新天然化合物Jaridonin通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞

馬永成，蘇　楠，秦玉花，趙紅衛(wèi)，張　偉，趙寧民，李巧艷，段虹飛，劉宏民

(1. 鄭州大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部臨床藥理室，河南 鄭州　450003；2. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院質(zhì)量檢測與管理系，河南 鄭州　450011；3. 鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州　450001)

新天然化合物Jaridonin通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激選擇性殺傷腫瘤細(xì)胞

馬永成1，蘇楠2，秦玉花1，趙紅衛(wèi)1，張偉1，趙寧民1，李巧艷1，段虹飛1，劉宏民3

(1. 鄭州大學(xué)人民醫(yī)院藥學(xué)部臨床藥理室，河南 鄭州450003；2. 河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院質(zhì)量檢測與管理系，河南 鄭州450011；3. 鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州450001)

中國圖書分類號：R282.71；R322.44；R329.24；R329.25；R735.202.2

摘要：目的研究化合物Jaridonin抗腫瘤作用的選擇性并探討其可能機(jī)制。方法采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測Jaridonin抑制細(xì)胞增殖的作用；使用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)水平；Western blot法檢測Jaridonin對細(xì)胞凋亡通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響。結(jié)果Jaridonin能明顯抑制胃癌細(xì)胞MGC-803的增殖，且呈較好的濃度依賴性，而對人正常胃粘膜細(xì)胞GES-1的增殖沒有明顯影響；Jaridonin作用于MGC-803后明顯引起B(yǎng)ax表達(dá)上調(diào)、線粒體膜電位下降、細(xì)胞色素C釋放、caspase-3激活以至細(xì)胞凋亡，而對GES-1凋亡的影響并不明顯；Jaridonin誘導(dǎo)MGC-803活性氧水平持續(xù)增加，而GES-1內(nèi)活性氧水平先迅速上升，6h后下降至基礎(chǔ)水平；外源性GSH幾乎可以完全逆轉(zhuǎn)Jaridonin對MGC-803的抑制作用。結(jié)論Jaridonin選擇性的抑制胃癌細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)線粒體途徑參與的凋亡，其選擇性機(jī)制可能與Jaridonin直接作用于氧化還原系統(tǒng)引起胞內(nèi)活性氧水平升高有關(guān)。

關(guān)鍵詞：胃癌；天然化合物；腫瘤選擇性；活性氧；凋亡；線粒體通路

胃癌惡性程度高，發(fā)現(xiàn)時(shí)多已是中、晚期，預(yù)后極差[1]。以化療貫穿始終的綜合治療是目前臨床最主要的治療模式，但化療藥物毒性大，且易產(chǎn)生耐藥性，患者因難以耐受藥物毒性而被迫終止治療的現(xiàn)象屢見不鮮，化療效果往往較差[2]。2014年初，全國腫瘤登記中心發(fā)布的最新《中國腫瘤登記年報(bào)》也顯示，胃癌的發(fā)病率及死亡率均位列前三，由此可見，繼續(xù)研發(fā)新的高效，低毒的抗胃癌藥物仍十分迫切。中藥作為中華文明的傳統(tǒng)瑰寶，因其確切的療效、較低的毒性、獨(dú)特的作用機(jī)制，已得到國際社會的認(rèn)可[3-4]，從中藥中尋找高效低毒的先導(dǎo)化合物依舊是醫(yī)藥研發(fā)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。Jaridonin屬于對映貝殼杉烷型二萜化合物，是我們課題組首次從河南濟(jì)源產(chǎn)冬凌草中提取的新天然化合物，其分子結(jié)構(gòu)如Fig 1所示。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Jaridonin可以明顯抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長[5]，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但Jaridonin是否具有腫瘤選擇性以及選擇性作用機(jī)制尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)則重點(diǎn)研究該化合物的腫瘤選擇性，以胃癌細(xì)胞株MGC-803和正常胃黏膜細(xì)胞GES-1為模型，從增殖抑制、細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞凋亡及蛋白表達(dá)等多方面來研究Jaridonin對胃癌細(xì)胞的選擇性殺傷作用，并探討其可能機(jī)制。

1材料

1.1細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞株MGC-803購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，由本實(shí)驗(yàn)室傳代凍存；人胃粘膜上皮細(xì)胞株GES-1購自上海復(fù)祥生物科技有限公司。

