氟西汀對(duì)慢性應(yīng)激大鼠前額葉谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1 表達(dá)的影響

陳建新，姚麗華，王惠玲，劉忠純，王曉萍，肖　玲，王高華

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院精神衛(wèi)生中心，湖北 武漢　430060；2.湖北大學(xué)教育學(xué)院心理學(xué)系，湖北 武漢　430062)

氟西汀對(duì)慢性應(yīng)激大鼠前額葉谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1 表達(dá)的影響

陳建新1,2，姚麗華1，王惠玲1，劉忠純1，王曉萍1，肖玲1，王高華1

(1.武漢大學(xué)人民醫(yī)院精神衛(wèi)生中心，湖北 武漢430060；2.湖北大學(xué)教育學(xué)院心理學(xué)系，湖北 武漢430062)

中國(guó)圖書(shū)分類(lèi)號(hào)：R-332；R322.81；R341；R749.42；R971.43

摘要：目的研究氟西汀對(duì)慢性應(yīng)激大鼠前額葉谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1(GLT-1)的影響，進(jìn)一步探討氟西汀抗抑郁作用可能的分子機(jī)制。方法正常SD大鼠60只，隨機(jī)分為對(duì)照組、慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激(CUS)組和氟西汀組。對(duì)CUS組和氟西汀組大鼠進(jìn)行CUS應(yīng)激后，氟西汀組給予氟西汀治療，對(duì)照組和CUS組給予生理鹽水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后進(jìn)行糖水偏好和曠場(chǎng)行為測(cè)試，并使用免疫組織化學(xué)法和蛋白印跡分析檢測(cè)大鼠前額葉GLT-1的表達(dá)水平。結(jié)果(1)行為學(xué)測(cè)試結(jié)果顯示，CUS組大鼠糖水偏好、總行程、平均移動(dòng)速度及直立次數(shù)均低于對(duì)照組 (P<0.01)；氟西汀組上述指標(biāo)均高于CUS組 (P<0.01)。(2)免疫組織化學(xué)法分析顯示，CUS組與對(duì)照組比較，大鼠前額葉GLT-1表達(dá)下降 (P<0.01)；經(jīng)氟西汀治療后，大鼠前額葉GLT-1表達(dá)比CUS組明顯升高 (P<0.01)。(3)蛋白印跡分析顯示，CUS組與對(duì)照組比較，大鼠前額葉GLT-1表達(dá)下降 (P<0.01)；經(jīng)氟西汀治療后，大鼠前額葉GLT-1表達(dá)比CUS明顯升高 (P<0.01)。結(jié)論慢性應(yīng)激下調(diào)大鼠前額葉GLT-1表達(dá)水平，而氟西汀上調(diào)GLT-1表達(dá)水平，GLT-1表達(dá)增加可能是氟西汀抗抑郁作用的分子機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激；谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1；氟西汀；前額葉；免疫組織化學(xué)法；蛋白印跡分析；抑郁

當(dāng)前，在臨床廣泛使用的抗抑郁藥主要針對(duì)單胺能系統(tǒng)(5-羥色胺和去甲腎上腺素)，但其發(fā)揮治療效果的具體機(jī)制并不清楚[1]。研究發(fā)現(xiàn)，抗抑郁藥使用后可立即升高突觸間隙的5-羥色胺(5-HT)或去甲腎上腺素(NE)的濃度，然而其抗抑郁的臨床療效卻需要數(shù)周才能顯現(xiàn)。這種不一致顯示除了單胺能系統(tǒng)以外可能還有其他機(jī)制涉及到臨床抗抑郁活動(dòng)當(dāng)中。

越來(lái)越多的證據(jù)表明，突觸間隙過(guò)高的谷氨酸造成的興奮毒性損害神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是重型抑郁癥(MDD)發(fā)生的重要原因，而降低突觸間隙的谷氨酸的濃度是MDD治療的關(guān)鍵[2-3]。谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT2(嚙齒類(lèi)動(dòng)物命名為GLT-1：谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1，glutamate transporter 1)是海馬和前額葉星形膠質(zhì)細(xì)胞膜上一種非常重要的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體[4]，其負(fù)責(zé)細(xì)胞外大部分谷氨酸的攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)[5]。來(lái)自MDD病人[6]和抑郁動(dòng)物模型[7]的實(shí)驗(yàn)研究顯示其腦內(nèi)GLT-1表達(dá)水平與健康控制組比較是降低的。而研究發(fā)現(xiàn)上抬GLT-1表達(dá)水平的藥物具有抗抑郁樣效應(yīng)[8]。

