重樓種苗繁育研究進展

羅敏 李娟 章文偉 鄧才富 譚秋生

摘要：重樓為我國名貴中藥材，極具藥用價值。近年來重樓藥材需求量逐漸增加，人工栽培存在瓶頸，野生資源開采陷入惡性循環(huán)，且已嚴重透支。因此，在加強重樓資源保護的同時，積極深入開展基礎研究，破解種苗繁育問題，推動人工栽培，以滿足市場需求，對實現重樓資源的可持續(xù)發(fā)展和采用具有重要意義。本文綜述了重樓種苗繁育現狀，包括種子繁殖、莖段繁殖及組織培養(yǎng)等，為重樓規(guī)范化種植、資源保護與利用提供參考。

關鍵詞：重樓；種苗繁育；組織培養(yǎng)；綜述

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.01.032

中圖分類號：R282.2 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2016）01-0120-05

Research Progress in Seeding Breeding of Paridis Rhizoma LUO Min， LI Juan， ZHANG Wen-wei， DENG Cai-fu， TAN Qiu-sheng （Chongqing Institute of Medicinal Plant Cultivation， Institute of Medicinal Plant Development， Chinese Academy of Medical Sciences， Chongqing 408435， China）

Abstract： Paridis Rhizoma is a rare Chinese herbal medicine with variety of medicinal values. In recent years， the demand for Paridis Rhizoma has increased gradually. Artificial cultivation has met difficulties， while exploitation of wild resources was caught in a vicious circle and has overdrawn seriously. So it is of great significance to enhance the protection of Paridis Rhizoma， carry out basic research， in order to solve problems in seeding breeding， promote artificial cultivation to meet the market need and achieve sustainable development and supply. This article reviewed the status qua of seedling breeding of Paridis Rhizoma， including seed breeding， tuber breeding and tissue culture， with a purpose to standardize planting of resource conservation and utilization of Paridis Rhizoma.

Key words： Paridis Rhizoma； seeding breeding； tissue culture； review

中藥材重樓為百合科重樓屬植物云南重樓Paris polyphylla Smith var. yunnanensis（Franch.）Hand. -Mazz.或七葉一枝花Paris polyphylla Smith var. chinensis （Franch.）Hara的干燥根[1]?！渡褶r本草經》與《本草綱目》對其藥用情況具有較詳細的記載，是云南白藥系列、宮血寧膠囊等產品的主要原料。近年來對重樓資源需求逐年增加，但忽視了對重樓資源的保護和繁育，亂采濫挖現象凸顯，重樓野生資源已陷入開采的惡性循環(huán)，導致野生資源嚴重透支。因此，人工種養(yǎng)亟待升級，其中，種苗繁育是野生資源人工栽培研究、中藥材規(guī)范化種植及整個中藥產業(yè)發(fā)展的源頭。但目前重樓種苗繁育研究出現瓶頸，如何有效、快捷解決“源頭之困”已成為當務之急。茲就近年來重樓

種苗繁育技術方面的研究進行系統(tǒng)綜述，以期為中藥材重樓種苗繁育及人工栽培提供參考。

1 種子繁殖

1.1 種子休眠機理研究

重樓的種子產量較大，通過種子的有性繁殖是獲得大量種苗的有效方法。但重樓種子具有“二次休眠”的生理特性，出苗率極低，不足50.0%，大量種子在漫長的休眠期內喪失了生命力[2]，并且出苗不一致，生長不整齊。因此，研究重樓種子休眠的物質表現、引起休眠的原因及休眠過程中具有的變化等問題，對掌握重樓種子的休眠機理具有重要意義。

種子休眠是物種適應自然的一種生態(tài)策略，不同物種具有不同休眠機制。目前公認的種子休眠三大原因，包括種皮吸水障礙、胚休眠和萌發(fā)抑制物的存在。黃氏等[3]通過對滇重樓種子吸水特性的研究排除了種皮吸水障礙因素的存在；且該團隊將滇重樓種子的二次發(fā)育劃分為形態(tài)-生理后熟休眠類型，且存在胚休眠現象。重樓果實成熟時，種胚生長還停留在球形期[4-5]。

在植物的自然休眠過程中，內源激素是一個重要的影響因子。其中，脫落酸（ABA）和赤霉素（GA）是控制種子休眠與萌發(fā)的主要內源激素[6-7]。研究表明，最終重樓種胚的休眠解除是ABA減少與促萌物質GA3增加和積累的結果[3，8]。另外，滇重樓的外種皮對維持種子休眠也起著重要作用，種皮內存在一定活性的抑制物質[9]，對胚根生長具有明顯抑制作用[10-11]。自然條件下，生境中較長的低溫時期或許是導致重樓種子休眠時間較長的外界原因。

