Tat-LK15運載siRNA沉默RGC-5神經(jīng)細胞nNOS基因的實驗研究

彭　捷,饒　云,陸建華,吳昊澎,楊秀環(huán),屠偉峰

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院麻醉科，廣東廣州　510010)

Tat-LK15運載siRNA沉默RGC-5神經(jīng)細胞nNOS基因的實驗研究

彭捷,饒云,陸建華,吳昊澎,楊秀環(huán),屠偉峰

(廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院麻醉科，廣東廣州510010)

中國圖書分類號：R329.25；R341.6；R342.2；R394.2；R441.1；R741.02

摘要：目的探討離體條件下細胞穿透肽Tat-LK15運載小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)沉默RGC-5視神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell line, RGC-5)神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)基因的可行性，為在體條件下研究Tat-LK15運載siRNA沉默nNOS表達治療神經(jīng)病理性疼痛提供理論依據(jù)。方法① 通過凝膠阻滯分析測定Tat-LK15與siRNA的最佳交聯(lián)比。流式細胞術檢測Tat-LK15/ FAM-siRNA以最佳交聯(lián)比轉(zhuǎn)染RGC-5細胞的轉(zhuǎn)染效率；不同劑量Tat-LK15(1、2.5、5、10和20 μg)孵育RGC-5細胞24 h，流式細胞術檢測細胞凋亡率。② 制備nNOS高表達的RGC-5細胞模型。③ 將RGC-5細胞隨機分為5組：對照組、模型組、Tat-S組(Tat-LK15運載nNOS/siRNA轉(zhuǎn)染模型細胞)、Lipo-S組(LipofectamineTMRNAiMAX運載nNOS/siRNA轉(zhuǎn)染模型細胞)及Tat-N組(Tat-LK15運載NCsiRNA轉(zhuǎn)染模型細胞)，通過Q-PCR及Western blot檢測各組nNOS表達水平。 結果Tat-LK15與siRNA質(zhì)量比為2 ∶1時可完全包裹siRNA，達到最佳交聯(lián)，此時其轉(zhuǎn)染效率為(84.4±3.9)%。當Tat-LK15劑量為20 μg(6.1 μmol·L-1)時才出現(xiàn)一定細胞毒性，細胞凋亡率高于對照組[(10.3±1.1)% vs (7.4±0.9)%，P<0.05]。造模后RGC-5細胞nNOS表達水平明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，Tat-S組nNOS mRNA及蛋白表達水平降低(P<0.05)，Tat-S組與Lipo-S組相比無差異(P>0.05)。 結論Tat-LK15能高效轉(zhuǎn)染siRNA，細胞毒性低，離體條件下可有效運載siRNA沉默nNOS的基因表達。

關鍵詞：細胞穿透肽；Tat；siRNA；基因治療；神經(jīng)型一氧化氮合酶；神經(jīng)病理性疼痛

神經(jīng)元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase, nNOS)是脊髓、大腦等神經(jīng)系統(tǒng)中催化L-精氨酸(L-Arg)產(chǎn)生重要的神經(jīng)介質(zhì)——一氧化氮(nitric oxide, NO)的關鍵酶，nNOS在神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生、發(fā)展過程中具有重要作用[1]。通過RNA干擾技術抑制nNOS的過度表達是治療神經(jīng)病理性疼痛的新途徑。小干擾RNA(small interference RNA，siRNA)本身易被核酸酶降解、穩(wěn)定性差、親水性強且?guī)ж撾姡灰淄高^細胞膜進入胞內(nèi)發(fā)揮作用。高效、安全siRNA遞送載體的缺乏嚴重限制了RNA干擾技術的臨床應用。

細胞穿透肽(cell penetrating peptides，CPPs)是一類由5~30個氨基酸組成的短肽，能將核酸片段、蛋白、多肽、噬菌體顆粒及磁性粒子等多種物質(zhì)以非受體依賴的方式導入胞內(nèi)，效率高、細胞毒性低，也不受細胞類型的限制[2]。CPPs與寡核苷酸形成的納米復合物穩(wěn)定性良好，在血清中不易被降解，轉(zhuǎn)染效率甚至優(yōu)于陽離子脂質(zhì)體[3]。目前CPPs已在基因生物治療、腫瘤靶向藥物開發(fā)等領域逐步展現(xiàn)出誘人的前景，受到廣泛關注[4]。