氟西汀(fluoxetine，F(xiàn)LX)，一種選擇性5-HT再攝取抑制劑，是臨床最常見(jiàn)的一線(xiàn)抗抑郁藥，然而，其潛在的抗抑郁作用機(jī)制仍然不清楚。最近有研究表明，氟西汀治療可以誘導(dǎo)正常大鼠海馬和皮層EAAT2(GLT-1)表達(dá)升高[9]。但是這種來(lái)自健康大鼠的研究證據(jù)不同于抗抑郁藥作用于臨床抑郁病人所引起的改變。因此，通過(guò)抑郁動(dòng)物模型進(jìn)一步探討GLT-1與氟西汀抗抑郁作用的關(guān)系是必要的。本研究擬通過(guò)氟西汀對(duì)慢性不可預(yù)見(jiàn)性應(yīng)激(chronic unpredictable stress, CUS)大鼠前額葉(prefrontal cortex，PFC)GLT-1表達(dá)的影響，進(jìn)一步探討氟西汀抗抑郁作用的新機(jī)制，為MDD發(fā)生和治療的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60只清潔級(jí)成年♀SD大鼠(由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供)，飼養(yǎng)于二級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室中，普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食與飲水。1周后，利用隨機(jī)數(shù)字表將大鼠隨機(jī)分為3組：(1)對(duì)照組:空白對(duì)照+生理鹽水；(2)CUS組:CUS+生理鹽水；(3)氟西汀組:CUS+氟西汀，每組20只。

1.2藥品和試劑氟西汀原藥(金洹化工科技有限公司，上海)；兔多克隆抗體anti- GLT-1(ab41621, Abcam, Cambridge, MA, USA)；生物素標(biāo)記二抗羊抗兔IgG(sc-3840, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)； 兔多克隆抗體anti-GAPDH(ab9485, Abcam, Cambridge, MA, USA)。二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(sc-2004, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)；PVDF膜 (Millipore，USA)。

1.3主要儀器動(dòng)物行為自動(dòng)跟蹤系統(tǒng)(EthoVision 3.0，荷蘭)；奧林巴斯BX50顯微鏡(奧林巴斯，東京，日本)；計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)(JEDA801D，捷達(dá)科技有限公司，中國(guó))；凝膠掃描分析系統(tǒng)(Bio-Rad公司，美國(guó))。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1慢性不可預(yù)知應(yīng)激(CUS)基于前人的研究稍作修改建立CUS動(dòng)物模型[10-11]。對(duì)CUS組和氟西汀組大鼠進(jìn)行連續(xù)35 d，每天2次應(yīng)激刺激。本實(shí)驗(yàn)采用10種不同的應(yīng)激刺激：鼠籠45°傾斜24 h，潮濕墊料24 h，行為限制2 h，4 ℃冰水游泳5 min，42 ℃熱水游泳5 min，禁食24 h，禁水24 h，夾尾 1 min，鼠籠搖晃 15 min，24 h晝夜顛倒。將大鼠分別暴露于這些應(yīng)激刺激下。同樣的刺激不能出現(xiàn)在兩個(gè)連續(xù)的階段，對(duì)照組大鼠不遭受任何應(yīng)激。

1.4.2糖水偏好實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物已進(jìn)行糖水適應(yīng)性訓(xùn)練。禁水12 h后 (20 ∶00～8 ∶00)，糖水實(shí)驗(yàn)在上午8 ∶00～9 ∶00進(jìn)行。給予動(dòng)物事先稱(chēng)量好的兩瓶水，一瓶為質(zhì)量濃度為10 g·L-1蔗糖水，一瓶為動(dòng)物日常飲用水。1 h后，計(jì)算動(dòng)物的糖水偏好，糖水偏好=糖水消耗/總液體消耗。

1.4.3曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)曠場(chǎng)大小為120 cm×90 cm×35 cm，實(shí)驗(yàn)從早上9 ∶00開(kāi)始進(jìn)行，將大鼠置于曠場(chǎng)中心，使用動(dòng)物行為自動(dòng)跟蹤系統(tǒng)記錄并分析大鼠在曠場(chǎng)內(nèi)10 min的行為活動(dòng)，主要觀測(cè)指標(biāo)為總行程，平均移動(dòng)速度，直立次數(shù)(垂直運(yùn)動(dòng)得分，兩前爪騰空或攀附墻壁)。動(dòng)物單獨(dú)測(cè)試，兩只動(dòng)物之間將場(chǎng)地清理干凈[11]。

