血管緊張素Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞Notch通路及Nephrin表達(dá)的影響

高　峰，張　濤，王曉梅，趙玉峰，劉淑霞

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院病理科，2. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊　050051；3. 河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室，河北 石家莊　050017)

血管緊張素Ⅱ?qū)ψ慵?xì)胞Notch通路及Nephrin表達(dá)的影響

高峰1，張濤2，王曉梅1，趙玉峰1，劉淑霞3

(1. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院病理科，2. 河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腎內(nèi)科，河北 石家莊050051；3. 河北醫(yī)科大學(xué)病理教研室，河北 石家莊050017)

中國圖書分類號：R-332；R322.61；R329.24；R692；R977.6

摘要：目的探討血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)刺激小鼠足細(xì)胞對Notch通路、Nephrin表達(dá)的影響。方法AngⅡ 刺激小鼠足細(xì)胞并給予纈沙坦干預(yù)，采用免疫熒光化學(xué)、Western blot、Real-time PCR方法檢測Notch1、Notch胞內(nèi)域1(NICD1)、Hes1、Nephrin的表達(dá)情況。結(jié)果AngⅡ呈時間依賴性增加足細(xì)胞Notch1、NICD1、Hes1表達(dá)，抑制Nephrin表達(dá)(P<0.01)；纈沙坦可抑制AngⅡ?qū)otch通路的活化，增加Nephrin的表達(dá)(P<0.01)。結(jié)論AngⅡ 通過激活Notch通路降低足細(xì)胞Nephrin表達(dá)。

關(guān)鍵詞：血管緊張素Ⅱ；足細(xì)胞；Notch通路；Nephrin；血管緊張素Ⅱ 1受體阻斷劑；纈沙坦

已發(fā)現(xiàn)腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin angioten sin system, RAS)在多種腎臟疾病腎組織中被激活[1]。血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)作為RAS系統(tǒng)的主要效應(yīng)因子，在腎組織內(nèi)常明顯升高，可以通過多種途徑造成足細(xì)胞損傷，導(dǎo)致腎小球硬化，加速腎臟疾病的進(jìn)展[2-3]。近年來發(fā)現(xiàn)，Notch通路在多種腎臟疾病足細(xì)胞中被激活，Notch受體釋放出其活化形式NICD進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)控其下游基因Hes，參與腎小球足細(xì)胞損傷[4]。Nephrin是重要的足細(xì)胞特異蛋白，表達(dá)在裂孔隔膜上，其表達(dá)量的改變與足細(xì)胞損傷程度密切相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病小鼠模型和高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中，Notch通路對Nephrin表達(dá)起調(diào)控作用，但AngⅡ?qū)ψ慵?xì)胞Notch通路活化及Nephrin表達(dá)的影響還不清楚[5]。本研究通過體外AngⅡ刺激小鼠足細(xì)胞，觀察其對Notch1、NICD1、Hes1和Nephrin表達(dá)的影響，并給予血管緊張素Ⅱ 1受體阻斷劑(angiotensin Ⅱ type 1 receptor antagonism, AT1Ra)纈沙坦干預(yù)，以證實(shí)AngⅡ?qū)otch信號通路活化及Nephrin表達(dá)的影響。

1材料與方法

1.1材料條件永生性小鼠足細(xì)胞購自北京協(xié)和細(xì)胞中心。小鼠γ-干擾素購自Peprotech公司。RPMI 1640培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品。AngⅡ購自Sigma公司。兔抗β-actin多克隆抗體購自Santa Cruz公司。兔抗NICD1、Hes1和Hey1多克隆抗體購自Abcam公司。Real-time PCR試劑盒購自TaKaRa公司。纈沙坦為北京諾華公司產(chǎn)品。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組小鼠足細(xì)胞在33℃ CO2培養(yǎng)箱中，以含有10%胎牛血清及10 000 U·L-1γ-干擾素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞使其增殖，傳代后更換不含γ-干擾素的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37℃ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10~14 d促進(jìn)分化。同步化24 h后，AngⅡ(10-6mol·L-1)刺激0、12、24、48、72 h后收集細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。隨后在AngⅡ刺激的同時加入纈沙坦(10-6mol·L-1)給予干預(yù)。

1.3免疫熒光化學(xué)檢測Nephrin蛋白表達(dá)細(xì)胞于75%乙醇室溫固定30 min，0.3% Triton X-100 37℃打孔15 min。加入正常山羊血清，37℃、30 min封閉內(nèi)源性生物素，棄血清，加入Nephrin多克隆抗體，4℃過夜。滴加FITC標(biāo)記的熒光二抗，37℃避光孵育1 h，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。

1.4Western blot檢測Notch1、NICD1、Hes1、Nephrin蛋白表達(dá)用RIPA裂解液(含1×PBS、1%NP-40、0.5%去氧膽酸鈉、0.1% SDS，用前加PMSF 0.1 g·L-1)提取細(xì)胞總蛋白，取30 μg樣品SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入Notch1、NICD1、Hes1、Nephrin、β-actin多克隆抗體4℃孵育過夜，洗膜后加辣根過氧化物酶標(biāo)記IgG二抗，37℃孵育2 h，暗室中顯影，底片經(jīng)掃描儀透掃后凝膠分析軟件分析結(jié)果。與β-actin光密度的比值分別表示其相對表達(dá)量。

