氮氧化物吸入致小鼠肺損傷后血清MMP-2、MMP-9和HYP的變化

李建忠 岳茂興 馮凱 司少艷 徐冰心 陳阿鑫 劉志國

在各類煤礦、化工廠等爆炸事故發(fā)生時，被困人員經(jīng)常被限制于各類狹窄空間內(nèi)，由于其空間狹小并相對封閉，經(jīng)常會吸入氮氧化物等有毒有害氣體。以氮氧化物(N2O2)為例，若意外發(fā)生吸入性中毒，可導致肺水腫等嚴重肺損傷，出現(xiàn)胸悶、呼吸窘迫、咳嗽、咯泡沫痰、紫紺等成人呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome,ARDS)和肺水腫癥狀，或經(jīng)數(shù)十小時或更長時間潛伏期后發(fā)生遲發(fā)性肺水腫，乃至中毒死亡。四氧化二氮(N2O4)是由二氧化氮(NO2)疊合而成，是比較常見的液體火箭燃料之一，常溫即可分解為NO2氣體，與水反應(yīng)生成等摩爾硝酸和亞硝酸混合物。也有文獻顯示[1-2]，長期低劑量暴露在含有NO2環(huán)境中或可能導致肺纖維化或肺部腫瘤。本實驗擬通過固定小鼠口鼻，采用特殊染毒裝置吸入定量N2O4制作動物中毒模型，通過檢測血清基質(zhì)金屬蛋白酶-2/9(MMP-2/9)和羥脯氨酸(HYP)表達等指標水平變化，為探討N2O4致急性肺損傷的機制提供實驗依據(jù)。

資料與方法

一、一般資料

實驗動物系ICR小鼠16只，雌雄各半，體重23～25 g，購自北京市維通利華實驗動物中心[動物使用許可證號：SCXK-(京)2006-0009]。按隨機數(shù)字表法分為對照組和中毒組，每組8只。

二、方法

(一)模型制作：將動物通過固定小鼠口鼻的方式，采用簡易靜態(tài)染毒裝置吸入定量N2O4，制作小鼠中毒致肺損傷動物模型。液態(tài)N2O4來自航天科技集團公司第一研究院101研究所，其濃度高于99.5%，比重為1∶45。

(二)指標檢測：動物模型制作并予以相應(yīng)治療6 h后，觀察小鼠的癥狀和體征采用眼球摘除法取血0.5～1.0 mL，離心機2 500 r/min，離心5 min，微量取樣器分離血清100 μL，-70℃保存。測定血清MMP-2、MMP-9和HYP采用酶聯(lián)免疫法，試劑盒購自北京市方程生物科技有限公司，具體方法見試劑盒說明書。酶標儀為美國伯樂680型，購自美國Bio-Rad公司[3-4]。

三、統(tǒng)計學分析

結(jié) 果

小鼠吸入N2O4后可出現(xiàn)如屏息、呼吸困難、紫紺等呼吸道缺氧癥狀。中毒組小鼠血清MMP-2水平與對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；中毒組小鼠血清MMP-9 水平與對照組相比明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；中毒組小鼠血清HYP水平與對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。 表1。

討 論

在某些化學品火災(zāi)、彈藥爆炸等災(zāi)害事故現(xiàn)場中，會有吸入大量氮氧化物的情況出現(xiàn)，引起不同程度的急性肺損傷。在基地衛(wèi)勤保障和試驗任務(wù)中，以N2O4為主的有毒有害氣體吸入事件時有發(fā)生。臨床資料顯示，N2O4中毒可導致出現(xiàn)胸悶、咳嗽和咯泡沫痰等呼吸窘迫綜合征的癥狀，甚至發(fā)生遲發(fā)性肺水腫[5-6]。

表1 N2O4吸入模型小鼠血清MMP-2、MMP-9及HYP含量變化

注：MMP-2為金屬蛋白酶2，MMP-9為金屬蛋白酶2，HYP為羥脯氨酸

基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一個大家族，因其需要Ca2+、Zn2+等金屬離子作為輔助因子而得名。其家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)，一般由疏水信號肽序列、主要作用是保持酶原穩(wěn)定的前肽區(qū)、催化活性區(qū)、富含脯氨酸的鉸鏈區(qū)和與酶的底物特異性有關(guān)的羧基末端區(qū)構(gòu)成。MMPs成員幾乎能降解ECM中的各種蛋白成分,破壞機體組織學屏障，Ⅳ型膠原酶為其中重要的一類，他主要有兩種形式，一種被糖化，分子量為92kD，命名為MMP-9;另一種非糖化，分子量為72kD，被稱為MMP-2?；罨腗MP-2定位于細胞穿透基質(zhì)的突出部位，估計其在酶解細胞間基質(zhì)成分及基底膜的主要成分Ⅳ型膠原中有“鉆頭”的作用，可破壞或降解多種細胞外基質(zhì)成份，其表達水平增高，可對各類組織造成不同程度的急性損傷[7-8]。

本實驗中，模型組小鼠血清MMPS-2/9和HYP的表達較對照組明顯升高,差異均有統(tǒng)計學意義。提示可能的損傷機制：N2O4進入肺組織后，引起大量中性粒細胞聚積，分泌大量自由基，并產(chǎn)生大量的氧化物質(zhì)，改變MMPs空間結(jié)構(gòu)，使MMPs酶活性中心暴露而激活，從而發(fā)揮其損傷作用，造成肺細胞基質(zhì)成分蛋白質(zhì)異常代謝，嚴重破壞肺組織細胞，引起急性肺損傷，使機體受損或引起死亡。

綜上所述，血清MMP-2/9及HYP，可作為N2O4吸入中毒造成急性肺損傷的檢測指標，對研究此類中毒損傷機制具有一定參考價值。

1 李建忠，劉志國，張瑞華，等.四氧化二氮模型致肺損傷后ANP、MehtHb和病理學變化研究[J].臨床和實驗醫(yī)學雜志，2012，3(139)：175-176.

2 李勝亮，武志宏，張淑琴，等.30例四氧化二氮群體吸入模型急救分析[J].臨床肺科雜志，2011，16(2)：307-308.

3 何岱昆，申捷，張琳，等.地塞米松預(yù)處理對大鼠光氣吸入性肺損傷基質(zhì)金屬蛋白酶-9表達的影響[J].中華勞動衛(wèi)生職業(yè)病雜志，2011，29(4)：289-291.

4 張向峰，高明哲，Hussein DF.基質(zhì)金屬蛋白酶-2、9在高壓氧所致急性肺損傷實驗中毒表達[J].中華急診醫(yī)學雜志，2005,14(1)：12-15.

5 李建忠，劉志國，馮凱，等.四氧化二氮模型小鼠血清TGF-β1、KL-6和SP蛋白表達[J].中國急救復(fù)蘇與災(zāi)害醫(yī)學雜志，2013，8(11)：997-999.

6 劉雪雁，趙詩萌，薛辛東.MMPS-9和TIMP-1在新生大鼠持續(xù)高氧暴露后肺組織中的動態(tài)表達[J].中國醫(yī)科大學學報，2007,36(5)：502-504.

7 Dziembowska M,wlodarczyk J.MMP9：A novel functiong in synaptic plasticity[J].Int Jbioch Cell Biol,2012，44(5)：709-713.

8 楊潤秀，劉瑤，宋琴，等.百草枯中毒肺纖維化患者血清基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制物影響[J].中國全科醫(yī)學雜志，2011,14(1)：210-211.