miR129在胃腺癌中的表達及意義

論著

miR129在胃腺癌中的表達及意義

牟時斌牟云高峰

作者單位： 054900河北省臨西縣人民醫(yī)院(牟時斌);河北省民政總醫(yī)院(牟云);河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院(高峰)

【摘要】目的探討microRNA129(miR129)在胃管狀腺瘤、胃癌組織及其對應的癌旁組織中的表達及其臨床意義。方法收集經(jīng)高年資病理醫(yī)師確診的55例管狀腺瘤、76例胃腺癌組織及對應的癌旁組織，分別用原位雜交方法檢測miR129的表達，分析miR129表達與臨床病理參數(shù)之間的關系。結(jié)果癌旁胃黏膜組織中miR-129的表達陽性率高于胃管狀腺瘤組織，胃管狀腺瘤組織中miR-129的表達陽性率高于胃腺癌組織(P<0.05)。miR129在高分化胃癌組織中陽性表達率高于中、低分化組織(P<0.05)；臨床分期Ⅰ期中的陽性表達率高于Ⅲ期;無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織中的表達陽性率高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組織(P<0.05)；胃管狀腺癌中miR129陽性率高于彌漫型腺癌(P<0.05)。結(jié)論miR129在胃腺癌組織內(nèi)低表達，發(fā)揮著抑癌基因的作用；miR129可作為胃腺癌的判斷預后的標志物。

【關鍵詞】病理學；腺癌；原位雜交；miR-129；抑癌基因

doi:10.3969/j.issn.1002-7386.2015.20.005

【中圖分類號】R 735.2

收稿日期：(2015-03-10)

Expression and clinical significance of miR129 in gastric adenocarcinomaMOUShibin*,MOUYun,GAOFeng.*People’sHospitalofLinxiCounty,Hebei,Linxi054900,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the expression and clinical significance of microRNA129 (miR129) in gastric tubular adenoma tissues,gastric adenocarcinoma tissues and corresponding para-carcinoma tissues.MethodsFifty-five cases of gastric tubular adenoma, 76 cases of gastric adenocarcinoma and corresponding para-carcinoma tissues that were identified by senior pathology doctors were enrolled in the study. The expression levels of miR-129 were detected by in situ hybrization,and the correlation between miR129 expression and clinicopathological parameters was analyzed.ResultsThe positive expression rate of miR-129 in para-carcinoma gastric mucosa tissues was significantly higher than that in gastric tubular adenoma tissues,moreover, which in gastric tubular adenoma tissues was significantly higher than that in gastric adenocarcinoma tissues (P<0.05). The positive expression rate in well differentiated gastric cancer tissues was significantly higher than that in moderately differentiated and poorly differentiated tissues (P<0.05). The positive expression rate of miR-129 in stageⅠcarcinoma tissues was obviously higher than that in stage Ⅲ carcinoma tissues,furthermore, which in carcinoma tissues without lymphonode metastasis was significantly higher than that in carcinoma tissues with lymphonode metastasis (P<0.05). The positive expression rate of miR-129 in gastric tubular adenoma was significantly higher than that in diffuse type adenocarcinoma (P<0.05).ConclusionThe expression levels of miR129 are down-regulated in gastric adenocarcinoma,which may play a role of anti-oncogene,thus miR-129 may be regarded as a marker for evaluating the prognosis of patients with gastric adenocarcinoma.

【Key words】pathology;adenocarcinoma;hybridization in situ;miR-129;anti-oncogene

胃癌是人類常見的惡性腫瘤之一，在國內(nèi)較為常見，且病死率高。它位居惡性腫瘤死亡的首位,由于胃癌往往沒有特征性的癥狀及體征，許多胃癌患者確診時往往已經(jīng)處于中晚期[1]，貽誤了最佳治療時機，所以尋找胃癌的標志物是非常必要的。MicroRNA是一類約22個核苷酸組成的非編碼RNA，通過與mRNA的3’URT結(jié)合而使其降解或翻譯受阻[2]，進而在轉(zhuǎn)錄后水平抑制靶基因的表達，研究顯示miRNA在多種人類腫瘤中表達紊亂[3]，并參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移[4-6]。