Tat(transactivator of transcription)是人類免疫缺陷病毒1型(HIV-1)基因編碼的反式轉(zhuǎn)錄激活因子，是當前最受矚目、研究最為深入的CPPs之一。Tat全長86個氨基酸，第49-57位(RKKRRQRRR)9個氨基酸是其發(fā)揮穿膜功能的核心序列[5]。Saleh等[6]發(fā)現(xiàn)該核心序列與膜活化多肽LK15(KLLKLLLKLLLKLLK)融合形成的細胞穿膜肽Tat-LK15運載siRNA轉(zhuǎn)染細胞的能力為單獨應用Tat時的2倍。因此，Tat-LK15或許可以作為一種良好的siRNA運載工具，明顯優(yōu)化RNA干擾技術在治療神經(jīng)病理性疼痛等方面的應用。

本研究在建立nNOS高表達的RGC-5視神經(jīng)節(jié)細胞(retinal ganglion cell line,RGC-5)模型的基礎上，探討Tat-LK15運載siRNA沉默模型細胞nNOS基因表達的可行性，為后期在體應用RNA干擾技術抑制神經(jīng)系統(tǒng)nNOS過度表達來治療神經(jīng)病理性疼痛提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑與儀器DMEM-高糖培養(yǎng)基(Hyclone，Cat.No.SH30022.01B)，DMEM-低糖培養(yǎng)基(Hyclone，Cat.No.SH30021.01B)，胎牛血清(Hyclone，Cat.No.SH30087.01)，Opti-MEM(invitrogen，Cat.No.31985070)，青、鏈霉素(Hyclone，Cat.No. SH30010)，F(xiàn)AM-siRNA(上海吉瑪)，nNOS/siRNA和NCsiRNA(Sigma，美國)，Tat-LK15(廈門博欣生物)，LipofectamineTMRNAiMAX(invitrogen，13778075)，anti-nNOS(Abcam，ab76067)，Goat Anti-Rabbit IgG(Southern Biotech，4050-05)，倒置光學顯微鏡(OLYMPUS CKX41，U-CTR30-2)，倒置熒光顯微鏡(Leica，DMI6000B)，流式細胞儀(BD，F(xiàn)ACS Calibur)，紫外分光光度計(艾本德，BioPhotometer plus)，SYBR Green qPCR SuperMix(Invitrogen，15596-026)，PCR儀ABI PRISM?7500(ABI)，凝膠成像系統(tǒng)Doc Gel 2000型(BIO-RAD)。

1.1.2細胞株與分組大鼠視神經(jīng)節(jié)細胞RGC-5(廣州萊德爾生物)，制備高表達nNOS蛋白的RGC-5神經(jīng)細胞模型。隨機分為5組：對照組(正常細胞)、模型組(nNOS高表達)、Tat-S組(Tat-LK15運載nNOS/siRNA轉(zhuǎn)染模型細胞)、Lipo-S組(Lipo運載nNOS/siRNA轉(zhuǎn)染模型細胞)及Tat-N組(Tat-LK15運載NCsiRNA轉(zhuǎn)染模型細胞)。

1.2方法

1.2.1siRNA序列與Tat-LK15nNOS雙鏈siRNA正義鏈：5′-CAAGUUCCGCCUCACGUAUdTdT-3′， 反義鏈：5′-AUACGUGAGGCGGAACUUGdTdT-3′；NCsiRNA正義鏈： 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反義鏈：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。Tat-LK15序列：RKKRRQRRRGGGKLLKLLLKLLLK

LLK，純度95%， 分子量：3 283.4 g·mol-1。

1.2.2凝膠阻滯測定Tat-LK15/siRNA最佳交聯(lián)比siRNA質(zhì)量恒定為100 ng，Tat-LK15和siRNA以質(zhì)量比為1 ∶3、1 ∶2、1 ∶1、2 ∶1、3 ∶1混合孵育20 min后上樣，20%非變性聚丙烯酰胺凝膠，電壓1.8 V·cm-1，低溫電泳2 h。之后將凝膠在0.5 mg·L-1的EB溶液中染色45 min，觀察并拍照。

