGGCACCCTGCCA-3′；Exon Ⅶ正義鏈為5′-CGGGATCCCCGTCCGCCTGCCTTGCAG-3′，反義鏈為5′-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3′。將第6、7外顯子測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列A101對(duì)比。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序如下：95 ℃預(yù)變性10 min，94 ℃ 60 s、63 ℃ 90 s、72 ℃ 60 s共10個(gè)循環(huán)，94 ℃ 60 s、61 ℃ 90 s、72 ℃ 60 s共25個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，10 ℃保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化，正反雙向測(cè)序。使用LA-Taq酶特異性擴(kuò)增ABO基因Exon6、Intron6和Exon7行單倍體序列分析，將PCR產(chǎn)物克隆入T載體，挑取多個(gè)陽(yáng)性菌落進(jìn)行測(cè)序鑒定，確定樣本的單倍型。

2結(jié)果

2.1血型血清學(xué)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2血型序列分析 ABO第6、7外顯子測(cè)序297A/G、467C/T、526C/G、657C/T、703A/G、796A/C、803C/G、930A/G、1054C/T、1096A/G雜合。ABO第6、7 外顯子單倍型測(cè)序示，其中一條單倍型為A102，另外一條單倍型序列與B101比對(duì)發(fā)現(xiàn)，在第1 054位堿基發(fā)生了C>T的突變，導(dǎo)致352位氨基酸由天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樯彼幔_定基因型為A102/B301亞型。

表1　1例A 102/B 301亞型的血清學(xué)正反定型結(jié)果

注：抗-H與Bc反應(yīng)2+，與Oc反應(yīng)4+。

3討論

ABO血型系統(tǒng)是臨床輸血及移植相關(guān)的最重要的血型系統(tǒng)。除了常見(jiàn)的A1和A2亞型外，還存在其他罕見(jiàn)的ABO亞型，其他罕見(jiàn)的亞型通過(guò)A和B抗原的量以及在紅細(xì)胞上的分布進(jìn)行分類[5]?；蚋淖兪莵喰桶l(fā)生的基礎(chǔ)，ABO基因堿基突變可致表達(dá)糖基轉(zhuǎn)移酶的氨基酸改變[6,7]，可能會(huì)導(dǎo)致抗原合成減少，從而在血清學(xué)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為抗原與抗A或抗B的反應(yīng)強(qiáng)度減弱[9,10]。研究表明，同一位置不同種類和性質(zhì)的氨基酸置換可導(dǎo)致血清學(xué)表型的巨大差異，氨基酸極性發(fā)生改變，造成蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，進(jìn)而影響酶蛋白的催化活性和抗原表達(dá)，影響酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)[11,12]。進(jìn)而導(dǎo)致ABO血型基因的產(chǎn)物A和(或)B血型糖基轉(zhuǎn)移酶活性改變，造成血清學(xué)改變，導(dǎo)致正反定型不符、凝集強(qiáng)度與凝集狀態(tài)改變或檢出不規(guī)則抗A或抗B[13]。

紅細(xì)胞血型血清學(xué)技術(shù)雖然相對(duì)較完善和標(biāo)準(zhǔn)化，但其只能鑒定表型，在對(duì)亞型、因疾病導(dǎo)致的血型改變、部分疑難標(biāo)本的ABO分型和做遺傳學(xué)分析時(shí)受到局限[14]。基因分型技術(shù)可克服血型血清學(xué)方法的局限性，是鑒定ABO血型分析的重要手段[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，采用血清學(xué)檢測(cè)后，該樣本血清學(xué)正反定型不符，正定B抗原減弱，反定檢出抗B抗體，依據(jù)血清學(xué)定為AB亞型；ABO第6、7外顯子測(cè)序結(jié)果顯示第1 054位堿基為C/T雜合，進(jìn)一步克隆測(cè)序結(jié)果顯示其中一條序列為A102，另一條序列與B101比較，第1 054位堿基發(fā)生C>T的改變，該樣本的序列分析結(jié)果符合A102/B301亞型，考慮該堿基的改變導(dǎo)致第352位氨基酸由天冬氨酸變?yōu)樯彼?。大多?shù)B3亞型血清學(xué)表現(xiàn)3+混合視野凝集現(xiàn)象，而本組該樣本用試管法多次離心后，混合視野凝集強(qiáng)度僅顯示弱陽(yáng)性，推測(cè)原因,為該樣本的A抗原競(jìng)爭(zhēng)性占據(jù)了紅細(xì)胞上的抗原表位,導(dǎo)致B抗原表達(dá)進(jìn)一步減少。此外，我們?cè)诓捎门R床經(jīng)常使用的凝膠卡進(jìn)行正反定型的過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)正定型抗B結(jié)果顯示陰性，提示該樣本在臨床非常容易被錯(cuò)定為A型,從而發(fā)生輸血錯(cuò)誤。

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