影響冠突散囊菌孢子產(chǎn)生的因素

呂嘉櫪， 鄭欣欣， 李文娟， 張彪燕

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安　710021)

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影響冠突散囊菌孢子產(chǎn)生的因素

呂嘉櫪， 鄭欣欣， 李文娟， 張彪燕

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安710021)

摘要：為獲得各種條件下冠突散囊菌的產(chǎn)孢規(guī)律和最佳生長發(fā)育條件，以冠突散囊菌的菌落形態(tài)、菌落直徑、有性孢子和無性孢子的數(shù)量為指標(biāo)，通過改變CZG培養(yǎng)基中碳源(蔗糖、葡萄糖)、氮源(硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨)和無機鹽(氯化鈉 、氯化鉀)的濃度以及外界培養(yǎng)條件(培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基pH)以此得到最佳的培養(yǎng)參數(shù).結(jié)果表明：冠突散囊菌產(chǎn)孢的最佳條件為蔗糖5%、硝酸銨0.7%、KCl 3%、培養(yǎng)溫度28 ℃、pH=7，營養(yǎng)物質(zhì)和外界培養(yǎng)條件都會對冠突散囊菌的產(chǎn)孢過程造成影響，使冠突散囊菌向有性或無性方向生長.

關(guān)鍵詞：冠突散囊菌； 無性孢子； 有性孢子

0引言

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)是茯磚茶“發(fā)花”過程中優(yōu)勢菌[1-3]，在茯磚茶表面有大量肉

眼可見的金黃色顆粒，即為冠突散囊菌產(chǎn)生的閉囊殼，俗稱“金花”，它是形成茯磚茶獨特品質(zhì)和風(fēng)味的主要因素，也是評價茯磚茶品質(zhì)好壞的重要指標(biāo)[4-9],冠突散囊菌的繁殖方式既有無性生殖(分生孢子)，又有有性生殖(子囊孢子).

劉作易[10]等對冠突散囊菌孢子的產(chǎn)生條件進行研究，表明冠突散囊菌在不同蔗糖濃度下繁殖方法不同，低濃度的蔗糖有利于有性孢子的產(chǎn)生，高濃度的蔗糖有利于無性孢子的產(chǎn)生.目前對冠突散囊菌孢子的研究主要是利用DNA克隆技術(shù)研究冠突散囊菌中有性發(fā)育相關(guān)的veA基因片段[11-14]，通過基因水平上的研究，最終確定影響冠突散囊菌孢子產(chǎn)生的遺傳控制信息.譚玉梅[15]等以謝瓦氏曲霉間型變種的有性階段、無性階段及其營養(yǎng)菌絲體時期的樣品為材料構(gòu)建差減文庫，篩選產(chǎn)孢時期特異表達的基因，從而為進一步研究基因之間的關(guān)系、基因與發(fā)育的關(guān)系、產(chǎn)孢調(diào)控機制，但冠突散囊菌孢子的產(chǎn)生不僅受內(nèi)在的遺傳信息的控制，而且受營養(yǎng)物質(zhì)和外界環(huán)境因素的影響.

本研究以茯磚茶中的優(yōu)勢菌種為研究對象，通過綜合研究營養(yǎng)條件(碳源、氮源、無機鹽)和外界培養(yǎng)條件(溫度、pH)對冠突散囊菌產(chǎn)孢的影響，最終確定最佳的培養(yǎng)條件.

1材料與方法

1.1菌種

冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)：由陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院微生物教研室提供(陜西科技大學(xué)微生物研究室從陜西蒼山茶葉有限責(zé)任公司所產(chǎn)茯磚茶中分離純化得到).

1.2材料

1.2.1培養(yǎng)基

CZG培養(yǎng)基：蔗糖4.0 g，NaCl 5.0 g，K2HPO40.1 g，NH4NO30.3 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，瓊脂2.0 g，水100 mL ，于121 ℃、1×105Pa滅菌鍋中滅菌30 min.

1.2.2儀器與設(shè)備

B203LEDR生物顯微鏡(重慶奧特光學(xué)儀器有限公司)，101-1電熱恒溫培養(yǎng)箱型(北京科偉永興儀器有限公司)，SW-型超凈工作臺(蘇凈集團安泰公司)，UV-2600可見紫外分光光度計(尤尼柯儀器有限公司).

1.3實驗方法

1.3.1碳源對冠突散囊菌的影響

以蔗糖、葡萄糖分別為CZG培養(yǎng)基中的碳源，濃度分別為1%、3%、5%、7%、10%～90%，每個濃度梯度做三次平行實驗.

1.3.2氮源對冠突散囊菌的影響

以硝酸鈉、硝酸銨、硫酸銨分別為CZG培養(yǎng)基中的氮源，濃度分別為0.1%、0.3%、0.5%、1%～11%，每個濃度梯度做三次平行實驗.