1資料與方法

1.1一般資料收集2005至2013年在臨西縣人民醫(yī)院經(jīng)手術切除的胃癌標本76例，癌腫原發(fā)病灶最大直徑2.0～5.0 cm，并選取每個病例中對應的癌旁正常胃黏膜(距離癌灶>5 cm)作為對照，另選取胃黏膜管狀腺瘤標本55例，所選標本均采用甲醛固定，石蠟包埋，按照WHO分級標準分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三級，分期采用TNM分期系統(tǒng)分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期。所選76例中男40例，女36例；平均年齡48歲?；颊咝詣e、年齡、分級、分期，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及Laurens分型是通過復習患者病理記錄底單而獲得。

1.2主要試劑miR129互補(其堿基序列為5’-AAGTGACTGAAACGTAGCCT-3’)探針，poly d(T)陽性對照探針及miR129正義陰性對照探針均購于北京金薩卜生物科技公司，胃蛋白酶K、雜交液及NBT/BCIP顯色液均購于北京中杉金橋公司。

1.3原位雜交(1)貼附有胃癌及癌旁組織的石蠟切片二甲苯脫蠟、梯度酒精水化。(2)用胃蛋白酶室溫消化90～120 s以暴露RNA的核酸片段。(3)切片滴加20 μl預雜交液40℃ 恒溫處理3 h。(4)每張切片滴加20 μl稀釋探針，蓋上蓋玻片42℃雜交過夜。(5)揭掉蓋玻片，室溫下，用SSC洗滌3次，滴加封閉液。(6)滴加生物素化鼠抗地高辛，37℃ 處理1 h，洗滌。(7)滴加SABC 37℃ 處理20 min,0.5 mol/L PBS沖洗。(8)玻片滴加生物素化過氧化物酶37℃ 20 min,PBS沖洗。(9)用NBT/BCIP顯色試劑在玻片上染色。

1.4結(jié)果判定標準原位雜交切片以胞漿或胞核內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性表達判定標準，每張切片在顯微鏡下隨機選取10個視野，每個視野均計數(shù)100個細胞，結(jié)合表達情況應用改進的雙評分半定量法評分：陽性細胞數(shù)0計為0分，1%～25%計為1分，26%～50%計為2分，51%～75%計為3分，76%～100%計為4分；細胞著色強度:細胞未著色計為0分，淡黃色計為1分，黃棕色計為2分，棕色計為3分。二種計分相乘，得分0～3分作為陰性(-)表達，4～12分計為陽性(+)表達。

1.5統(tǒng)計學分析應用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結(jié)果

2.1癌旁胃黏膜、胃管狀腺瘤及原發(fā)性胃腺癌中miR-129的表達在癌旁胃黏膜、胃管狀腺瘤及原發(fā)性胃腺癌中miR129表達的陽性率為94.7%、83.6%、75.0%，其陽性程度隨著病變程度的加深而減低(P<0.05)，且不同組別之間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1，圖1～5。

表1　miR129在不同胃組織中的表達　例(%)

圖1miR129在癌旁胃黏膜中呈強陽性表達(DAB顯色,×200)

圖2miR129在胃腺瘤中呈較強陽性表達(DAB顯色,×200)

2.2胃腺癌中miR129的表達與臨床病理參數(shù)之間的關系miR-129在WHO分化Ⅰ級比WHOⅡ級中的表達陽性率高，在WHOⅡ級比WHOⅢ級中陽性率高;miR-129在Ⅰ期中的陽性率比Ⅱ期中高，在Ⅱ期比Ⅲ期高;miR-129在無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的陽性率比有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中高；miR129在胃腸型腺癌中的陽性率高于彌漫型腺癌，以上差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。不同性別、年齡組患者胃腺癌組織中miR-129的表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