目前對重樓種子休眠原因的研究中排除了種皮吸水障礙這一因素，主要集中于胚休眠及存在萌發(fā)抑制物兩方面。其中滇重樓種子的發(fā)育程度其實與植株生長環(huán)境，如海拔、氣候、野生與否及果實采收時間等無關[12]，那么，是否可以推論其胚發(fā)育不完全或許是滇重樓的一種穩(wěn)定遺傳性狀，主要受基因控制。另外，從內源激素說方面主要考慮的是某種激素（如ABA、GA）含量的變化。然而，種子含有多種激素，可否推測并非某一種或兩種物質的變化，而是多種物質間存在著一種平衡，正是這種平衡關系抑制了種子的萌發(fā)，導致休眠時間較長。以上推測均有待進一步研究驗證。

1.2 休眠破解方法研究

重樓種子休眠程度高、萌發(fā)速率慢及萌發(fā)率低等客觀因素極大地限制了重樓人工栽培，造成種子繁殖一直未能在實際生產中得以廣泛應用，成為制約重樓依靠種子繁育種苗的一個重要瓶頸。因此，如何打破其種子休眠期，縮短后熟時間，提高種子的發(fā)芽率及出苗整齊率等是目前研究的一大難題。

目前，多數研究采集重樓果實之后均通過清水浸泡或與細沙混合的方式搓去外種皮[13-15]，并刺激內種皮以增加通透性，為子葉的脫殼創(chuàng)造有利條件[16]。研究表明，低溫沙藏有益于重樓種子催芽[17]，在4 ℃條件下采用干沙和濕沙層積后種子的萌動率可達65%，但仍不能萌發(fā)，而只是解除了形態(tài)學休眠[18]。變溫層積則可在3個月內打破重樓種子休眠[19]。在培養(yǎng)基中添加GA等植物激素對滇重樓種子休眠破除和種子的萌動萌發(fā)具有重要影響[20]，增加環(huán)境中GA/ABA值可縮短重樓種子萌發(fā)時間，增加出苗率[21]。基于以上研究，有學者綜合考慮溫度、層積與激素的協同作用，通過設置不同梯度組合，以期篩選出打破重樓種子休眠的最佳處理。如熊氏等[22]將重樓種子經4、40 ℃變溫處理，紅外光照射后再用硝酸鉀、GA3混合液保濕，休眠解除且萌發(fā)率達40.0%。去外種皮后利用4 ℃濕沙層積與GA的協同作用使種子萌發(fā)率達68.6%[19]。張氏等[23]將重樓種子細沙層積后經5、20 ℃二次交替變溫處理，用GA3浸泡后在20 ℃下催芽60 d可使發(fā)芽率達到90%以上。另外，楊氏等[24]初步建立了滇重樓種子無菌萌發(fā)胚根和胚芽培養(yǎng)體系，但對于用離體培養(yǎng)縮短其形態(tài)學和生理學后熟，用處于萌動狀態(tài)的種子育苗能否縮短種子育苗時間并提高出苗率，仍需進一步深入研究。

綜上所述，目前解除重樓種子休眠多采用變溫層積與激素處理相結合的方法。利用變溫層積打破種子形態(tài)學休眠，再利用激素處理解除生理休眠。變溫層積低溫多為4 ℃或5 ℃，催芽溫度為重樓種子萌發(fā)最適溫度20 ℃，而高溫處理具有較大差異，且變溫層積的處理時間亦不同，發(fā)芽率也存在顯著差異。總體而言，目前雖在萌發(fā)機制、休眠解除等方面取得了一些效果，但在如何更有效、快捷地解除重樓種子休眠、縮短種子萌發(fā)時間、提高萌發(fā)率與出苗整齊率等方面仍無突破性進展。筆者建議，今后可開展種子休眠基因的識別與定位、種子休眠相關基因的表達方式和遺傳方式等相關研究，通過分子生物學技術來破解休眠?？傊?，尋求有效而穩(wěn)定的重樓種子休眠解除方法仍任重而道遠。

2 根莖切段繁殖

根莖切段繁殖是迄今重樓生產最為常用的繁殖方式之一。該方法簡單易用，常年可種植，且可快速繁殖重樓種苗，又能縮短種植周期，新植株3年后即可采收根莖入藥[25]。目前，在實際生產中，根莖的切割研究已相對較為成熟。在切取根莖段時，研究者多以節(jié)為基礎進行切割，切口位于相鄰兩節(jié)的中部，切段傷口采用草木灰、生石灰或高錳酸鉀溶液處理[5，16]。