1.2.3細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染細胞RGC-5細胞使用DMEM-高糖培養(yǎng)基(添加10%胎牛血清和1%青、鏈霉素)，置于含5%CO2、37 ℃的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，取6孔板以細胞密度為每孔1×105個細胞接種，細胞培養(yǎng)至融合度為30%~50%時，去完全培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加1 mL Opti-MEM培養(yǎng)基準備轉(zhuǎn)染。Opti-MEM培養(yǎng)基500 μL稀釋FAM-siRNA至終濃度50 nmol·L-1；Opti-MEM培養(yǎng)基500 μL稀釋Tat-LK15，Tat-LK15與FAM-siRNA質(zhì)量比為2 ∶1(最佳交聯(lián)比)。孵育20 min后加到相應細胞培養(yǎng)板中，終培養(yǎng)基2 mL進行轉(zhuǎn)染，4 h后去轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基，PBS洗2遍，加入完全培養(yǎng)基置于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中。24 h后用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果并拍照，流式細胞術檢測轉(zhuǎn)染效率，并與LipofectamineTMRNAiMAX (Lipo)5 μL相比較。

1.2.4流式細胞術檢測細胞轉(zhuǎn)染效率轉(zhuǎn)染24 h后收集細胞，重懸于預冷的1×結合緩沖液中使得其密度大約為每毫升1×106細胞，流式細胞儀檢測分析(激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長為520 nm)，計數(shù)10 000個細胞計算陽性細胞百分率，所有步驟避光進行。

1.2.5流式細胞術檢測細胞凋亡率提前1 d取6孔板以細胞密度1×105/孔接種培養(yǎng)。取Tat-LK15 1、2.5、5、10和20 μg分別孵育細胞24 h，并與正常細胞進行對照。處理結束收集細胞，PBS重懸，細胞密度約每毫升1×106個細胞。取0.5 mL離心去上清，加入500 μL 1×結合緩沖液混勻。再依次加入1.25 μL Annexin V-FITC，10 μL PI輕輕混勻；室溫(18~24)℃避光反應15 min，1 h內(nèi)檢測。

1.2.6制備高表達nNOS的細胞模型以缺氧缺糖(oxygen-glucose deprivation，OGD)和高鹽(濃度145 mmol·L-1)的處理方式制備nNOS高表達的細胞模型[7]。將厭氧培養(yǎng)產(chǎn)氣劑1包和厭氧指示劑放入方形培養(yǎng)罐制造缺氧模型，同時放入細胞培養(yǎng)板，以37 ℃、飽和濕度培養(yǎng)細胞。當指示劑在氧含量低于0.1%時(呈粉紅色)開始計時，24 h后缺氧結束，置入普通培養(yǎng)箱復氧48 h后進行相關檢測。

1.2.7Tat-LK15/siRNA對nNOS的沉默效率造模成功后取5組細胞，siRNA終濃度為50 nmol·L-1，TAT-LK15與siRNA交聯(lián)比為2 ∶1 (μg/μg)，Lipo 5 mL。在造模缺氧24 h后取細胞板置于普通培養(yǎng)箱開始復氧，同時進行轉(zhuǎn)染，復氧48 h(即轉(zhuǎn)染48 h)后收集細胞檢測nNOS mRNA和蛋白相對表達量。

1.2.8Q-PCR檢測nNOS mRNA收集細胞用TRIzol提取總RNA，紫外分光光度計測定總RNA純度，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。nNOS上游引物：5′-GGACGCTGGTGTATTCATCA-3′，下游引物：5′- AAGGCGATGGACTCAGATCT-3′ 擴增片段長度120 bp；β-actin上游引物：5′- AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3′，下游引物：5′- GAACCGCTCATTGCCGATAG-3′ 擴增片段長度150 bp。PCR反應條件為：50 ℃ 熱啟動2 min，95 ℃預變性2 min后進入循環(huán)； 95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸讀板32 s，共50個循環(huán)，設置3個復孔。以SDS v1.4軟件對結果進行分析。