1.3.3無機鹽對冠突散囊菌的影響

以氯化鈉和氯化鉀分別為CZG培養(yǎng)基中的無機鹽，濃度分別為1%～15%，每個濃度梯度做三次平行實驗.

1.3.4培養(yǎng)溫度對冠突散囊菌的影響

以CZG為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種冠突散囊菌后分別在15 ℃～40 ℃溫度下培養(yǎng)，每個溫度梯度做三次平行實驗.

1.3.5培養(yǎng)基pH對冠突散囊菌的影響

配制不同pH的CZG培養(yǎng)基，使冠突散囊菌分別在pH為3～10條件下生長，用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH.每個pH梯度做三次平行實驗.

1.3.6正交設(shè)計

通過單因素實驗確定碳源、氮源、無機鹽、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)基pH，選擇碳源、氮源、無機鹽、培養(yǎng)溫度進行正交試驗，篩選各因素最佳水平，設(shè)計L9(34)正交表考察各因素.

表1　正交試驗因素水平表

1.4測定方法

1.4.1冠突散囊菌菌落直徑的測量

冠突散囊菌在28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)到5 d時，用十字交叉法在培養(yǎng)皿上對冠突散囊菌菌落直徑進行測量，每處理三次重復(fù).

1.4.2冠突散囊菌孢子數(shù)的測定

冠突散囊菌有性的子囊孢子和無性的分生孢子在顯微鏡下難以區(qū)分，采用血球計數(shù)板計算孢子數(shù)量準(zhǔn)確性難以保證，因此采用棉蘭染色法制片，在顯微鏡10倍鏡下任意確定3個視野分別計數(shù)包裹子囊孢子的子囊果和代表無性孢子的頂囊數(shù)目，每處理三次重復(fù).

2結(jié)果與討論

2.1影響冠突散囊菌的單因素實驗

2.1.1碳源對冠突散囊菌的影響

圖1表明菌落直徑的總體趨勢是隨濃度先增大后減小，在濃度為30%時菌落直徑達最大值，在濃度為5%時存在一個小高峰.圖2表明有性孢子個數(shù)的變化趨勢同菌落直徑，無性孢子在濃度為20%時開始一直增加.通過對比蔗糖和葡萄糖對菌落直徑和孢子數(shù)的影響結(jié)果，確定實驗的碳源選擇蔗糖，在蔗糖濃度為5%和30%時，菌落直徑和有性孢子的個數(shù)都比相鄰的濃度大，但由于蔗糖濃度在30%處已經(jīng)有無性孢子產(chǎn)生，所以蔗糖濃度選為5%.

圖1　碳源對冠突散囊菌菌落直徑的影響

圖2　碳源對冠突散囊菌孢子數(shù)的影響

2.1.2氮源對冠突散囊菌的影響

圖3表明硝酸銨和硫酸銨濃度在5%以上時冠突散囊菌不能生長，只有在硝酸鈉的培養(yǎng)基上可以正常生長.菌落直徑趨勢總體是先增大后減小，在濃度為3%處達到最大值，在0.5%處有小轉(zhuǎn)折，而圖4中有性孢子個數(shù)也是先增大后減小，在氮源濃度為1.0%時硝酸銨有性孢子個數(shù)最高，且在0.5%時菌落直徑和有性孢子達到最大，且未出現(xiàn)無性孢子，所以硝酸銨濃度選在0.5%.

圖3　氮源對冠突散囊菌菌落直徑的影響

圖4　氮源對冠突散囊菌孢子數(shù)的影響

2.1.3無機鹽對冠突散囊菌的影響

圖5表明菌落直徑隨鹽濃度先增大后減小，在鹽濃度為3%時菌落直徑達最大值，圖6表明，有性孢子的個數(shù)隨濃度先增大后減小，且在3%時有性孢子數(shù)量最多.而無性孢子則是從達到4%開始一直增加.由圖可知氯化鉀優(yōu)于氯化鈉，所以實驗的鹽離子選擇氯化鉀，另外，在氯化鉀濃度為3%時，菌落直徑和有性孢子的個數(shù)都是最大值，而且在此濃度時無性孢子的個數(shù)為0，因此確定出氯化鉀的濃度為3%.

圖5　鹽離子對冠突散囊菌菌落直徑的影響

圖6　鹽離子對冠突散囊菌孢子數(shù)的影響

2.1.4培養(yǎng)溫度對冠突散囊菌的影響

圖7表明冠突散囊菌菌落直徑隨溫度先增大后減小，在28 ℃時菌落直徑最大，冠突散囊菌在極低極高溫度下生長能力都降低，圖8表明冠突散囊菌有性孢子個數(shù)隨溫度先增大后減小，在28 ℃時有性孢子密集，培養(yǎng)溫度達到30 ℃開始產(chǎn)生無性孢子，無性孢子隨溫度升高先增大后減小.表明冠突散囊菌在低溫下易產(chǎn)生有性孢子，而在高溫下易產(chǎn)生無性孢子.