重樓根莖切段繁殖包括帶頂芽部位與不帶頂芽部位兩種。雖然兩者均可出苗，但帶頂芽好于不帶頂芽，其莖尖出苗率為79.3%，而中下部的出苗率僅10.7%[16]；帶頂芽切段根莖的生長量是不帶頂芽切段的1.5～2.5倍[26]；且?guī)ы斞壳卸我啾确N子繁殖好，其成苗率達98%以上[5]。李氏等[17]研究發(fā)現，帶頂芽切段于種植的翌年成苗，出苗率可達100%，并開花結實；而不帶頂芽切段第3年才萌發(fā)出土，出苗率為92%左右。經3年種植后，頂芽切段的根莖鮮重達42.3 g，而無頂芽的僅8.2 g。

以上研究表明，重樓根莖切塊繁殖技術已趨于成熟。但在實際大田種植時，由于土壤溫度與濕度無法控制，切段傷口愈合不理想，易感染菌類而致根莖潰爛，種質材料損失大；加之潛伏芽萌發(fā)時間長，萌發(fā)率較低，多芽同時萌發(fā)更少，導致總的繁殖系數降低，生產出的種苗質量亦不高?；蛟S外緣植物生長調節(jié)劑的使用對切段進行處理將取得更好的效果[27]。陳氏等[28]用不同濃度的GA3、6-芐氨基嘌呤（6-BA）、生根粉（ABT1）溶液處理重樓根莖切段，結果表明，用2 mg/L 6-BA和適宜濃度ABT1能提高根莖切段繁殖率，且2 mg/L 6-BA處理可顯著提高切段多芽率，ABT1能促進根狀莖切段不定根的產生，同時對潛伏芽的萌動亦具有顯著作用。

重樓根莖切塊繁殖是目前最為成功的繁殖方式，但根莖本是其藥用部位，利用根莖切塊生產種苗耗種量大，增加了生產成本。加之存在種苗退化、切面大而易感染病害、出苗不整齊等問題。因此，根莖切塊繁殖方法仍需進一步改進與完善。

3 組織培養(yǎng)繁殖

利用組織培養(yǎng)技術可在短時間內大量繁殖性狀優(yōu)良的幼苗，且不受地區(qū)、季節(jié)等因素限制，全年均可生產，是解決珍稀瀕危藥用植物資源的重要途徑之一，且已在多種藥用植物上取得成功[29-30]。鑒于組織培養(yǎng)途徑的優(yōu)越性，目前該技術已成為業(yè)界最為關注的用于突破重樓無性快繁瓶頸的方法之一。早在20世紀已有研究者試圖建立重樓的離體快繁體系，但至今尚未取得令人滿意的結果。

3.1 愈傷組織誘導

目前已對重樓不同器官進行愈傷組織誘導培養(yǎng)開展了研究，但結果不甚理想。李氏等[31-32]在篩選外植體時發(fā)現，重樓根、莖、葉片和花蕾不能誘導出愈傷組織，接種后極少啟動，約2個月后則干枯死亡；根莖、子房及幼芽能不同程度地誘導出愈傷組織，且幼芽誘導出的愈傷組織數最多，誘導頻率最高（26.7%），甚至誘導出小球莖。但由根莖誘導的愈傷組織質地較疏松，易纖維化，從而失去增殖能力；子房形成的愈傷組織也較疏松，易褐變。熊氏等[33]發(fā)現，種胚在胚乳看護培養(yǎng)的條件下能成功誘導出愈傷組織，比李氏等[31]以芽為材料的誘導率更高，且不受外植體取材時間的限制；但誘導出的愈傷組織偏緊密，不利于其快速繁殖；莖尖作為外植體時能誘導出愈傷組織，但生長緩慢，并且不含原植物中的皂苷。另外，外植體的不同取材時期對愈傷組織的誘導亦具有一定影響。研究顯示，以展葉期旺盛生長的根莖誘導頻率最高（16.6%），萌芽期次之；而在花冠露白期和倒苗期，根莖則很難誘導出愈傷組織[32]。

由此可見，利用組織培養(yǎng)來繁殖重樓種苗的難度很大，只有幼芽能成功誘導出植株，而莖尖的誘導雖能成功啟動，但效率較低，且不含皂苷成分。種胚、根莖和子房雖也可產生愈傷組織，但其增殖受到極大限制。目前關于采用重樓其他外植體成功組織培養(yǎng)的研究也鮮有報道。另外，愈傷組織增殖分化時間長、速率緩慢等問題也需進一步研究與解決。

3.2 無菌培養(yǎng)物建立

目前的重樓組織培養(yǎng)過程中污染問題嚴重，對實驗造成極大影響。其外因主要是在接種或培養(yǎng)過程中由于環(huán)境因素及操作不當而引起，該污染可通過對接種室、培養(yǎng)室環(huán)境消毒及加強人員無菌操作意識等加以避免；內因則是由外植體表面或內部帶菌所引起。由于內生真菌培養(yǎng)在初期未立刻顯現出來，在繼代過程中才不斷出現，污染材料，導致誘導率下降。鑒于此，今后研究需對外植體采取相應的消毒措施。

