COX-2mRNA在骨關(guān)節(jié)炎性病變過程中的作用研究

論著

COX-2mRNA在骨關(guān)節(jié)炎性病變過程中的作用研究

李冠甘麗嬌鐘妙容

作者單位： 516002廣東省惠州市第三人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科

【摘要】目的探討環(huán)氧化酶-2基因(COX-2 mRNA)在骨關(guān)節(jié)炎性病變中的變化及其作用。方法以風(fēng)濕免疫科2010至2014年收治的51例膝骨性關(guān)節(jié)炎患者(病例組)及20例非膝骨性關(guān)節(jié)炎患者(對照組)為研究對象，根據(jù)膝骨性關(guān)節(jié)炎的病變進(jìn)程分為早期組(17例)、中期組(19例)和晚期組(15例)，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量法(RT-PCR)檢測各組患者的成纖維樣滑膜細(xì)胞中COX-2mRNA表達(dá)水平、采用Western-blot法檢測各組COX蛋白表達(dá)水平。結(jié)果病例組患者成纖維細(xì)滑膜樣細(xì)胞中COX-2mRNA及蛋白表達(dá)灰度值分別為0.76±0.11、0.85±0.09均顯著高于對照組(P<0.05)。早期組、中期組、晚期組患者和對照組成纖維細(xì)滑膜樣細(xì)胞中COX-2mRNA及蛋白表達(dá)灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；早期組COX-2mRNA及蛋白表達(dá)灰度值分別為0.92±0.09、0.98±0.09，均顯著高于中期組、晚期組患者和對照組(P<0.05)；中期組、晚期組患者COX-2mRNA及蛋白表達(dá)灰度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中期組、晚期組患者COX-2mRNA及蛋白表達(dá)灰度值顯著高于對照組(P<0.05)。結(jié)論膝骨性關(guān)節(jié)炎患者成纖維細(xì)滑膜樣細(xì)胞中COX-2mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于非股性關(guān)節(jié)炎患者，同時(shí)表達(dá)水平早期最高，說明環(huán)氧化酶-2基因可能主要作用于膝骨性關(guān)節(jié)炎患者炎癥病變的早期。

【關(guān)鍵詞】環(huán)氧化酶-2基因；骨關(guān)節(jié)炎；病變；作用

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.007

【中圖分類號】R 684

收稿日期：(2015-02-02)

Study on the role of COX-2mRNA in the process of inflammatory lesion of bone and jointLIGuan,GANLijiao,ZHONGMiaorong.DepartmentofRheumatology,TheThirdPeople’sHospitalofHuizhouCity,Guangdong,Huizhou516002,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the changes of cyclooxygenase-2 gene (COX-2 mRNA) in the process of inflammatory lesion of bone and joint,and to explore its effects on the lesions.MethodsFifty-one patients with knee osteoarthritis (case group) and 20 patients with non knee osteoarthritis (control group) who were admitted into Department of Rheumatism Immunization Diseases of our hospital from 2010 to 2014 were enrolled in the study. According to the process of inflammatory lesion of bone and joint,these patients were redivided into early period group (n=17),middle period group (n=19) and late period group (n=15).The expression levels of COX-2mRNA in fibroblast like synovial cells were detected by Real-time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR),and the expression levels of COX protein were detected by Western Blot.ResultsThe expression gray values of COX-2mRNA and protein in fibroblast like synovial cells in case group were 0.76±0.11,0.85±0.09,respectively, both of them were significantly higher than those in control group (P<0.05). There were significant differences in the expression gray values of COX-2mRNA and protein among early period group,middle period group,late period group (P<0.05). The expression gray values of COX-2mRNA and protein in early period group were 0.92±0.09,0.98±0.09,respectively, both of them were significantly higher than those in middle period group,late period group and control group (P<0.05),however, there were no significant differences in the expression gray values of COX-2mRNA and protein between middle period group and late period group (P>0.05). The expression gray values of COX-2mRNA and protein in middle period group and late period group were significantly higher than those of control group(P<0.05).ConclusionThe expression gray values of COX-2mRNA and protein in fibroblast like synovial cells in patients with knee osteoarthritis are significantly higher than those of patients with non knee osteoarthritis,moreover, the expression levels are the highest at early period,which suggests that cyclooxygenase-2 gene may play an important role in early period of inflammatory lesions of bone and joint in patients with knee osteoarthritis.

