新疆家蠶抗菌肽誘導人胃癌細胞AGS凋亡的研究

吳艷玲，夏麗潔，張富春

(新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊　830046)

新疆家蠶抗菌肽誘導人胃癌細胞AGS凋亡的研究

吳艷玲，夏麗潔，張富春

(新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊830046)

中國圖書分類號：R329.25；R735.202.2；R977.6；R979.1

摘要：目的探討新疆家蠶抗菌肽(cecropinXJ)是否通過誘導人胃癌細胞AGS凋亡產(chǎn)生抗腫瘤的作用。方法選擇0.01~1 000 mg·L-1濃度范圍內(nèi)的 cecropinXJ與人胃癌細胞AGS和人正常胃上皮細胞GES-1共培養(yǎng)24 h，采用MTT法檢測cecropinXJ對AGS細胞和GES-1細胞增殖的影響；透射電鏡觀察細胞超微結構變化；Hoechst染色觀察細胞凋亡情況；流式細胞術檢測細胞內(nèi)活性氧和線粒體膜電位的變化；實時熒光定量PCR (qRT-PCR)和Western blot 檢測Bax、Bcl-2、caspase-3 以及細胞色素C mRNA和蛋白水平的表達變化。結果CecropinXJ在體外能明顯抑制胃癌AGS細胞的增殖(P<0.05)，并具有濃度依賴性，IC50值為61.19 mg·L-1，但對GES-1細胞無明顯的抑制增殖作用。經(jīng)cecropinXJ處理24 h后，AGS細胞核固縮，呈現(xiàn)典型細胞凋亡特征，同時細胞內(nèi)活性氧增加，線粒體膜電位下降。qRT-PCR和Western blot結果表明，cecropinXJ 能夠引起B(yǎng)cl-2表達下調(diào)，Bax表達上調(diào)，促進細胞色素C的釋放并活化caspase-3。CecropinXJ促進caspase-3活性呈劑量依賴，經(jīng)caspase-3和caspase-9特異性抑制劑處理后可降低cecropinXJ介導的AGS細胞死亡率。結論CecropinXJ可通過下調(diào)Bcl-2表達，上調(diào)Bax表達和活化caspase-3誘導AGS細胞凋亡，是其抗腫瘤機制之一。

關鍵詞：新疆家蠶抗菌肽(cecropinXJ)；胃癌；AGS細胞；細胞凋亡；Bcl-2；Bax；caspase-3;抗腫瘤

Cecropins是Boman等[1-2]首次從惜古比天蠶(hyatophora cecropia)中提取出來的一類抗菌肽家族，目前已發(fā)現(xiàn)的cecropins達20多種。這類家族具有形成特定兩親性α-螺旋的能力，使得它們可針對非極性脂質的細胞膜并在微摩爾濃度下對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌均有強烈的抗菌活性。已有文獻證明，cecropins可抑制多種腫瘤細胞系如白血病[3]、肝癌[4]、膀胱癌[5]和胃癌[6]的增殖，但不損傷正常細胞，這一特點使得抗菌肽有望成為新一代的抗腫瘤藥物。

就目前研究結果顯示，cecropins的毒性機制很保守，除了通過細胞膜裂解機制誘導腫瘤細胞快速死亡，還可以進入細胞激活細胞內(nèi)凋亡信號通路，引起細胞程序性死亡[7]。 Paredes-Gamero等[8]報道，低濃度的抗菌肽可能是通過增加細胞內(nèi)Ca2+和自由基，激活caspase-3的信號通路促進K562細胞的凋亡，而高濃度的抗菌肽通過裂解細胞膜直接促使細胞死亡。