1.4.4氟西汀治療治療前，將氟西汀溶解在生理鹽水中。連續(xù)28 d,每天向大鼠腹腔注射氟西汀(10 mg·kg-1)[11]或等體積的生理鹽水。

1.4.5免疫組織化學(xué)分析將大鼠斷頭處死，解剖分離出前額葉，石蠟包埋，厚5 μm的切片，在含有H2O2的甲醇中處理30 min，0.01 mmol·L-1的檸檬酸鹽緩沖液(pH 7.2)中微波處理15 min。在正常山羊血清中預(yù)孵化30 min后，用兔多克隆抗體anti-GLT-1(1 ∶200)孵化切片，4℃過(guò)夜，0.1 mol·L-1磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)洗滌，37℃下生物素標(biāo)記二抗羊抗兔IgG(1 ∶100)孵育60 min。最后，PBS洗滌3次，DAB著色10 min。

通過(guò)免疫組化技術(shù)，陽(yáng)性及強(qiáng)陽(yáng)性的區(qū)域被染成黃褐色。使用奧林巴斯BX50顯微鏡，在200×放大下捕獲前額葉GLT-1的陽(yáng)性染色圖像，采用計(jì)算機(jī)輔助圖像分析系統(tǒng)對(duì)GLT-1免疫組織化學(xué)染色區(qū)域的總光密度(IOD)進(jìn)行定量分析。隨機(jī)選取10個(gè)切片用于每只大鼠的定量統(tǒng)計(jì)。

1.4.6免疫印跡分析將分析樣品從-80℃冰箱中取出，勻漿離心后，通過(guò)BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。經(jīng)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜。分別加入GLT-1抗體(1 ∶300)及內(nèi)標(biāo)GAPDH抗體(1 ∶300)，輕搖孵育過(guò)夜。洗膜后，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG(1 ∶5 000),室溫輕搖1 h。充分洗膜后做化學(xué)發(fā)光(ECL)，膠片曝光顯影。膠片用凝膠掃描分析系統(tǒng)進(jìn)行灰度分析。GLT-1表達(dá)的相對(duì)含量變化用GLT-1條帶灰度值與GAPDH條帶的灰度值的比值(GLT-1/GAPDH)表示。

GroupSucrosepreferenceOpenfieldtestsTotaltraveleddistance/cmMovedvelocity/cm·s-1FrequenciesofrearingControl0.80±0.668591.66±1776.3714.45±2.0026.30±5.10CUS0.54±0.47**##3458.43±599.45**##5.83±0.99**##6.10±2.33**##FLX0.75±0.597704.57±1040.0812.95±1.7423.60±5.40F(2,27)54.6681.2279.5759.54P0.0000.0000.0000.000

**P<0.01vscontrol；##P<0.01vsFLX

2結(jié)果

2.1對(duì)照組、CUS組、氟西汀組在氟西汀治療后(d 65)行為學(xué)指標(biāo)的比較由Tab 1可見(jiàn)，CUS組糖水偏好、總行程、平均移動(dòng)速度和直立次數(shù)與對(duì)照組和氟西汀組比較明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2對(duì)照組、CUS組、氟西汀組在氟西汀治療后(d 65)前額葉GLT-1表達(dá)的比較

2.2.1免疫組織化學(xué)分析免疫組織化學(xué)分析顯示，對(duì)照組大鼠前額葉GLT-1表達(dá)增加(Fig 1 A：A1)，CUS組大鼠的GLT-1表達(dá)下降(Fig 1 A：A2)。而氟西汀組大鼠的GLT-1表達(dá)增加(Fig 1 A：A3)。即經(jīng)過(guò)氟西汀治療后大鼠前額葉GLT-1表達(dá)明顯多于CUS組。通過(guò)總光密度(IOD)對(duì)大鼠前額葉GLT-1表達(dá)水平進(jìn)行量化分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3組大鼠前額葉GLT-1的表達(dá)差異有著顯著性[F(2,27)=112.82,P<0.01]；均數(shù)間兩兩比較顯示CUS組大鼠前額葉GLT-1的表達(dá)明顯減少(與對(duì)照組對(duì)比，P<0.01；與氟西汀組比較，P<0.01)，見(jiàn)Fig 1 B。