1.2主要試劑四氮唑藍(lán)(MTT)、Hoechst 33258購自美國Sigma公司；FITC-Annexin Ⅴ/PI 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Biovision公司；細(xì)胞線粒體分離試劑盒、免疫染色固定液、熒光染料DCFH-DA及JC-1熒光探針均購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；細(xì)胞色素C、Bax、caspase-3抗體購自美國Santa Cruz公司；GAPDH抗體購自杭州賢至生物科技公司；辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；NC膜購自美國Pall公司；化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自美國Pierce公司；細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI 1640購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)購自杭州四季青公司；化合物Jaridonin(純度99%以上)由鄭州大學(xué)新藥研發(fā)中心研制，結(jié)構(gòu)經(jīng)IR，NMR，MS及X-ray光譜確證。Jaridonin用DMSO配成160 mmol·L-1的儲備液，使用前用培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，同時(shí)確保培養(yǎng)基中DMSO終含量不超過0.1%(已知該濃度DMSO對細(xì)胞生長沒有影響)。

2方法

2.1細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞于含10%胎牛血清，1×108U·L-1青霉素和100 g·L-1鏈霉素的RPMI 1640 培養(yǎng)液中，在37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

2.2MTT法測定細(xì)胞生存率根據(jù)文獻(xiàn)所述[5]，在使用或不使用GSH預(yù)孵育細(xì)胞后，加入終濃度為2.5、5、10、20、40、80 μmol·L-1的Jaridonin，作用24 h，計(jì)算細(xì)胞生存率(survival rate)及IC50值。

2.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)研究將MGC-803于6孔培養(yǎng)板中做成細(xì)胞爬片，使用0、15、30 μmol·L-1的Jaridonin分別作用細(xì)胞24h，去除培養(yǎng)基，PBS漂洗1次，使用免疫染色固定液室溫固定10 min，加入適量體積的5 mg·L-1Hoechst 33258 染液進(jìn)行室溫避光染色30 min。吸除Hoechst 33258 染液，PBS輕漂2次，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，并保存圖像。

2.4細(xì)胞早期凋亡檢測使用不同濃度的Jaridonin作用細(xì)胞24h后，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，按照凋亡檢測試劑盒說明處理待檢細(xì)胞，利用流式細(xì)胞儀(Accuri C6, BD)分析凋亡情況。

2.5線粒體膜電位檢測使用0、15、30 μmol·L-1的Jaridonin作用MGC-803細(xì)胞24 h后，JC-1染色，使用熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位變化，并記錄圖像以作分析，具體方法參見文獻(xiàn)[5]。

2.6Western blot提取細(xì)胞總蛋白、測定蛋白濃度、聚丙烯酰胺凝膠電泳、電轉(zhuǎn)、免疫雜交、 ECL發(fā)光以及膠片曝光，掃描保存結(jié)果；此外，線粒體的分離及蛋白提取均按照文獻(xiàn)[5]所述進(jìn)行具體操作。

2.7ROS檢測使用氧化還原敏感探針DCFH-DA檢測胞內(nèi)ROS的水平。細(xì)胞處理后，胰酶消化離心收集細(xì)胞，PBS洗2次，使用無血清配制的10 μmol·L-1DCFH-DA 37℃孵育30 min。再使用無血清培養(yǎng)基洗細(xì)胞3次，以去除未結(jié)合的游離探針，流式檢測熒光值以量化ROS的變化情況。

3結(jié)果

3.1Jaridonin對MGC-803及GES-1細(xì)胞生存的影響如Fig 1B結(jié)果所示，Jaridonin對胃癌細(xì)胞MGC-803有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性(P<0.01)；而在0~80 μmol·L-1濃度范圍內(nèi)，Jaridonin對人胃粘膜細(xì)胞GES-1的生存影響均遠(yuǎn)沒有對MGC-803影響明顯，差異具有顯著性(P<0.01)；即使在高濃度80 μmol·L-1時(shí)，GES-1生存率下降至31.17%±8.90%，但對比MGC-803生存率2.79%±1.22%，差異仍有顯著性(P<0.01)；此外，Jaridonin對MGC-803及GES-1的IC50分別為14.13 μmol·L-1和41.60 μmol·L-1?？梢?，Jaridonin對癌細(xì)胞具有殺傷選擇性。