1材料

1.1細胞株人胃癌細胞系AGS和人正常胃上皮細胞GES-1由北京大學腫瘤醫(yī)院腫瘤分子生物學實驗室提供。

1.2藥品與試劑cecropinXJ：由本實驗室誘導表達和純化，儲存在-80℃?zhèn)溆茫籇MEM培養(yǎng)基：美國Hyclone公司；胎牛血清：美國Gibco公司；二甲基亞砜(DMSO)：北京Solarbio公司；噻唑藍(MTT)、Hoechst 33258、2,7′-二氯雙氫熒光素二乙酸酯(H2DCF-DA)、3,3′-二己基含氧碳菁碘代物[DiOC6(3)]：美國Sigma公司；Bax、Bcl-2、caspase-3、細胞色素C單克隆抗體(1 ∶2 000)：美國Cell Signaling Technology公司；GAPDH單克隆抗體、HRP-goat anti-mouse IgG：美國Proteintech公司；TRIzol Reagent：美國Invitrogen公司；caspase-3抑制劑Ac-DEVE-fmk、caspase-8抑制劑Ac-IETD-fmk、caspase-9抑制劑Ac-LEHD-fmk：瑞士Enzo Life Sciences公司；caspase-3檢測試劑盒：上海貝博生物有限公司；SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus):日本TaKaRa公司；超敏ECL化學發(fā)光試劑盒:北京康為世紀生物科技有限公司。

1.3儀器CO2細胞培養(yǎng)箱:德國Heraeus公司；7500 system熒光定量PCR儀：美國ABI公司；ImageQuant LAS 4000 min超靈敏化學發(fā)光成像儀、酶標儀：美國Bio-Rad公司；倒置顯微鏡、熒光顯微鏡：德國Leica公司；流式細胞儀：美國BD公司。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)人胃癌細胞系AGS和人胃上皮細胞GES-1在含有10%胎牛血清、105U·L-1青霉素和鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，于5% CO2、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2細胞存活實驗為了檢測cecropinXJ對AGS細胞和GES-1細胞增殖的影響，通過MTT法檢測細胞的存活率。將處于對數(shù)生長期的AGS細胞和GES-1細胞以每孔4×104個細胞的密度接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜。選擇濃度范圍在0~1 000 mg·L-1cecropinXJ處理24 h，不加cecropinXJ為陰性對照，每組設6個復孔。處理過后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入20 μL MTT (5 g·L-1)溶液于37℃避光孵育4 h。然后，每孔加入100 μL DMSO溶液，于酶標儀檢測540 nm/655 nm波長處吸光度值(A值)，計算細胞存活率。計算公式：細胞存活率/%=[(A處理組-A空白組)/(A對照組-A空白組)]×100%。實驗重復3次。

2.3透射電鏡觀察細胞超微結構變化收集0、50、100 mg·L-1cecropinXJ處理24 h的AGS細胞，用2.5%戊二醛溶液4℃固定過夜。0.1 mol·L-1磷酸緩沖溶液(PBS)沖洗2 h，加入800 μl 1%鋨酸進行雙固定。通過分級乙醇、丙酮梯度逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋后制備超薄切片，醋酸鈾和枸櫞酸鉛染色，透射電鏡觀察細胞超微結構。

2.4Hoechst 33258觀察細胞凋亡情況收集對數(shù)生長期的AGS細胞1×108·L-1，接種于鋪有無菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，5% CO2、37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。加入濃度分別為0、20、50、80、100 mg·L-1cecropinXJ處理24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌后用95%乙醇4℃固定10 min。去固定液，用PBS洗2次后，加入終濃度為0.5 g·L-1的Hoechst 33258染色液，于4℃避光染色10 min。PBS洗滌后，50%甘油封片劑封片，熒光顯微鏡觀察拍照。鏡下隨機計數(shù)10個視野，按以下公式計算：細胞凋亡率/%=(凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100%。