2.2.2免疫印跡分析 (Western blot)免疫印跡分析顯示對(duì)照組、CUS組和氟西汀組大鼠前額葉GLT-1的表達(dá)結(jié)果見(jiàn)Fig 2。單因素方差分析顯示，3組大鼠前額葉GLT-1表達(dá)的灰度值差異有顯著[F(2,27)=23.81,P<0.01]。均數(shù)間兩兩比較發(fā)現(xiàn)，CUS組大鼠前額葉GLT-1的表達(dá)明顯減少(與對(duì)照組比較：P<0.01，與氟西汀組相比：P<0.01)。

3討論

Fig 1GLT-1 expression in rat PFC as revealed by

A：Immunostaining in the rat PFC(magnification,×200),the control group(A1),the CUS group(A2),and the FLX group(A3)(CLT1-immunoposrtive indicated by the black arrows);B:Quantitative representation of the expression of GLT-1 by integrated optical desity (IOD)(x±s,n=10).**P<0.01vs the control group;##P<0.01vs the FLX group

目前研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)細(xì)胞外谷氨酸水平被5種亞型的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAAT)所調(diào)控：EAAT(嚙齒類(lèi)動(dòng)物命名為GLAST：谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體)，EAAT2(嚙 齒類(lèi)動(dòng)物命名為GLT1：谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1)，EAAT3(嚙齒類(lèi)動(dòng)物命名為EAAC1：興奮性氨基酸載體1)，以及EAAT4和EAAT5。其中，GLAST和GLT-1廣泛表達(dá)于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上，EAAC1和EAAT4主要分布在神經(jīng)細(xì)胞膜上，EAAT5則主要存在于視網(wǎng)膜的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜上[12]。研究顯示，GLT-1將突觸間隙過(guò)高的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)到星形膠質(zhì)細(xì)胞中，由谷氨酰胺合成酶(GS)將谷氨酸轉(zhuǎn)化為無(wú)毒的谷氨酰胺，從而降低過(guò)高的谷氨酸對(duì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的損傷[13]。

Fig 2GLT-1 expression in rat PFC as revealed by

**P<0.01vsthe control group;##P<0.01vsthe FLX group

目前研究發(fā)現(xiàn)，人類(lèi)細(xì)胞外谷氨酸水平被5種亞型的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體(EAAT)所調(diào)控：EAAT1(嚙齒類(lèi)動(dòng)物命名為GLAST：谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體)，EAAT2(嚙齒類(lèi)動(dòng)物命名為GLT-1：谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體1)，EAAT3來(lái)自臨床MDD病人[6]和抑郁動(dòng)物模型[7]的研究顯示，GLT-1與MDD的發(fā)生和抗抑郁藥治療有關(guān)。Choudary等[6]用微陣列分析MDD病人死后的大腦皮層發(fā)現(xiàn)，SLC1A2 (用來(lái)編碼EAAT1的基因)和SLC1A3 (用來(lái)編碼EAAT2基因)明顯下降。Zink等[7]在獲得性無(wú)助動(dòng)物模型中證實(shí)實(shí)驗(yàn)大鼠的海馬和皮層EAAT2(GLT-1)表達(dá)是下降的。最近的研究表明，β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物可明顯激活GLT-1的啟動(dòng)子而增加腦組織GLT-1的表達(dá)[14]，其中，β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素頭孢曲松的抗抑郁效應(yīng)已在幾種經(jīng)典的抑郁動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證[8]。另外，利魯唑，臨床用來(lái)治療肌萎縮側(cè)索硬化癥的神經(jīng)保護(hù)劑，研究發(fā)現(xiàn)其通過(guò)選擇性、強(qiáng)烈的上抬GLT-1的表達(dá)水平而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用[15]。近來(lái)的臨床研究顯示，在難治性抑郁和雙相抑郁癥患者中證實(shí)了利魯唑的抗抑郁效應(yīng)[16]。

在本研究中，我們通過(guò)免疫組織化學(xué)法和Western blot分析證實(shí)了慢性氟西汀治療逆轉(zhuǎn)了CUS誘導(dǎo)的前額葉GLT-1表達(dá)的下降，同時(shí)明顯改善了CUS實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的行為學(xué)改變。提示GLT-1表達(dá)的上抬可能是氟西汀抗抑郁作用的機(jī)制之一，這一發(fā)現(xiàn)同時(shí)也支持了谷氨酸系統(tǒng)參與了抗抑郁藥的活動(dòng)機(jī)制的假說(shuō)[2-3]。最近一項(xiàng)研究提示，Zink 等[9]發(fā)現(xiàn)氟西汀具有誘導(dǎo)皮層和海馬的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體EAAT2(GLT1)的表達(dá)。我們的研究與Zink等的研究是一致的，Zink等用氟西汀治療的是健康正常大鼠，而我們治療的是應(yīng)激大鼠。因此，我們的設(shè)計(jì)更接近于臨床抑郁癥的發(fā)病和治療過(guò)程。