Fig 1Effect of Jaridonin on MGC-803 and

A: Molecular structural formula of Jaridonin; B: Effect of Jaridonin on cell proliferation.##P<0.01vscontrol;**P<0.01 GES-1vsMGC-803

3.2Jaridonin誘導(dǎo)MGC-803凋亡不同濃度的Jaridonin作用MGC-803細(xì)胞24 h后，可見15 μmol·L-1的濃度可導(dǎo)致染色質(zhì)濃縮、邊緣化，隨著藥物濃度增加至30 μmol·L-1則出現(xiàn)核膜裂解，染色質(zhì)碎裂成塊狀，形成凋亡小體等典型凋亡狀態(tài)(Fig 2A)；此外，Jaridonin引起了MGC-803細(xì)胞線粒體膜電位的變化，正常細(xì)胞線粒體呈現(xiàn)強(qiáng)的橙色熒光，線粒體膜電位較高；在15 μmol·L-1的Jaridonin作用下，橙色熒光減弱并呈現(xiàn)了一定量的綠色熒光，提示線粒體膜電位較對照組有所下降；當(dāng)藥物濃度升至30 μmol·L-1時(shí)，橙色熒光完全消失，而呈現(xiàn)強(qiáng)的綠色熒光，證明此濃度下線粒體膜電位完全喪失，此時(shí)細(xì)胞調(diào)亡不可逆轉(zhuǎn)(Fig 2B)。

Fig 2Jaridonin induces MGC-803 cell apoptosis

A: Hoechst 33258 fluorescent staining (200×), apoptotic morphology was observed by fluorescence microscopy；B: JC-1 fluorescent staining, the drop of mitochondrial membrane potential (Δψm) of MGC-803 cells was observed by fluorescence microscopy (200×)

3.3Jaridonin誘導(dǎo)了線粒體途徑介導(dǎo)的MGC-803凋亡細(xì)胞色素C的釋放是線粒體膜電位下降的直接后果之一，我們進(jìn)一步檢測了細(xì)胞色素C的釋放情況。Jaridonin作用MGC-803細(xì)胞24 h后，分離線粒體，提取線粒體總蛋白，并作定量，Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，隨著Jaridonin濃度增加，線粒體中細(xì)胞色素C的含量降低明顯(P<0.01)，而細(xì)胞質(zhì)中的含量則明顯增多(P<0.01)(Fig 3A)，證明Jaridonin可誘導(dǎo)細(xì)胞色素C由線粒體釋放至細(xì)胞質(zhì)。同時(shí)，caspase-3酶原蛋白被剪切活化，cleaved-caspase-3蛋白隨著藥物的作用逐漸出現(xiàn)并明顯增多(Fig 3B)。此外，與對照組相比，Jaridonin誘導(dǎo)了Bax表達(dá)明顯上調(diào)(Fig 3B)，說明Jaridonin誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降亦可能與此有關(guān)。以上結(jié)果表明，Jaridonin可以強(qiáng)烈誘導(dǎo)MGC-803細(xì)胞凋亡，且線粒體信號通路參與了該凋亡過程。

3.4Jaridonin對GES-1細(xì)胞凋亡的作用較MGC-803弱藥物分別作用MGC-803和GES-1細(xì)胞24 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Jaridonin明顯誘導(dǎo)了MGC-803的凋亡(P<0.01)，且凋亡率隨著藥物濃度增加而升高，但對胃粘膜上皮細(xì)胞GES-1凋亡影響則較弱，與MGC-803相比，其差異具有顯著性(P<0.01)，見Fig 4。

3.5Jaridonin對MGC-803和GES-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響15 μmol·L-1Jaridonin分別處理MGC-803和GES-1細(xì)胞3、6 h后，裝載DCFH-DA探針，流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn)，MGC-803和GES-1細(xì)胞內(nèi)ROS水平均明顯增加。隨著藥物作用時(shí)間延長，MGC-803內(nèi)ROS一直維持較高水平(Fig 5A)；而GES-1細(xì)胞ROS水平逐漸降低，6 h后檢測發(fā)現(xiàn)幾乎下降至基礎(chǔ)水平(Fig 5B)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了，Jaridonin可以誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，但癌細(xì)胞和正常組織細(xì)胞對此反應(yīng)不一。