圖7　溫度對冠突散囊菌菌落直徑的影響

圖8　溫度對冠突散囊菌孢子數(shù)的影響

2.1.5培養(yǎng)基pH對冠突散囊菌的影響

圖9表明冠突散囊菌菌落直徑隨培養(yǎng)基pH增大呈先增大后減小的趨勢.冠突散囊菌可以在偏酸性條件下生長，當(dāng)培養(yǎng)基pH達到10時冠突散囊菌不生長.圖10表明有性孢子隨pH增大呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，無性孢子呈先減小后增大的趨勢，有性孢子和無性孢子在pH為7時達到極值.并且冠突散囊菌在極酸極堿條件下都易產(chǎn)生無性孢子.

圖9　pH對冠突散囊菌菌落直徑的影響

圖10　pH對冠突散囊菌孢子數(shù)的影響

2.2冠突散囊菌的正交試驗

表2　正交試驗設(shè)計及結(jié)果分析

根據(jù)極差R的大小，進行因素的主次排列.

當(dāng)以有性孢子個數(shù)為指標(biāo)時，由R值主次排列為：溫度>蔗糖>硝酸銨>氯化鉀，因此最佳的水平組合為A1B2C2D2.當(dāng)以菌落直徑為指標(biāo)時，由R值主次排列為：溫度>蔗糖>硝酸銨>氯化鉀，確定最佳水平組合為A1B2C3D2.

當(dāng)以無性孢子個數(shù)為指標(biāo)時，由R值主次排列為蔗糖>氯化鉀>硝酸銨>溫度，確定最佳水平組合為A1B2C1D1.

綜上所述，確定最佳溫度為28 ℃，碳源選2水平時三個指標(biāo)同時達到極值，當(dāng)?shù)催x擇2水平時有性孢子最多，但相應(yīng)的無性孢子也增多，同時考慮氮源對菌落直徑的影響，因此氮源濃度選擇3水平，鹽離子選擇1水平時三個指標(biāo)同時達到極值.因此，本試驗的最佳水平組合為A1B2C3D2.

正交試驗結(jié)果表明：冠突散囊菌的最佳產(chǎn)孢條件為：氯化鉀1%、蔗糖5%、硝酸銨0.7%、培養(yǎng)溫度為28 ℃、培養(yǎng)基pH為7.

3結(jié)論

冠突散囊菌對營養(yǎng)物質(zhì)和外界培養(yǎng)條件都很敏感，冠突散囊菌隨無機鹽、碳源、氮源等濃度的增加,有性孢子個數(shù)和菌落直徑都是先增大后減小，而無性孢子隨濃度增加呈上升趨勢.營養(yǎng)物質(zhì)大于冠突散囊菌的自身需求時容易產(chǎn)生無性孢子.冠突散囊菌隨培養(yǎng)溫度升高有性孢子個數(shù)先增大后減小，無性孢子卻呈增長趨勢，在正常pH條件下能夠產(chǎn)生大量有性孢子，而在極酸極堿條件下卻易產(chǎn)生無性孢子.表明冠突散囊菌在外界培養(yǎng)條件為極溫、極酸極堿等不適宜生長時容易產(chǎn)生無性孢子，從而達到抵抗外界極性條件的目的.

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Factors of affectingEurotiumcristatumspores

LV Jia-li， ZHENG Xin-xin， LI Wen-juan， ZHANG Biao-yan

(School of Food and Biological Engineering, Shaanxi University of Science & Technology, Xi′an 710021, China)

Abstract:In order to obtain the spores production rule and optimal growth condition during growth process of Eurotium cristatum,taking colony morphology,sexual spores and asexual spores of Eurotium cristatum as indicators in this study,nutrients (carbon,nitrogen,inorganic salts) and culture conditions (temperature,pH)have an effect on the Eurotium cristatum which produced spores.The results showed that the Eurotium cristatum produced spores with optimum conditions:5% of sucrose,0.7% of ammonium nitrate,3% of KCl,the culture temperature was 28 ℃ and the pH value was 7.It was important that nutrients and external culture conditions impacted on Eurotium cristatum produced spores and maked the Eurotium cristatum to grow in the direction of sexual or asexual.

Key words:Eurotium cristatum； asexual spore； sexual spore

中圖分類號：Q93-335

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-5811(2015)02-0116-05

作者簡介:呂嘉櫪(1964-)，女，陜西三原人，教授，研究方向：食品與生物發(fā)酵

基金項目：陜西省教育廳專項科研計劃項目(2010JK446)； 咸陽市科技計劃項目(2013K06-09)

收稿日期:*2014-12-05