圖3miR129在高分化胃腺癌中呈陽性表達(DAB顯色,×400)

圖4miR129在中分化腺癌中呈弱陽性表達(DAB顯色,×400)

圖5miR129在低分化胃腺癌中極弱陽性表達(DAB顯色,×400)

表2　臨床病理參數(shù)與miR129表達之間的關系　例(%)

3討論

最近十余年來，越來越多的證據(jù)表明miRNA參與了包括癌癥在內(nèi)的人類疾病的發(fā)病過程。據(jù)報道，在一些癌癥中存在著miR129的異常表達，并直接涉及了癌癥的發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移等過程[7-9]。這些資料提示miR-129在多種癌癥中起著不同的作用，但是對胃癌患者中miR129的表達與胃癌患者預后之間的關系還知之甚少。本研究側(cè)重于miR129的表達水平與胃癌各種臨床病理參數(shù)之間潛在的關系。由于miRNA在甲醛固定的標本中能得到較好的保存，這就是使其在常規(guī)的組織研究中成為富有價值的研究對象[10]。以前的研究多采用RT-PCR方法揭示了miR-129與膠質(zhì)母細胞瘤的預后較差明顯相關[11]。這些關于miRNA臨床預后的研究都是通過提取癌組織蠟塊中RNA并采用qRT-PCR方法來實現(xiàn)的。癌組織塊中既包含實質(zhì)性腫瘤細胞，又包含腫瘤相關間質(zhì)細胞，所以采用從整體癌組織中的RNA提取物進行實驗很可能會產(chǎn)生錯誤的結(jié)果。近來資料顯示在腫瘤間質(zhì)細胞中也存在microRNA的高表達[12]。原位雜交的主要優(yōu)點是能在細胞水平上精確檢測陽性信號。

經(jīng)過本次研究，我們發(fā)現(xiàn)miR129表達于良性胃黏膜上皮細胞的胞漿之中，在胃癌細胞中的表達則明顯降低；并且miR129的表達隨著胃癌分級、分期的加重及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)而降低；miR-129在腸型腺癌中的表達高于彌漫型腺癌。有研究報道，miR-129在結(jié)腸癌[13，14]及肝癌[15]中表達降低，并且miR129的表達降低與結(jié)腸癌的臨床分期及演進明顯正相關[13]，這與本研究的結(jié)果相一致。有人報道結(jié)腸癌中的miR129的表達降低是由于miR-129基因啟動子的高甲基化引起的[15]。最近幾年的研究結(jié)果顯示在子宮內(nèi)膜癌中miR-129的作用的靶標是SOX4基因，由于miR129啟動子的甲基化導致miR-129的表達的降低，從而導致在癌變過程中SOX4的表達升高[16]，類似的結(jié)果也見于食管癌及肝細胞肝癌[17，18]。在上述癌癥中SOX4基因的高表達在癌癥演進及轉(zhuǎn)移過程中起著非常重要的作用[19]。除了SOX4，最近的研究表明在結(jié)腸癌中miR-129通過抑制Bcl-2的表達而發(fā)揮調(diào)節(jié)癌細胞凋亡的關鍵作用[20]，miR-129還通過抑制E2F3的表達而影響細胞周期。目前充足的證據(jù)表明miR-129的表達缺失與結(jié)腸癌，肝癌及胃癌等惡性腫瘤的演進密切相關，所以miR-129能作為胃癌等惡性腫瘤的預后因子。

由于miRNA不但能在甲醛固定石蠟包埋的組織中而且能在細胞外穩(wěn)定存在，所以可以作為通過抽血而測定的具有可重復性的生物標記物[21]，因此檢測miR-129可能作為胃癌的無創(chuàng)性的重要輔助診斷工具；通過檢測胃液中的miR-129的濃度還能判斷胃癌的預后[22]。

總之，我們的實驗結(jié)果顯示miR129在胃癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著抑癌基因的作用，miR-129的表達下調(diào)預示著胃癌預后較差。miR-129有望成為判斷胃癌預后的重要手段。

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