3.6抗氧化劑GSH阻斷了Jaridonin的細(xì)胞增殖抑制作用為了證實(shí)ROS在Jaridonin選擇性抑制過程中的重要角色，我們使用3 mmol·L-1GSH預(yù)處理MGC-803 2h，再次檢測了Jaridonin誘導(dǎo)ROS變化及細(xì)胞增殖抑制的作用。結(jié)果表明，GSH完全阻斷15 μmol·L-1Jaridonin誘導(dǎo)的ROS升高(Fig 6A)，以及各個(gè)濃度Jaridonin作用24 h所致使的細(xì)胞死亡，且差異具有顯著性(Fig 6B)。這些結(jié)果提示我們，Jaridonin通過作用于細(xì)胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)，導(dǎo)致ROS積累，從而選擇性殺死癌細(xì)胞。

4討論

Fig 3　Effects of Jaridonin on cytochrome C, Bax and

A: cytochrome C (M=mitochondria, C=cytoplasm); B: Bax, procaspase-3 and cleaved- caspase-3;**P<0.01vscontrol

傳統(tǒng)中草藥冬凌草曾被收入1977年版《中國藥典》，其富含對映貝殼杉烷類二萜化合物[6]，民間廣泛用于抗菌消炎、抗腫瘤。從上世紀(jì)七十年代發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素以來，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)對其開展了化學(xué)成分、構(gòu)效關(guān)系、衍生物合成、抗腫瘤作用與機(jī)制以及臨床應(yīng)用與產(chǎn)品開發(fā)等各方面的廣泛研究，并取得了較多令人振奮的研究成果[7-9]。Jaridonin是本課題組從河南濟(jì)源地區(qū)產(chǎn)冬凌草中提取得到的新單體化合物，其純度高，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，生物活性好，含量亦高，且提取純化工藝簡便，具備較好的開發(fā)前景。本研究證明了其不但具有確切的抗胃癌活性，而且具有明顯的腫瘤選擇性，該獨(dú)特的選擇性作用機(jī)制可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞ROS水平升高直接相關(guān)。

Fig 4　Effect of Jaridonin on apoptosis in MGC-803

**P<0.01vscontrol；##P<0.01, GES-1vsMGC-803

Fig 5　Effect of Jaridonin on the level of ROS in MGC-803

A: Change of ROS in MGC-803；B: Change of ROS in GES-1

Fig 6Effect of Jaridonin on MGC-803 is

A: The increase of Jaridonin-induced ROS was reversed by GSH. B: The effect of Jaridonin on MGC-803 cell proliferation was reversed by GSH.

ROS壓力的增加一直被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的不利因素，但近些年來，越來越多的證據(jù)表明，促使ROS產(chǎn)生和積累可以選擇性殺傷癌細(xì)胞[10-11]。腫瘤細(xì)胞異常的細(xì)胞周期和旺盛的代謝導(dǎo)致細(xì)胞中ROS水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常細(xì)胞，此外，腫瘤細(xì)胞多基因突變導(dǎo)致胞內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶水平往往較正常細(xì)胞低，在此情況下，抑制腫瘤細(xì)胞的抗氧化系統(tǒng)則可以明顯增加ROS水平引起細(xì)胞死亡，而對正常細(xì)胞來說，則不會出現(xiàn)上述現(xiàn)象。腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞在生化方面的不同為開發(fā)高效低毒的新抗腫瘤藥物提供了理論基礎(chǔ)和研發(fā)策略[12]。一些藥物也正是基于這一理論而起到抗腫瘤作用的，例如阿霉素、三氧化二砷以及二甲基雌二醇等皆通過增加胞內(nèi)ROS而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[13]。更有趣的是，處于Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)的小分子化合物elesclomol通過一系列效應(yīng)選擇性引發(fā)癌細(xì)胞凋亡，而這些效應(yīng)也正起始于ROS的增加，隨后引起細(xì)胞色素C 釋放，導(dǎo)致線粒體凋亡通路被激活，最終導(dǎo)致caspase依賴的細(xì)胞凋亡，而對正常細(xì)胞無影響或只有較小影響[14]；臨床研究顯示，其還可提高多種抗腫瘤藥物的療效，包括紫杉醇和多西他賽、吉西他濱等[15]。本研究結(jié)果也同樣表明了，Jaridonin明顯增加胞內(nèi)ROS，誘導(dǎo)Bax表達(dá)上調(diào)，激活了線粒體途徑介導(dǎo)的胃癌細(xì)胞凋亡，而對胃黏膜上皮細(xì)胞無明顯影響；此外，課題組前期研究也證明了Jaridonin誘導(dǎo)ROS增加與其消耗GSH有關(guān)[16]。但是，Jaridonin引起ROS增多是否與NADPH氧化酶亦有關(guān)，以及其誘導(dǎo)的線粒體膜電位下降是否為Bax依賴性還需進(jìn)一步研究；目前，課題組就Jaridonin與紫杉醇、五氟尿嘧啶以及順鉑等化療藥物的聯(lián)用效果研究正在進(jìn)行中，初步的結(jié)果表明，Jaridonin可以減低紫杉醇一半的用量，且能達(dá)到同樣的腫瘤抑制效果，且對比單用紫杉醇組，實(shí)驗(yàn)動物(裸鼠)狀態(tài)更好。但是，該化合物體內(nèi)代謝情況仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。