2.5流式細胞儀檢測細胞內(nèi)活性氧的水平通過流式細胞儀測定H2DCF-DA熒光強度測定細胞內(nèi)活性氧的含量。收集對數(shù)生長期的AGS細胞1×108·L-1，接種于6孔板內(nèi)，5% CO2、37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。加入濃度分別為0、20、50、100 mg·L-1cecropinXJ處理24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入終濃度為10 μmol·L-1的H2DCF-DA熒光探針，于37℃避光孵育30 min。吸去H2DCF-DA熒光探針，用PBS洗2遍后，胰酶消化重懸于1 mL PBS中，上流式細胞儀進行檢測。

制造活動的經(jīng)濟成本包括其制造活動運行中的工時成本以及制造活動運行的資源消耗成本兩部分。制造活動MAi的經(jīng)濟成本

2.6流式細胞儀檢測線粒體膜電位的變化線粒體膜電位在細胞凋亡過程中的變化通過 DiOC6(3)進行測定。收集對數(shù)生長期的AGS細胞1×108·L-1，接種于6孔板內(nèi)，5% CO2、37℃恒溫箱培養(yǎng)過夜。加入濃度分別為0、20、50、100 mg·L-1cecropinXJ處理24 h，棄去培養(yǎng)液，PBS洗滌后加入終濃度為40 nmol·L-1的DiOC6(3)染料，于37℃避光孵育30 min。吸去染料，用PBS洗2遍后，胰酶消化重懸于1 mL PBS中，上流式細胞儀進行檢測。

2.7實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測Bax、Bcl-2、caspase-3、細胞色素C mRNA的表達培養(yǎng)AGS細胞大約至80%時，用不同濃度cecropinXJ 即0、20、50、100 mg·L-1處理24 h。收集細胞，TRIzol法提取細胞的總RNA，將RNA反轉成cDNA。qRT-PCR引物為caspase-3：5′-AGACATACTCCTTCCATCAA-3′(上游)，5′-TCATAGCACAGCATCACT-3′(下游)；細胞色素C：5′-TGGATACTCTTACACAGCCG-3′(上游)，5′-AAGTCTGCCCTTTCTTCCTT-3′(下游)；Bax：5′-GATGATTGCCGCCGTGGAC-3′(上游)，5′-GGGTGAGGAGGCTTGAGGAG-3′(下游)；Bcl-2：5′-GAACTGGGGGAGGATTGTGG-3′(上游)，5′-GGATCCAGGTGTGCAGGTGC-3′(下游)；GAPDH：5′-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3′(上游)，5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′ (下游)。SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒檢測mRNA的表達變化，GAPDH作為內(nèi)參。25 μL反應體系包括：12.5 μL Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)，1 μL上游引物和下游引物(2.5 μmol·L-1)， 0.5 μL ROX Refrence Dye II (50×)和100 ng cDNA。通過95 ℃ 30 s的預熱激活DNA聚合酶，PCR擴增條件為95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40個循環(huán)。實驗結果使用2-ΔΔCt法進行統(tǒng)計分析。

2.8Western blot檢測Bax、Bcl-2、caspase-3、細胞色素C蛋白的表達培養(yǎng)AGS細胞于100 mm培養(yǎng)皿中，加入濃度分別為0、20、50、80、100 mg·L-1cecropinXJ處理24 h，收集5×106個細胞。用冷PBS洗滌細胞2次，加入100 μL冷的細胞裂解液，高速渦旋振蕩15 s，置冰上裂解15 min。14 000 r·min-1離心15 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。取40 μg總蛋白的裂解上清，進行12% SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉至NC膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBS/T洗滌膜3次，然后分別與Bax、Bcl-2、caspase-3、細胞色素C、GAPDH 單克隆抗體(1 ∶2 000) 4℃孵育過夜。TBS/T洗膜后加入HRP標記的山羊抗鼠IgG二抗(1 ∶2 000)室溫孵育2 h，用超敏ECL化學發(fā)光試劑盒于ImageQuant LAS 4000 min超靈敏化學發(fā)光成像儀上曝光，GAPDH作為內(nèi)參。