1.5Real-time PCR檢測Notch1、Hes1、Nephrin mRNA表達(dá)TRIzol 提取細(xì)胞總RNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積為20 μL，按照反轉(zhuǎn)錄說明書合成cDNA。引物分別為：18S，上游5′-CGCCGCTAGAGGTGAAATTC-3′，下游5′-CCAGTCGGCATCGTTTATGG-3′；Notch1，上游5′-GTGGATGACCTAGGCAAGTCG-3′，下游5′-GTCTCCTCCTTGTTGTTCTGCA-3′；Hes1，上游5′-CACGACACCGGACAAACCA-3′，下游5′-GCCGGGAGCTATCTTTCTTAAGTG-3′；Nephrin，上游5′-TACCACCAGCATTTCCACG-3′，下游5′-GGGCTCGGCTGTATGTATT-3′，均由北京奧科公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積為50 μL，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性2 min，94℃變性25 s，60℃退火30 s，40個循環(huán)結(jié)束。由PCR反應(yīng)曲線得到Ct值，采用2-△△Ct法計算相對定量結(jié)果。

2結(jié)果

2.1AngⅡ?qū)ψ慵?xì)胞Notch通路及Nephrin表達(dá)的影響Western blot檢測顯示：AngⅡ呈時間依賴性刺激Notch1、NICD1、Hes1蛋白表達(dá)增加(P<0.01)，其中Notch1蛋白在AngⅡ刺激12 h開始增加，24 h達(dá)到最高點(diǎn)，48 h和72 h相對24 h稍有下降(P<0.05)，但仍高于AngⅡ刺激0 h；NICD1和Hes1蛋白表達(dá)最高點(diǎn)都在12 h，24、48、72 h相對24 h表達(dá)下降(P<0.05或P<0.01)，NICD1蛋白在AngⅡ刺激72 h表達(dá)仍高于0 h(P<0.01)，Hes1蛋白在AngⅡ刺激72 h與0 h表達(dá)無明顯差異(P>0.05)；AngⅡ呈時間依賴性抑制Nephrin蛋白表達(dá)，表達(dá)最低點(diǎn)在AngⅡ刺激72 h(P<0.01)(Fig 1)。Real-time PCR檢測顯示：Notch1 mRNA在AngⅡ刺激12 h增加，24 h表達(dá)最強(qiáng)(P<0.01)，72 h相對24 h表達(dá)有所下降(P<0.05)，但仍高于0 h(P<0.01)；Hes1 mRNA在AngⅡ刺激12 h表達(dá)最強(qiáng)(P<**P<0.01vsAngⅡ 0 h;△P<0.05vsAngⅡ 24 h;#P<0.05,##P<0.01vsAngⅡ 12 h

<0.01)，隨著刺激時間的延長表達(dá)降低(P<0.01)，在AngⅡ刺激72 h與0 h表達(dá)無明顯差異(P>0.05)；AngⅡ呈時間依賴性抑制Nephrin mRNA表達(dá)，表達(dá)最低點(diǎn)在AngⅡ刺激72 h(P<0.01)(Fig 2)。

Fig 1　Expression of Notch1, NICD1, Hes1 and Nephrin protein

Fig 2Expression of Notch1, Hes1 and Nephrin mRNA

in AngⅡ-stimulated podocyte by Real-time PCR

**P<0.01vsAngⅡ 0 h;△P<0.05vsAngⅡ 24 h;##P<0.01vsAngⅡ 12 h

2.2纈沙坦對AngⅡ刺激足細(xì)胞Notch通路及Nephrin表達(dá)的影響免疫熒光化學(xué)顯示，Nephrin在足細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)，AngⅡ刺激12 h時表達(dá)較0 h時減少，纈沙坦可增加Nephrin在AngⅡ刺激后的表達(dá)(Fig 3)。與AngⅡ刺激0 h相比，AngⅡ刺激12 h時Notch1、NICD1、Hes1蛋白及Notch1、Hes1 mRNA表達(dá)增加(P<0.01)，纈沙坦可減少AngⅡ刺激12 h時Notch1、NICD1、Hes1蛋白及Notch1、Hes1 mRNA表達(dá)(P<0.01)；與AngⅡ刺激0 h相比，AngⅡ刺激12 h時Nephrin蛋白及mRNA表達(dá)降低，纈沙坦可增加AngⅡ刺激12 h時Nephrin蛋白及mRNA表達(dá)(P<0.01)(Fig 4、5)。

Fig 3Effect of valsartan on expression of Nephrin protein in AngⅡ-stimulated podocyte by immunofluorescence