【Key words】cyclooxygenase-2 gene; osteoarthritis; lesions; role

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種以關(guān)節(jié)軟骨進(jìn)行性損害的慢性退行性病變[1]，可由高齡、肥胖、關(guān)節(jié)長時(shí)間過度勞損、創(chuàng)傷等因素引起關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生破損，而關(guān)節(jié)周邊和軟骨下骨代償性增生。金屬基質(zhì)蛋白酶(MMPs)和多種炎性因子在OA病變過程中起到重要作用，前者在OA的慢性降解中發(fā)揮重要作用，后者對關(guān)節(jié)炎性病變的發(fā)展具有重要影響。環(huán)氧合酶-2(COX-2)在前列腺素合成過程中發(fā)揮重要作用，其控制著合成反應(yīng)的速度及產(chǎn)物的合成量，間接調(diào)控者前列腺素的生物學(xué)效應(yīng)，調(diào)節(jié)血管的生成和炎性因子的釋放，促進(jìn)OA的進(jìn)展[2]。本文通過分析COX-2在不同分期骨關(guān)節(jié)炎患者中的含量，以探討其在OA中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料以本院風(fēng)濕免疫科2010至2014年收治的51例膝骨性關(guān)節(jié)炎患者(病例組)及20例非膝骨性關(guān)節(jié)炎患者(對照組)為研究對象。病例組51例，男14例，女37例；年齡37～76歲，平均年齡(58.1±11.2)歲；對照組20例，男5例，女15例；年齡35～70歲，平均年齡(54.3±12.8)歲。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)所有患者的診斷均符合2007年中華醫(yī)學(xué)會骨關(guān)節(jié)分會制定的膝骨性關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]；X線Kellgren-Lawrence分級為Ⅰ～Ⅳ級；均在本院接受相關(guān)檢查及治療；對照組患者來自于單純半月板損傷、前交叉韌帶損傷及單純外傷患者。

1.3排除標(biāo)準(zhǔn)合并嚴(yán)重的心、肺、腎、腦等部位的嚴(yán)重疾病或精神性疾病的患者；合并其他類型的風(fēng)濕性疾病患者；近2個(gè)月采用激素治療的患者；孕期或哺乳期女性。

1.4分組方法比較病例組和對照組的成纖維樣滑膜細(xì)胞中COX-2mRNA、蛋白表達(dá)水平。并根據(jù)X線Kellgren-Lawrence分級標(biāo)準(zhǔn)將病例組患者分為早期組(17例，Ⅰ～Ⅱ級)、中期組(19例，Ⅲ級)和晚期組(15例，Ⅳ級)與對照組進(jìn)行比較。

1.5RT-PCR方法關(guān)節(jié)鏡手術(shù)取出的滑膜組織，無菌條件下剪碎、碾磨，用Trazol溶液提取對照組和病例組滑膜組織中的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA。設(shè)計(jì)COX-2mRNA引物，上游序列為：5’-GGTCTGGTGCCTGGTCTGATGATG-3’；下游序列為：5’-GTCCTTTCAAGGAGAATGGTGC-3’。內(nèi)參基因序列為β-actin：上游序列為：5’-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游序列為：5’-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。取對照組和病例組各1.5 μl的cDNA作為模版，分別加入1 μl dNTP，2.5 μl 10×buffer，經(jīng)過高溫變性、退火后進(jìn)行PCR儀檢測。

1.6Western-blot法取對照組和病例組的軟骨組織，經(jīng)過細(xì)胞裂解液、超聲破碎儀處理后，離心，收集上清，然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳。獲得蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(NC)上，25℃封閉60 min，然后加入COX-2蛋白抗體，37℃孵育2 h，多次漂洗后加入二抗，25℃孵育2 h，多次漂洗后，數(shù)碼攝像。

2結(jié)果

2.1病例組和對照組的成纖維細(xì)滑膜樣細(xì)胞中COX-2mRNA及蛋白表達(dá)情況病例組患者成纖維細(xì)滑膜樣細(xì)胞中COX-2mRNA及蛋白表達(dá)灰度值分別為0.76±0.11、0.85±0.09，均顯著高于對照組(P<0.05)。見表1，圖1。