盡管早期研究以200 mg/L羧芐西林鈉和頭孢唑林鈉的抑菌效果最好，但目前常用0.5%消毒靈液、70%或75%酒精和0.1%氯化汞（HgCl2）進行消毒[34]。王氏等[35]將帶芽根莖用0.5%消毒靈液浸泡10 min，流水沖洗干凈并晾干后，在超凈工作臺上用70%酒精消毒30 s，再用0.1% HgCl2處理數分鐘后無菌水沖洗干凈，結果用HgCl2消毒8 min時，其污染率較低，為（11.97±0.91）%，啟動率高達（84.82±2.59）%。

3.3 培養(yǎng)基配方

組織培養(yǎng)技術中培養(yǎng)基篩選同樣至關重要。李氏等[31-32]發(fā)現，對莖尖啟動較好的培養(yǎng)基為植物基本培養(yǎng)基（MS）+2.0 mg/L激動素（KT）+2.0 mg/L吲哚乙酸（IAA）和MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L IAA，啟動率超過30%，且IAA比其他生長素（如吲哚丁酸等）更有利于外植體的啟動。幼芽在培養(yǎng)基MS+1.0 mg/L BA+1.0 mg/L KT+1.0 mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）+1.0 mg/L IAA上誘導愈傷組織的頻率較高，在MS+1.0 mg/L BA+2.0 mg/L IAA和MS+2.0 mg/L BA+1.0 mg/L IAA上還可誘導球莖的形成。研究表明，去芽鞘的芽外植體的最佳培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L IAA，誘導率高達57.0%[34]；其愈傷組織增殖最佳培養(yǎng)基配方為MS+0.5 mg/L 6-BA+1.0 mg/L萘乙酸（NAA）[36]。在胚乳看護下的種胚則以MS+2 mg/L IAA+0.02 mg/L 6-BA為誘導愈傷組織的最佳培養(yǎng)基，誘導率達53.3%[33]。

目前對重樓組織培養(yǎng)技術研究成功的報道甚少，較為成功的是楊氏等[36]首次在離體條件下實現了滇重樓的植株再生。該研究以芽為外植體，分別經愈傷組織誘導培養(yǎng)基、增殖分化培養(yǎng)基和生根培養(yǎng)基的培養(yǎng)，將根長為2～3 cm的芽移栽至腐殖土180 d左右形成完整植株，出土展葉成活率可達65%。但該研究尚存在愈傷組織增殖分化時間長的問題，其一個增殖周期需210～240 d。

生長素和細胞分裂素種類和配比對愈傷組織誘導效果的影響很大。以上研究生長調節(jié)劑的使用主要集中于6-BA、NAA、KT、IAA及2，4-D，但在培養(yǎng)基配方中的添加量存在差異，如6-BA差異最為顯著，同為愈傷組織誘導培養(yǎng)基，添加量在0.02～2.00 mg/L均有出現，這或許是因外植體的不同而相異。另外，總體而言愈傷組織誘導率并不高，增殖分化時間過長，均未達理想狀態(tài)。

總之，培養(yǎng)基的配方至今未有較為統(tǒng)一的模式，愈傷組織誘導、增殖分化及生根培養(yǎng)3種培養(yǎng)基的最佳配方仍需不斷摸索。

4 展望

鑒于重樓的藥用價值，其生產原料來源一直較為緊張，野外掠奪性采挖致生態(tài)環(huán)境被人為破壞，因此，急需大規(guī)模人工引種栽培。雖然重樓根莖切塊繁殖是目前最為常用和成熟的種苗繁殖方式，但耗種量大，生產成本高，且存在種苗退化等問題，因此，該方法仍需改進與完善。

重樓種子產量較大，種子繁殖系數大，是獲得大量種苗的有效方法，在對其萌發(fā)機制、休眠解除方面研究已取得一定進展，利用變溫層積與激素處理相結合的方法得到一定成效，但在如何更高效、快捷地解除種子繁育中的休眠、后熟時間、發(fā)芽率、出苗整齊率等方面仍需進一步研究。

重樓組織培養(yǎng)育苗研究進展緩慢，重樓自身的組織細胞脫分化能力較低、細胞分裂速度慢，同時在組培過程中還存在外植體選擇、消毒和培養(yǎng)基篩選等限制，使該技術還未能在實際生產中得到廣泛應用，今后需加大重樓組織培養(yǎng)育苗的研究力度。

總之，目前對重樓種苗繁育的研究雖已取得了初步成果，但總體而言，基礎研究尤其是應用基礎方面的研究尚不足，多手段、多渠道有效解決重樓繁殖問題仍需開展大量、更深入的研究，為重樓野生資源的保護、可持續(xù)開發(fā)利用，以及生產應用中原材料的供應提供有力保障。

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（收稿日期：2014-12-25）

（修回日期：2015-01-25；編輯：梅智勝）