A:0 h; B:12 h; C:12 h+valsartan

Fig 4Effect of valsartan on expression of Notch1, NICD1, Hes1 and Nephrin protein in AngⅡ-stimulated podocyte by Western blot

**P<0.01vsAngⅡ 0 h;##P<0.01vsAngⅡ 12 h

Fig 5　Effect of valsartan on expression of Notch1, Hes1 and

**P<0.01vsAngⅡ 0 h;##P<0.01vsAngⅡ 12 h

3討論

AngⅡ在多種腎臟疾病腎組織內(nèi)常明顯升高，通過血流動力學(xué)及非血流動力學(xué)因素，對足細(xì)胞產(chǎn)生損傷，引起足細(xì)胞固有蛋白表達(dá)減少，破壞濾過膜，導(dǎo)致發(fā)生蛋白尿、腎小球硬化、最終引起腎功能衰竭[2]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AngⅡ刺激小鼠足細(xì)胞后，可使Notch通路受體Notch1、活化形式NICD1及其下游基因Hes1表達(dá)增加，表達(dá)強(qiáng)度最強(qiáng)時間點(diǎn)在24 h和12 h，隨后，隨著AngⅡ刺激時間的延長表達(dá)降低，說明AngⅡ可以在較短的時間內(nèi)就激活足細(xì)胞Notch信號通路。AngⅡ刺激足細(xì)胞Notch1受體表達(dá)增加并向細(xì)胞內(nèi)釋放出NICD1，NICD1進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控Hes1表達(dá)，進(jìn)而參與足細(xì)胞損傷過程。Ozasa 等[6]用AngⅡ刺激血管平滑肌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)AngⅡ通過激活Notch通路促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。You等[7]發(fā)現(xiàn)阻斷AngⅡ作用后，可通過抑制Notch通路活化，減輕因持續(xù)血壓負(fù)荷引起的心室肥大、功能失常。

Nephrin是重要的裂孔膜蛋白，當(dāng)足細(xì)胞受到損傷時，Nephrin表達(dá)降低造成裂孔膜結(jié)構(gòu)破壞，功能喪失，影響腎小球?yàn)V過功能，產(chǎn)生大量蛋白尿[8]。AngⅡ刺激足細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)Nephrin表達(dá)明顯降低，說明AngⅡ可通過降低足細(xì)胞特異蛋白，引起足細(xì)胞損傷。纈沙坦是當(dāng)今臨床上常用的治療腎臟疾病的AT1Ra類藥物，研究發(fā)現(xiàn)其對腎臟的保護(hù)作用，不僅僅取決于降低血壓的作用[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，在AngⅡ刺激的小鼠足細(xì)胞中給予纈沙坦后，抑制Notch通路的活化，進(jìn)而增加足細(xì)胞Nephrin蛋白及mRNA的表達(dá)，說明AngⅡ在足細(xì)胞可能通過Notch通路調(diào)控Nephrin表達(dá)，纈沙坦能抑制Notch通路，減少足細(xì)胞損傷過程，從而達(dá)到對腎臟疾病的治療作用。

總之，AngⅡ可激活足細(xì)胞Notch通路，抑制Nephrin表達(dá)。纈沙坦能抑制AngⅡ?qū)otch通路的活化，增加Nephrin表達(dá)，達(dá)到治療腎臟疾病的作用。

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網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.020.html

Effect of angiotensin Ⅱ on expression of Notch pathway and Nephrin in podocyte

GAO Feng1, ZHANG Tao2, WANG Xiao-mei1, ZHAO Yu-feng1, LIU Shu-xia3

(1.DeptofPathology, 2.DeptofNephrology,theThirdHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050051,China;

3.DeptofPathology,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Abstract:AimTo investigate the expression of Notch pathway and Nephrin in angiotensin Ⅱ (AngⅡ)-stimulated mice podocyte. MethodsMice podocyte was stimulated by AngⅡ, and then was treated with valsartan. The levels of Notch1, Notch intracellular domain 1 (NICD1), Hes1 and Nephrin were determined by immunofluorescence, Western blot and Real-time PCR. ResultsAngⅡ increased Notch1, NICD1 and Hes1 expression, and decreased Nephrin expression in a time-dependent manner (P<0.01). Valsartan inhibited AngⅡ-induced activation of Notch pathway and enhanced Nephrin level (P<0.01). ConclusionAngⅡ decreases Nephrin expression in podocyte by activating Notch pathway.

Key words:angiotensin Ⅱ; podocyte; Notch pathway; Nephrin; angiotensin Ⅱ type 1 receptor antagonism; valsartan

通訊作者劉淑霞(1975-)，女，博士，教授，研究方向：腎臟疾病發(fā)病機(jī)制，，E-mail：susanliu1976@163.com

作者簡介：高峰(1978-)，男，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：腎臟疾病發(fā)病機(jī)制，E-mail：alan846829@163.com;

基金項目：河北省自然科學(xué)基金資助項目(No H2014206294)；河北省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究重點(diǎn)課題(No ZL20140030)

收稿日期:2014-11-22,修回日期:2014-12-27

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0247-04

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.020