2.9Caspase-3活性的檢測培養(yǎng)AGS細胞于100 mm培養(yǎng)皿中，加入濃度分別為0、20、50、80、100 mg·L-1cecropinXJ處理24 h，收集5×106個細胞。用冷PBS洗滌細胞2次，按試劑盒說明書方法重懸于100 μL冷的裂解緩沖液中，高速渦旋振蕩15 s，置冰上裂解15 min。14 000 r·min-1離心15 min，取上清，Bradford法測定蛋白濃度。取50 μg總蛋白的裂解上清，加入90 μL檢測緩沖液，加入10 μL Ac-DEVD-pNA，在37℃避光反應2 h或過夜。測定405 nm下的吸光度值(A值)。根據(jù)處理組細胞的吸光度值與空白對照細胞的吸光度值的比值計算caspase-3的相對活性。caspase-3的相對活性=A處理組/A對照組。

2.10Caspase抑制劑對cecropinXJ介導的AGS細胞死亡的影響為了確定cecropinXJ誘導細胞凋亡可能有caspase相關的信號通路參與，將caspase-3抑制劑(Ac-DEVD-fmk)、caspase-8抑制劑(Ac-IETD-fmk)、caspase-9抑制劑(Ac-LEHD-fmk)與AGS細胞共孵育1 h，加入濃度分別為0、60 mg·L-1cecropinXJ進行處理，cecropinXJ單獨處理作為對照。通過MTT法檢測caspase抑制劑對cecropinXJ介導的AGS細胞死亡的影響。

3結果

3.1CecropinXJ抑制AGS細胞的增殖通過MTT法檢測濃度范圍在0.01~1 000 mg·L-1cecropinXJ對AGS細胞和GES-1細胞增殖的影響，F(xiàn)ig 1結果顯示,經(jīng)cecropinXJ處理24 h后，與對照組相比，cecropinXJ從濃度0.5 mg·L-1開始能明顯抑制AGS細胞的增殖(P<0.05)，并具有濃度依賴性。其半數(shù)有效抑制濃度IC50=61.19 mg·L-1。但cecropinXJ對GES-1細胞作用24 h后，在作用濃度為200 mg·L-1以內(nèi)時，對GES-1細胞的生長增殖幾乎沒有影響，而當cecropinXJ作用濃度達到500 mg·L-1時，對GES-1的生長才具有明顯抑制作用(P<0.05)。由此可知，cecropinXJ對于非腫瘤細胞系在一定濃度范圍內(nèi)不具有增殖抑制作用，而當cecropinXJ濃度大于500 mg·L-1時，對非腫瘤細胞系具有增殖抑制作用，而該抑制作用可能與細胞毒性相關。

Fig 1　Effects of cecropinXJ on the proliferation of

*P<0.05,**P<0.01vs0 mg·L-1cecropinXJ group

3.2CecropinXJ破壞AGS細胞的超微結構如Fig 2所示，正常的AGS細胞表面有豐富的微絨毛，胞質內(nèi)線粒體嵴結構完整，并可見大量的粗面內(nèi)質網(wǎng)及游離核糖體。細胞核內(nèi)染色體分布均勻，核仁清晰。而用50 mg·L-1cecropinXJ處理的AGS細胞微絨毛結構被破壞，核內(nèi)染色質濃縮，并集聚于核膜周圍。核膜、胞膜、各細胞器膜均完整。100 mg·L-1cecropinXJ處理的AGS細胞大多為壞死的細胞，這些細胞的染色質呈不規(guī)則的團塊狀，但不像凋亡細胞那樣集中于核周邊。細胞膜、核膜和細胞器的結構被破壞，線粒體空泡化，細胞崩解，胞質及其內(nèi)容物外泄。