表1　2組患者成纖維細(xì)滑膜樣細(xì)胞中COX-2mRNA及

圖1病例組和對照組成纖維細(xì)滑膜樣細(xì)胞中COX-2mRNA及

蛋白表達(dá)情況

2.2不同膝骨性關(guān)節(jié)炎病變程度患者成纖維細(xì)滑膜樣細(xì)胞中COX-2mRNA及蛋白表達(dá)情況早期組、中期組、晚期組患者和對照組成纖維細(xì)滑膜樣細(xì)胞中COX-2mRNA及蛋白表達(dá)灰度值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；早期組COX-2mRNA及蛋白表達(dá)灰度值分別為0.92±0.09、0.98±0.09，均顯著高于中期組、晚期組和對照組(P<0.05)；中期組、晚期組COX-2mRNA及蛋白表達(dá)灰度值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；中期組、晚期組患者COX-2mRNA及蛋白表達(dá)灰度值顯著高于對照組(P<0.05)。見表2，圖2。

表2　不同膝骨性關(guān)節(jié)炎病變程度患者COX-2mRNA及蛋白表灰度值　 ±s

注：與對照組比較,*P<0.05;與早期組比較,#P<0.05

3討論

骨關(guān)節(jié)炎根據(jù)有無局部和全身致病因素可分為原發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎和繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)炎[3]，到目前為止前者的致病因素仍不確切，可能與老齡、女性、肥胖及關(guān)節(jié)長時(shí)間過度勞累有關(guān)；后者可因關(guān)節(jié)炎癥、代謝和內(nèi)分泌異常導(dǎo)致[4]。骨關(guān)節(jié)炎患者主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛，尤其是清晨起床后關(guān)節(jié)疼痛明顯，適度活動后疼痛減輕，但若過度活動會使疼痛加重。病變關(guān)節(jié)主要的癥狀為腫脹、壓痛、關(guān)節(jié)活動時(shí)有響聲，嚴(yán)重者可有關(guān)節(jié)畸形。臨床上常進(jìn)行血沉、血常規(guī)、X線、CT及MRI等檢查。結(jié)合患者病史和X線表現(xiàn)診斷該病并不困難，必要時(shí)可進(jìn)行關(guān)節(jié)液檢查。目前，骨關(guān)節(jié)炎尚無特效藥，臨床治療的主要目的是減輕關(guān)節(jié)的負(fù)重，延緩病情進(jìn)展，緩解患者癥狀。非甾體消炎藥和鎮(zhèn)痛藥常用于急性期患者緩解癥狀，關(guān)節(jié)置換術(shù)是晚期患者主要的治療措施，是矯正畸形、消除癥狀的最佳方法[5]，可明顯提高患者的生活質(zhì)量。

圖2　不同膝骨性關(guān)節(jié)炎病變程度患者COX-2mRNA及蛋白表灰度值

OA主要的病理改變是軟骨組織的進(jìn)行性退變，實(shí)質(zhì)上是軟骨細(xì)胞的合成和凋亡平衡紊亂，軟骨細(xì)胞分泌的一些細(xì)胞因子增多，造成細(xì)胞外基質(zhì)成分的不斷流失和軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變[6]。

COX是前列腺素合成的必要蛋白酶，而前列腺素在機(jī)體的多種機(jī)能活動中發(fā)揮重要作用。人體內(nèi)的COX主要有兩種同工酶，COX-1和COX-2[7]。COX-1參與機(jī)體的生理活動，如胃黏膜的保護(hù)和調(diào)節(jié)血小板聚集等，后者則在炎癥和腫瘤的發(fā)病過程中發(fā)揮作用。正常情況下，人體內(nèi)不含有COX-2，只有在炎癥或腫瘤等病理刺激下體內(nèi)才可檢測到COX-2。骨關(guān)節(jié)炎病理表現(xiàn)為滑膜炎，軟骨細(xì)胞分泌的IL-1和腫瘤壞死因子(TNF-α)可促進(jìn)滑膜炎癥的進(jìn)展和軟骨結(jié)構(gòu)的損害。IL-1作用于軟骨細(xì)胞和滑膜細(xì)胞，激活G蛋白偶聯(lián)系統(tǒng)和絡(luò)氨酸酶激酶系統(tǒng)[8]，使轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的活性增加，促進(jìn)COX-2mRNA的合成和轉(zhuǎn)錄。COX-2可使關(guān)節(jié)中PGF2含量明顯增加，使軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖和Ⅱ型膠原發(fā)生分解代謝[9]，并抑制它們的合成代謝，使軟骨破壞與合成平衡失調(diào)，破壞大于合成。關(guān)節(jié)液中TNF-α濃度的增加，可促使COX-2濃度增加，進(jìn)而促使COX-2發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。TNF-α還可直接抑制Ⅱ型膠原和連接蛋白的基因表達(dá)過程[10]，使軟骨基質(zhì)無法合成。