1.2.9Western blot檢測nNOS蛋白收集細胞，加入預冷的細胞裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。將調(diào)整的樣品和上樣緩沖液按4 ∶1混合，煮沸5 min蛋白變性；按每泳道總蛋白50 μg上樣量進行SDS-PAGE電泳(分離膠濃度6%，濃縮膠濃度5%)，待溴酚藍電泳至接近分離膠底部時結束電泳。轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉，與稀釋的anti-nNOS一抗(1 ∶1 000)4℃過夜，洗滌后再加入Goat anti-rabbit IgG二抗(1 ∶20 000)中37 ℃孵育1 h，漂洗后ECL顯色，暗室進行曝光、顯影和定影，經(jīng)掃描后使用Gel-Pro analyzer分析軟件分析蛋白條帶灰度值，計算nNOS蛋白相對表達水平。

2結果

2.1Tat-LK15與siRNA最佳交聯(lián)比非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳顯示，隨著Tat-LK15劑量增加，核酸條帶亮度逐漸變淡，當質(zhì)量比為2 ∶1時電泳條帶完全消失。說明在質(zhì)量比2 ∶1(μg/μg)時，Tat-LK15已能充分交聯(lián)siRNA(Fig 1)。

Fig 1Complex formation of Tat-LK15/siRNA electrophoresis

0: free siRNA; 1, 2, 3, 4, 5 respectively as complex formation Tat-LK15 and siRNA weight ratio of 1 ∶3, 1 ∶2, 1 ∶1, 2 ∶1 and 3 ∶1 (μg/μg).

2.2最佳交聯(lián)比時Tat-LK15/siRNA的轉(zhuǎn)染效率Tat-LK15與FAM-siRNA (50 nmol·L-1) 質(zhì)量比為2 ∶1 (μg/μg) 時，流式細胞術檢測其轉(zhuǎn)染效率為(84.4±3.9)%，低于Lipo 5 μl的 (95.6±2.4)%(P<0.05)，見Fig 2、3。

Fig 2Transfection efficiency examined by flow cytometry

A:Blank group;B: Tat-LK15 and siRNA weight ratio of 2 ∶1(μg/μg);C:Lipo 5 μL.

Fig 3　Transfection of RGC-5 cells transfected with FAM-siRNA (Inverted fluorescence microscope×100)

*P<0.05vsblank group.

2.3Tat-LK15作用于細胞的凋亡率Tat-LK15劑量增加到20 μg (6.1 μmol·L-1) 時，才開始出現(xiàn)一定的細胞毒性，細胞凋亡率高于對照[(10.3±1.1)%vs(7.4±0.9)%，P<0.05]。說明其細胞毒性低，具有良好的生物安全性(Tab 1)。

2.4制備高表達nNOS的細胞模型經(jīng)過缺氧缺糖高鹽處理后RGC-5細胞nNOS蛋白表達增高(P<0.05)；單純OGD處理nNOS表達無明顯變化(P>0.05)。因此，缺氧缺糖高鹽處理可以得到理想的nNOS高表達細胞模型(Fig 4、5)。

2.5Tat-LK15/siRNA的沉默效率與模型組相比，Tat-S組nNOS mRNA表達降低63.1%，蛋白表達降低62.9%，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。Tat-N組與模型組，Tat-S組與Lipo-S組nNOSmRNA及蛋白表達水平無差異(P>0.05)，見Fig 6、7、8。

3討論

神經(jīng)病理性疼痛是神經(jīng)系統(tǒng)結構受損或功能障礙所導致的疼痛，是目前亟待解決的臨床問題。nNOS在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)不同水平的過度表達是神經(jīng)病理性疼痛形成、維持和發(fā)展的重要機制[8]。采用RNA干擾技術特異性沉默過度表達的nNOS則是治療神經(jīng)病理性疼痛的新思路。

Fig 4Western blot of nNOS expression in RGC-5

cells exposed to OGD

Fig 5Relative expression of nNOS protein in

RGC-5 cells exposed to OGD

C:Normal cells;OGD:Exposed to oxygen-glucose deprivation; OGD+high NaCl: Exposed to oxygen-glucose deprivation and 145 mmol·L-1NaCl,*P<0.05vsC group.