Fig 2Effects of cecropinXJ on morphology of AGS cells

by transmission electron microscopy

3.3CecropinXJ誘導AGS細胞凋亡的形態(tài)學變化通過Hoechst 33258染色觀察細胞核的形態(tài)，檢測細胞凋亡情況。Hoechst 33258熒光染色圖片顯示，對照組的細胞核呈圓形，染色質分布均勻，細胞核為藍色均勻淡染。而不同濃度cecropinXJ處理24 h后的AGS細胞核固縮，染色質致密深染并片段化，表現(xiàn)為典型的細胞凋亡形態(tài)學特征。如Fig 3所示，隨著cecropinXJ濃度的增加，這種致密深染的細胞的數(shù)量也隨之增加，至80 mg·L-1時AGS細胞總凋亡率已達到了(45.73±1.94)%。依據(jù)這些形態(tài)學的變化說明cecropinXJ能夠引起AGS細胞的凋亡。

3.4CecropinXJ促進AGS細胞活性氧的產(chǎn)生細胞內(nèi)活性氧自由基的含量變化對于細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要作用。為了探討cecropinXJ誘導的細胞凋亡是否與細胞內(nèi)活性氧含量變化相關，我們用H2DCF-DA熒光探針檢測不同濃度cecropinXJ處理24 h后AGS細胞內(nèi)活性氧含量的變化，其中DCF的熒光強度反映了活性氧的水平。Fig 4結果顯示，經(jīng)20 mg·L-1和50 mg·L-1cecropinXJ處理后AGS細胞內(nèi)活性氧含量增加，但無顯著性差異，而100 mg·L-1cecropinXJ處理后，AGS細胞內(nèi)活性氧含量明顯增加(P<0.01)。結果表明，cecropinXJ可促進AGS細胞活性氧產(chǎn)生，并具有濃度依賴性。

Fig 3　Changes in apoptotic nuclear morphology of cecropinXJ-treated AGS cells by Hoechst 33258 staining (magnification:10×)

*P<0.05,**P<0.01vs0 mg·L-1cecropin XJ group

Fig 4 CecropinXJ promotes ROS production of AGS cells

Fig 5CecropinXJ decreases mitochondrial membrane potential in AGS cells

**P<0.01vs0 mg·L-1cecropinXJ group

Fig 6Effects of cecropinXJ on expression of caspase-3,

Bcl-2, Bax and cytochrome C in AGS cells

A: The relative expression of caspase-3, Bcl-2, Bax and cytochrome C by qRT-PCR; B: The protein expression of caspase-3, Bcl-2, Bax and cytochrome C by Western blot. GAPDH was used as reference.**P<0.01vs0 mg·L-1cecropinXJ group

3.5CecropinXJ降低線粒體膜電位(Δψm)為了驗證cecropinXJ處理后能否誘導細胞線粒體膜電位的改變，采用流式細胞儀檢測DiOC6(3)熒光染料的熒光強度，熒光強度下降說明線粒體膜遭到破壞，導致線粒體膜電位下降。Fig 5結果顯示，與對照組相比，20、50、100 mg·L-1cecropinXJ處理后熒光強度從(1 188.32±5.50)減弱到(985.89±42.31)、(643.96±94.91) 和(533.56±36.58)，具有濃度依賴性。此結果表明，cecropinXJ可改變線粒體膜的通透性從而降低線粒體膜電位。

3.6CecropinXJ對AGS細胞中caspase-3、Bcl-2、Bax、細胞色素C表達的影響caspase家族和Bcl-2家族在細胞的凋亡過程中扮演舉足輕重的作用，在本實驗中，選取了caspase家族中的caspase-3以及Bcl-2家族中的促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2，通過qRT-PCR和Western blot的方法進一步驗證caspase家族和Bcl-2家族成員是否參與了cecropinXJ誘導的細胞凋亡過程。如Fig 6所示，經(jīng)cecropinXJ處理之后，caspase-3被剪切，Bcl-2表達下調(diào)，Bax和細胞色素C表達均上調(diào)，并具有濃度依賴性。研究表明，當Bcl-2/Bax表達比率發(fā)生變化時，可改變線粒體膜的通透性，促進細胞色素C的釋放，進而激活caspase-3，使細胞凋亡[11]。