據(jù)報(bào)道，采用COX-2選擇抑制劑治療OA患者，可明顯減輕患者關(guān)節(jié)軟骨的損害[11]。本文病例組患者成纖維細(xì)滑膜樣細(xì)胞中COX-2mRNA及蛋白表達(dá)明顯高于對照組，說明OA患者受累關(guān)節(jié)內(nèi)COX-2基因處于高表達(dá)，為臨床選擇COX-2選擇性抑制劑藥物治療提供理論依據(jù)。本文還發(fā)現(xiàn)早期組COX-2mRNA及蛋白表達(dá)高于中期組、晚期組患者，都高于對照組患者，但中期組、晚期組患者COX-2mRNA及蛋白表達(dá)相當(dāng)，說明COX-2基因在疾病早期表達(dá)最高，該時(shí)期選擇COX-2選擇性抑制劑治療，其療效可能更佳，但本文樣本量較小，且目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)證實(shí)[12]，故其說服力稍顯不足。因此，后續(xù)研究針對不同分期OA患者受累關(guān)節(jié)內(nèi)的COX-2基因的表達(dá)及作用機(jī)制的研究十分必要。

綜上所述，膝骨性關(guān)節(jié)炎患者的成纖維細(xì)滑膜樣細(xì)胞中COX-2mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著高于非骨性關(guān)節(jié)炎患者，且在病變早期表達(dá)量最高，說明COX-2在OA病變軟骨組織的損害過程中占據(jù)重要地位，抑制COX-2基因的表達(dá)可有效緩解關(guān)節(jié)軟骨的破壞。

參考文獻(xiàn)

1曾明珠,段戡,袁長深,等.不同分期骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞中COX-2 mRNA表達(dá)的差異.中國組織工程研究,2014,18:1003-1007.

2孫海兵,魏永長,涂宏蕾,等.COX-2、PKC-α和miR-101在胃癌中的表達(dá)及相關(guān)性.南方醫(yī)科大學(xué)報(bào),2013,33:559-562.

3楊紹春.COX-2抑制劑與NSAID聯(lián)合PPI治療骨關(guān)節(jié)病消化道不良反應(yīng)的Meta分析.山東醫(yī)藥,2014,54:70-72.

4翁文杰,李佳怡,王渭君,等.全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)后應(yīng)用6周環(huán)氧化酶-2抑制劑的療效分析.中華關(guān)節(jié)外科雜志(電子版),2014,8:166-170.

5冀全博,張強(qiáng),王巖.帶有血小板凝血酶敏感蛋白結(jié)構(gòu)域的解聚素與金屬蛋白酶4、5在骨關(guān)節(jié)炎中作用的研究進(jìn)展.中國修復(fù)重建外科雜志,2013,27:1080-1084.

6Smith MM,Cake MA,Ghosh P,et al.Significant Synorial pathology in a meniscectomy model of osteo-arthritis:modification by intra-articular hyaluronan therapy.Rheumatology(Oxford),2008,47:1172-1178.

7高宗強(qiáng),郭雄,陳君長,等.透明質(zhì)酸對體外培養(yǎng)的大骨節(jié)病和骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞透明質(zhì)酸合成酶2 mRNA表達(dá)的影響.中國全科醫(yī)學(xué),2014,17:3575-3578.

8周斌,張方杰,羅偉,等.透明質(zhì)酸對人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞骨橋蛋白和CD44表達(dá)的影響.中國組織工程研究,2014,18:6172-6178.

9潘丁,雷光華.蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)技術(shù)在骨關(guān)節(jié)炎研究中的應(yīng)用與進(jìn)展.中國組織工程研究,2014,18:3912-3918.

10Krasnokutsky S,Attur M,Palmer G,et al.Current concepts in the pathogenesis of Osteoarthritis.Osteoarthritis Cartil,2008,16:1-3.

11楊紹春,王可良,趙成禮,等.選擇性COX-2抑制劑與非選擇性COX抑制劑預(yù)防全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)后異位骨化的Meta分析.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2014,30:1299-1302.

12黃軍,劉映孜,袁霜雪,等.環(huán)氧酶-2在骨形態(tài)蛋白9誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞骨向分化中的作用研究.中國藥理學(xué)通報(bào),2014,30:1006-1011.