總之，我們的研究證實(shí)了谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1可能參與了氟西汀的抗抑郁活動(dòng)。然而，關(guān)于氟西汀調(diào)節(jié)谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體GLT-1表達(dá)的精確機(jī)制還必須進(jìn)一步研究，特別是其中涉及到的第二信使系統(tǒng)還不明確，研究表明，氟西汀抗抑郁活動(dòng)主要與CAMP信號(hào)系統(tǒng)有關(guān)[17]，而谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體的調(diào)節(jié)主要在轉(zhuǎn)錄、翻譯和翻譯后的調(diào)節(jié)[18]，這兩者之間細(xì)胞內(nèi)分子的交接可能為解決GLT-1參與氟西汀的抗抑郁活動(dòng)精確機(jī)制，甚至為臨床抗抑郁活動(dòng)的延遲效應(yīng)產(chǎn)生的機(jī)制提供了方向。

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Effects of fluoxetine on changes of GLT-1 in rat prefrontal cortex

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.022.html

after chronic unpredictable stress

CHEN Jian-xin1,2, YAO Li-hua1, WANG Hui-ling1, LIU Zhong-chun1,

WANG Xiao-ping1, XIAO Ling1, WANG Gao-hua1

(1.DeptofPsychiatry,RenminHospital,WuhanUniversity,Wuhan430060,China;

2.DeptofPsychology,FacultyofEducation,HubeiUniversity,Wuhan430062,China)

Abstract:AimTo investigate the effects of fluoxetine on the changes of of protein levels of GLT-1 in prefrontal cortex in rat depression model, and to further explore the molecular mechanism of antidepressant action of fluoxetine. MethodsSixty male SD rats were randomly assigned into three groups: control group, chronic unpredictable stress (CUS) group, and CUS+fluoxetine group. The rats of CUS group and CUS+fluoxetine group were subjected to CUS for 2 sessions per day for 35 days. Then, the rats of the CUS+fluoxetine group were given fluoxetine for 28 days. Behavioral changes were assessed by the sucrose preference and open field tests. The GLT-1 protein levels in the prefrontal cortex were detected by immunohistochemistry and Western blot analysis at the end of the fluoxetine treatment. Results(1) Compared with the control group，sucrose preference, total traveling distance, velocity and frequencies of rearing were reduced in the CUS group (P<0.01). These behavioral changes could be reversed after 28 day fluoxetine treatment. (2) Immunohistochemistry assay indicated weak immunoreactivity for GLT-1 in the prefrontal cortex of CUS group (versus the control rats: P<0.01)； the immunoreactivity for GLT-1 of the fluoxetine-treated rats was significantly up-regulated compared with the CUS group rats (P<0.01). (3) Western blot analysis indicated significant reductions of GLT-1 in the prefrontal cortex of CUS group (versus the control rats: P<0.01), and chronic fluoxetine treatment reversed the CUS-induced decrease in GLT-1 levels (P<0.01). ConclusionsChronic unpredictable stress (CUS) could down-regulate the GLT-1 protein levels in the prefrontal cortex, which is reversed by fluoxetine. These results further support the notion that enhanced expression of the GLT-1 protein could be molecular mechanism of fluoxetine antidepressant effect.

Key words:chronic unpredictable stress; glutamate transporter 1; fluoxetine; prefrontal cortex; immunohistochemistry; Western blot; depression

通訊作者王高華(1964-)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，，Tel:027-88041911，研究方向：精神藥理學(xué)，E-mail：wgh640806@163.com

作者簡(jiǎn)介：陳建新(1970-)，男，博士生，講師，研究方向:精神藥理學(xué)，E-mail：chy990802@163.com;

基金項(xiàng)目：國(guó)家“十二五計(jì)劃”項(xiàng)目課題(No 2012BAI01B05)；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 30971040，81271496)

收稿日期：2014-11-11，修回稿日期：2014-12-22

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001-1978(2015)02-0256-05

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.022