Fig 7　CecropinXJ regulates caspase activity

A: AGS cells were treated with various concentration of cecropinXJ (0, 20, 50, 80, 100 mg·L-1) for 24 h and detected caspase-3 activity by caspase activity detection kit.*P<0.05,**P<0.01vs0 mg·L-1cecropinXJ group; B: MTT assays detected the cell death ratio induced by cecropinXJ after addition of caspase-3 inhibitor (Ac-DEVE-fmk), caspase-8 inhibitor (Ac-IETD-fmk) and caspase-9 inhibitor (Ac-LEHD-fmk).**P<0.01vscecropin XJ group.

3.7CecropinXJ調(diào)節(jié)caspase-3的活性細胞凋亡的過程涉及一系列蛋白酶活性的變化，其中絕大多數(shù)為caspase酶。為了進一步確定cecropinXJ激活的凋亡信號途徑，通過檢測細胞內(nèi)caspase-3的活性以及用caspase-3抑制劑Ac-DEVE-fmk、caspase-8抑制劑Ac-IETD-fmk、caspase-9抑制劑Ac-LEHD-fmk處理后對cecropinXJ誘導的細胞死亡的影響。如Fig 7所示，50 mg·L-1cecropinXJ處理24 h后，caspase-3的活性較對照組相比具有明顯的增加(P<0.05)，是對照組的1.4倍，而100 mg·L-1cecropinXJ處理后，caspase-3的活性是對照組的2.39倍，說明cecropinXJ可激活caspase-3的活性并具有濃度依賴性。在AGS細胞中，caspase-3抑制劑Ac-DEVE-fmk和caspase-9抑制劑Ac-LEHD-fmk均能明顯地降低cecropinXJ誘導的AGS細胞死亡率，分別可使細胞的死亡率從(51.70±7.19)%減少到(23.93±6.66)%和(31.6±9.61)%，而caspase-8抑制劑Ac-IETD-fmk對細胞死亡率無影響。表明caspase-3和caspase-9參與cecropinXJ激活的凋亡信號途徑，caspase-8與此通路無關。

4討論

目前發(fā)現(xiàn)許多抗菌肽具有抗腫瘤活性，并且已經(jīng)成為人們研究的熱點。自Moore等[12]首次發(fā)現(xiàn) Cecropin B對哺乳動物的腫瘤細胞具有抗腫瘤活性以來，許多文獻相繼報道了Cecropin家族的抗菌肽對胃癌、膀胱癌、肝癌等多種腫瘤細胞均具有殺傷作用[13]，并且由于其結構本身能形成特定的兩親α-螺旋，可針對非極性脂質的細胞膜，當在膜上定位時，它們在膜上形成離子滲透通道，隨后進入細胞導致細胞去極化，發(fā)生不可逆的細胞破裂，最后死亡。Zhang等[14]研究證明來自于中國柞蠶的cecropin對大鼠大腸癌細胞具有明顯的抗腫瘤作用，但對人正常胃上皮細胞毒性低，表明cecropins能特異性地殺傷腫瘤細胞，但對正常的真核細胞影響甚微。Hui等[15]通過檢測cecropin A 對白血病細胞的IC50顯示，cecropin A 可裂解白血病細胞，但對淋巴細胞無毒副作用，而傳統(tǒng)的化療藥物如5-氟脲嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)對正常細胞和腫瘤細胞無選擇性。通過 MTT檢測顯示，cecropinXJ在500 mg·L-1作用濃度范圍內(nèi)對正常胃上皮細胞系GES-1的增殖幾乎沒有影響，并且能明顯抑制AGS細胞增殖，隨著濃度的增高，抑制效果增強，在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性，其IC50=61.19 mg·L-1，此結果表明cecropinXJ同其他的cecropins一樣具有對腫瘤細胞選擇性殺傷作用。形態(tài)學的改變是判斷凋亡的基礎，主要特點有染色質固縮、DNA片段化、線粒體腫脹或是出現(xiàn)凋亡小體[16-17]。透射電鏡和Hoechst 33258熒光染色結果顯示，cecropinXJ處理的AGS細胞具有明顯的凋亡現(xiàn)象，且隨著濃度的增加凋亡的細胞數(shù)明顯呈增多的趨勢。