Fig 6Relative expression of nNOS mRNA in RGC-5 cells interfered by Tat-LK15/siRNA

*P<0.05vsmodel group；#P<0.05vsTat-N group.

Fig 7Western blot of nNOS expression in RGC-5 cells in groups

Fig 8Western blot of quantification of Tat-LK15

mediated nNOS knockdown in RGC-5 cells

*P<0.05vsmodel group；#P<0.05vsTat-N group.

要將siRNA成功導入細胞內(nèi)并發(fā)揮干擾效應，安全高效的基因載體是關鍵。常用的siRNA載體包括病毒載體系統(tǒng)和陽離子脂質(zhì)體等，前者可能導致嚴重的免疫反應，并有潛在的病毒體內(nèi)復制擴散的風險[9]；后者具有一定細胞毒性，干擾細胞代謝，動物實驗表明，在體使用陽離子脂質(zhì)體可誘發(fā)肺部炎癥，甚至產(chǎn)生嚴重肺損傷[10]。而CPPs具轉(zhuǎn)染效率高、無毒、無免疫性的特點，可將包括siRNA在內(nèi)的多種物質(zhì)以非受體依賴、非經(jīng)典內(nèi)吞的方式直接導入胞內(nèi)，且不受細胞類型的限制。有研究證實，CPPs介導的寡聚核苷(oligonucleotides，ONs)可有效地抑制目的基因的表達，且不會激發(fā)體內(nèi)的免疫反應，彰顯了CPPs-Ons復合物在基因治療領域的希望和巨大潛力[11]。

HIV-Tat是現(xiàn)今研究最廣泛最深入的細胞穿透肽之一，Tat蛋白轉(zhuǎn)導域已被廣泛用于物質(zhì)轉(zhuǎn)運方面的研究，如化學合成Tat融合蛋白，或構建包含Tat和目的蛋白基因的質(zhì)粒載體產(chǎn)生Tat融合蛋白，導入宿主細胞或用于在體研究等[12]。值得注意的是，目前隨著Tat介導核酸跨膜轉(zhuǎn)運的研究逐步深入。Park等[13]發(fā)現(xiàn)Tat能夠攜帶質(zhì)粒DNA穿過細胞膜進行基因轉(zhuǎn)染，并對細胞活性無明顯影響。Hyunmin 提出Tat-PAMAM融合蛋白可有效提高轉(zhuǎn)導效率，成功用于介導抗體和siRNA的傳送[14]。Eguchi等[3]通過結合一個雙鏈RNA結合域(double strand RNA Binding Domain，DRBD)修飾的Tat蛋白結構域(即Tat-DRBD融合蛋白)可以包裹siRNA上的負電荷骨架，防止其沉淀聚集，從而改善Tat對siRNA的轉(zhuǎn)染效率，甚至優(yōu)于脂質(zhì)體。Alain Pluen等證實Tat-LK15運載siRNA轉(zhuǎn)染細胞的能力為單獨應用Tat時的2倍。Arthanari等[15]則指出膜活化多肽LK15修飾的Tat(Tat-LK15)可高效地介導基因的傳遞，而細胞毒性在其濃度10 μmol·L-1時，即使用劑量的50倍才會開始出現(xiàn)。綜上可見，Tat相關載體核酸轉(zhuǎn)染效率高，細胞毒性低，在核酸轉(zhuǎn)運方面可能具有良好的應用前景。

本研究發(fā)現(xiàn)Tat-LK15與siRNA質(zhì)量比為2 ∶1時可完全包裹siRNA。Tat-LK15/siRNA在此交聯(lián)比時轉(zhuǎn)染RGC-5細胞的效率可達(84.4±3.9)%，低于Lipo的(95.6±2.4)%。Tat-LK15孵育RGC-5神經(jīng)細胞時，增加Tat-LK15的劑量并沒有引起明顯的細胞毒性，僅當劑量增至實驗劑量的10倍(20 μg)時才開始出現(xiàn)輕微的影響。構建nNOS高表達的細胞模型后，Tat-LK15/siRNA轉(zhuǎn)染模型細胞，其nNOS mRNA表達降低63.1%，蛋白表達降低62.9%，效果與Lipo相當，甚至略優(yōu)于Lipo。由此可見，盡管Tat-LK15的細胞轉(zhuǎn)染效率略低于Lipo，但其細胞毒性極低，安全優(yōu)勢突出，且最終的轉(zhuǎn)染效果并不亞于Lipo，可以作為運載siRNA干擾神經(jīng)細胞nNOS表達的有效工具。本實驗結果也為后期探討Tat-LK15在體條件下運載siRNA干擾nNOS過度表達治療神經(jīng)病理性疼痛打下提供了理論依據(jù)。