一個(gè)理想的抗腫瘤藥物應(yīng)該是僅僅對腫瘤組織細(xì)胞具有明顯毒性，而對正常組織細(xì)胞無毒性或者毒性較小，但從目前臨床應(yīng)用的化療藥物來看，此類的藥物數(shù)目還非常有限。所以，探索腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間的生物學(xué)差異，研發(fā)高效低毒的腫瘤選擇性藥物仍是當(dāng)前醫(yī)藥工作者非常重要且富于挑戰(zhàn)的任務(wù)。總之，天然二萜化合物Jaridonin已然是一個(gè)具有潛力的新的抗腫瘤化合物，同時(shí)，通過對該化合物的研究也為更為穩(wěn)定，活性更高，毒性更低的衍生物的設(shè)計(jì)合成提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.011.html

Jaridonin:Selective killing of cancer cells through oxidative stress

MA Yong-cheng1, SU Nan2, QIN Yu-hua1, ZHAO Hong-wei1, ZHANG Wei1,

ZHAO Ning-min1, LI Qiao-yan1, DUAN Hong-fei1, LIU Hong-min3

(1.ClinicalPharmacologyLaboratory,People′sHospital,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450003,China;

2.DeptofQualityDetectionandManagement,HenanUniversityofAnimalHusbandryandEconomy,Zhengzhou450011,China;

3.SchoolofPharmaceuticalSciences,ZhengzhouUniversity,Zhengzhou450001,China)

Abstract:AimTo investigate Jaridonin′s selective killing of cancer cells and explore the related molecular mechanism. MethodsAfter treatment by Jaridonin for 24 h, the effect of Jaridonin on the cell viability was examined using MTT assay. The effect of Jaridonin on cytomorphology and mitochondrial membrane potential (Δψm) was observed by a fluorescence microscopy. The apoptosis of cell lines treated with Jaridonin, as well as the level of reactive oxygen species (ROS) was analyzed by flow cytometry. Expression of the proteins related with mitochondria apoptosis pathways was detected by Western blot. ResultsJaridonin caused strong antiproliferative and apoptotic effects on MGC-803 cells, but there were not remarkable effects on GES-1 cells. Furthermore, the expression of Bax was up-regulated, and the release of cytochrome c from mitochondria to cytosol was also promoted in MGC-803 cells treated by Jaridonin. The cleavage of caspase-3 in MGC-803 cells was also observed. Jaridonin increased persistently intracellular levels of ROS in MGC-803 cells, whereas the level of ROS in GES-1 rose in the first stage, and then decreased, and dropped to the basic level after 6 h. More interestingly, Jaridonin-induced ROS accumulation and the inhibition of MGC-803 cell proliferation were almost completely attenuated in the presence of GSH. ConclusionsJaridonin selectively kills cancer cells and induces apoptosis in MGC-803 through ROS-mediated mitochondrial damage.

Key words:gastric cancer; native compound; tumor cells selectivity; reactive oxygen species; apoptosis; mitochondrial pathway

通訊作者劉宏民(1960-)，男，博士，教授，研究方向：藥物設(shè)計(jì)、合成與構(gòu)效關(guān)系，，Tel: 0371-67781739，E-mail: liuhm@zzu.edu.cn

作者簡介：馬永成(1982-)，男，博士，主管藥師，研究方向：藥理學(xué)、藥物基因組學(xué)，Tel:0371-65897522,E-mail：myc66881998@163.com；

基金項(xiàng)目：國家科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(No 2009ZX09102-154)

收稿日期:2014-10-21,修回日期:2014-11-28

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0198-06

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.011