大多數(shù)的抗腫瘤藥物抑制腫瘤細胞的增殖是通過促進腫瘤細胞凋亡達到的，細胞凋亡的途徑主要為Fas死亡受體途徑和線粒體內(nèi)途徑。據(jù)報道，引起腫瘤細胞凋亡主要的途徑是線粒體內(nèi)途徑[18]。Risso等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽可增加細胞膜通透性隨之進入胞內(nèi)，由于線粒體膜帶有大量負電荷分子，陽離子的抗菌肽通過靜電作用與線粒體膜作用，使線粒體膜電位下降，隨后細胞產(chǎn)生大量的活性氧作為強烈的凋亡誘導信號，過量的活性氧增加線粒體膜通透性，凋亡啟動因子細胞色素C被釋放并激活半胱氨酸水解酶誘導細胞凋亡。體外研究抗菌肽或cecropins誘導腫瘤細胞凋亡的文獻很多，如Cerón等[20]報道cecropin A可誘導人早幼粒白血病細胞凋亡，其機制可能是由于cecropin A促進細胞內(nèi)活性氧增加，導致磷脂酰絲氨酸外翻和DNA片段化，最終導致細胞凋亡，但此過程不引起caspase酶的激活。而另外一種抗菌肽蜂毒肽 (melittin)，在蜂毒中發(fā)現(xiàn)的一種含有26個氨基酸的抗菌肽，通過增加細胞內(nèi)活性氧、激活caspase誘導腫瘤細胞凋亡[21]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)cecropinXJ處理以后活性氧在AGS細胞內(nèi)迅速積累，并且線粒體膜電位下降，這表明cecropinXJ參與AGS細胞凋亡的誘導。為了進一步確認cecropinXJ是否是通過caspase依賴的途徑，通過qRT-PCR、Western blot以及酶活性的檢測確定cecropinXJ對caspase-3表達的影響。結果表明，cecropinXJ在mRNA和蛋白水平上均可上調(diào)caspase-3的表達，而且caspase-3的活性隨著cecropinXJ濃度的增加而逐漸增加，在使用caspase-3和caspase-9抑制劑之后降低了cecropinXJ誘導的細胞死亡率，但是caspase-8抑制劑無此效果，說明caspase-8不參與cecropinXJ誘導的細胞凋亡過程。綜上結果顯示cecropinXJ誘導細胞凋亡可能是依賴caspase的途徑。

Bcl-2是細胞死亡的負調(diào)控因子，主要定位在核膜的胞質面、內(nèi)質網(wǎng)及線粒體外膜上，在細胞凋亡過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)功能，包括促凋亡(如Bax)和抗凋亡(如Bcl-2)兩類家族，其中Bax和Bcl-2往往成比例存在，Bax的表達上調(diào)能夠拮抗Bcl-2的抑凋亡效應。當Bax/Bcl-2比例上升時，線粒體膜電位發(fā)生變化，可導致線粒體膜通透性增加，使細胞凋亡的啟動因子(如細胞色素C)從線粒體內(nèi)釋放出來，激活caspase-3誘導細胞發(fā)生凋亡[22]。通過cecropinXJ處理之后，AGS細胞內(nèi)Bax表達上調(diào)，而Bcl-2表達下調(diào)，使Bax/Bcl-2比例明顯增高，促進細胞色素C的釋放。說明cecropinXJ對線粒體膜的影響是顯著的，這與線粒體膜電位的結果相一致。