綜上所述，Tat相關載體作為最有應用前景的CPPs，在核酸轉(zhuǎn)運等方面已經(jīng)得到廣泛的研究和關注，各類研究成果已逐步向臨床應用等方面轉(zhuǎn)化，相信經(jīng)過不懈的努力，Tat相關載體做為有效的核酸轉(zhuǎn)運手段，將在疾病的基因治療等領域發(fā)揮不可低估的作用。

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網(wǎng)絡出版時間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.026.html

Delivery of therapeutic siRNA by Tat-LK15 targeting

nNOS fusion gene in RGC-5 cells

PENG Jie, RAO Yun, LU Jian-hua, WU Hao-peng, YANG Xiu-huan, TU Wei-feng

(DeptofAnesthesiology,GuangzhouGeneralHospitalofGuangzhouMilitaryCommand,Guangzhou510010,China)

Abstract：AimTo investigate the potential application of a non-viral gene carrier Tat-LK15 for delivering siRNA targeting nNOS in vitro, which provides evidence of Tat-LK15 mediating siRNA targeting nNOS in vivo for treatment of neuropathic pain. Methods1. Tat-LK15 was mixed with siRNA, then the mixture was analyzed the best ratio by Gel retardation. The transfection efficiency of FAM-siRNA mediated by Tat-LK15 on RGC-5 cells was examined by Flow Cytometry. The apoptosis ratio of RGC-5 was identified by Flow Cytometry 24h after treated with the different doses of Tat-LK15 (1, 2.5, 5, 10 and 20 μg). 2. The model of RGC-5 cell overexpression of nNOS protein was prepared. 3. RGC-5 cells were randomly divided into 5 groups: control group,model group, Tat-S group (Tat-LK15 mediate nNOS/siRNA transfection model cell), Lipo-S group (LipofectamineTMRNAiMAX mediate nNOS/siRNA transfection model cell) and Tat-N group (Tat-LK15 mediate NCsiRNA transfection model cell). Real-time Quantitative polymerase chain reaction(Q-PCR) and Western blot were used to evaluate nNOS expression level assay. ResultsIt indicated that the Tat-LK15/siRNA complex completely formed at the weight ratio of 2 ∶1 (μg/μg), and the transfection efficiency was (84.4±3.9)%. It caused cotytoxicity when Tat-LK15 dose was 20 μg (6.1 μmol·L-1), and the apoptosis rate more than control group[(10.3±1.1)% vs (7.4±0.9)%, P<0.05]. The nNOS protein level of RGC-5 cells was significantly elevated after modeling. Compared with that of model group, Tat-LK15/siRNA efficiently inhibited the expression of nNOS at transcriptional level or protein leve1 of Tat-S group (P<0.05), and there was no significant difference of the efficiency inhibited between Tat-S group and Lipo-S group. ConclusionsTat-LK15’ advantage is with high efficiency, low cytotoxicity. The Tat-LK15 can deliver siRNA targeting nNOS in vitro efficiently and safely.

Key words：cell penetrating peptides (CPPs); Tat; siRNA; gene therapy; nNOS; neuropathic pain

通訊作者陸建華(1966-)，男，博士后，主任醫(yī)師，，研究方向：急慢性疼痛基因治療，Tel：020-88653504，E-mail: lujianh@aliyun.com

作者簡介：彭捷(1980-)，男，博士，主治醫(yī)師，研究方向：急慢性疼痛的基因治療，E-mail: excelsiorscholar@163.com;

基金項目：國家自然科學基金資助項目(No 81100817,81371233)

收稿日期:2014-10-21,修回日期:2014-11-22

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0278-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.026