綜上所述，cecropinXJ對AGS細胞的增殖有抑制作用，其抗腫瘤活性可能與誘導細胞凋亡有關。其凋亡的相關機制可能為cecropinXJ處理之后引起AGS細胞內(nèi)活性氧含量的升高，Bax/Bcl-2比例上升，從而使線粒體膜電位下降，增加線粒體膜的通透性，促進細胞色素C從線粒體釋放并激活caspase-3，進而誘導細胞凋亡。因此，cecropinXJ可能是通過線粒體內(nèi)途徑的機制誘導AGS細胞凋亡，為進一步開發(fā)cecropinXJ成為抗腫瘤藥物奠定了理論基礎。

參考文獻:

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網(wǎng)絡出版時間：2015-1-9 13:37網(wǎng)絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.009.html

Apoptosis of human gastric carcinoma AGS cells induced by cecropinXJ

WU Yan-ling, XIA Li-jie, ZHANG Fu-chun

(XinjiangKeyLaboratoryofBiologicalResourcesandGeneticEngineering,CollegeofLifeScienceandTechnology,

XinjiangUniversity,Urumqi830046,China)

Abstract:AimTo investigate the apoptosis of human gastric carcinoma AGS cells induced by cecropinXJ. MethodsHuman gastric carcinoma AGS cells and human normal epithelial cells GES-1 were co-cultured with different concentrations of cecropinXJ ranging from 0.01 to 1 000 mg·L-1for 24 h. MTT assay was used to observe the effects of cecropinXJ on the proliferation of AGS cells and GES-1 cells. The ultrastructural changes of the AGS cells were observed by transmission electron microscopy. Hoechst staining was used to detect cell apoptosis. The changes of intracellular reactive oxygen species (ROS) and mitochondrial potential were analysed by flow cytometery. The expression of Bax, Bcl-2, caspase-3 and cytochrome C in mRNA level was investigated by qRT-PCR. Western blot was used to determine the protein expression of Bax, Bcl-2, caspase-3 and cytochrome C. ResultsCecropinXJ significantly suppressed the proliferation of AGS cells in vitro (P<0.05) in a dose-dependent manner, IC50=61.19 mg·L-1, but had no inhibitive effects on the proliferation of GES-1 cells. After treatment for 24 h, cecropinXJ induced AGS cells nuclear condensation, and increased ROS production, disrupted mitochondrial integrity. The results of qRT-PCR and Western blot demonstrated cecropinXJ could up-regulate the expression of Bax and down-regulate the expression of Bcl-2, promote the release of cytochrome C and activate caspase-3. Meanwhile, cecropinXJ promoted caspase-3 activity in a dose-dependent manner, and cell death ratio of AGS cells induced by cecropinXJ was significantly reduced by caspase-3 and caspase-9 specific inhibitors treatment. ConclusionCecropinXJ can induce apoptosis of AGS cells by downregulating Bcl-2, upregulating Bax and activating caspase-3, which may be one of its anti-tumor mechanisms.

Key words:cecropinXJ; human gastric carcinoma; AGS cells; cell apoptosis; Bcl-2; Bax; caspase-3; anti-tumor

通訊作者張富春(1962-)，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：生物化學與分子生物學，，E-mail: zfcxju@xju.edu.cn

作者簡介：吳艷玲(1991-)，女，碩士生，研究方向：生物化學與分子生物學，E-mail: 394219460@qq.com；

基金項目：新疆維吾爾自治區(qū)高技術研究發(fā)展計劃項目(No 201110101)

收稿日期:2014-09-21,修回日期:2014-10-28

文獻標志碼：A

文章編號：1001-1978(2015)02-0186-08

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.02.009