HPLC法同時(shí)測(cè)定蟾酥藥材中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量

HPLC法同時(shí)測(cè)定蟾酥藥材中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量

陳婷

(南京市中醫(yī)院，南京210001)

摘要：目的建立同時(shí)測(cè)定蟾酥藥材中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的高效液相色譜方法。方法以Boston Green ODS C18為分析色譜柱，乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液(含0.02 mol·L-1磷酸二氫鈉)(60∶40)等度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為 296 nm，柱溫為 35 ℃作為色譜條件。結(jié)果華蟾酥毒基和酯蟾毒配基線性良好，各項(xiàng)方法學(xué)參數(shù)都達(dá)到定量要求，回收率分別為98.92%和99.04%，36 h內(nèi)樣品穩(wěn)定性良好。結(jié)論該方法準(zhǔn)確，操作較為簡(jiǎn)便易行，可用于蟾酥藥材的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：蟾酥；華蟾酥毒基；酯蟾毒配基；HPLC

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.010

中圖分類號(hào)：R282文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

收稿日期：(2015-04-18)

Simultaneous determination of pureonebio and recibufogenin inBufonisvenenumby HPLC

CHEN Ting(Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine， Nanjing 210001， China)

Abstract:ObjectiveTo establish an HPLC method for simultaneously determining the contents of pureonebio and recibufogenin in Bufonis venenum. MethodsHPLC system consisted of Boston Green ODS C18 column，acetonitrile-water solution with-2 mL·L-1 phosphoric acid (60∶40) (0.02 mol·L-1 sodium dihydrogen phosphate ) as mobile phase. UV detection wavelength was set at 296 nm and column temperature was maintained at 35 ℃.ResultsPureonebio and recibufogenin showed good linearity within the tested concentration scope. The method was validated and the recoveries of pureonebio and recibufogenin were 98.9% and 99.0%， respectively. The samples were stable within 36 h. ConclusionThis method is simple， accurate and reproducible， and can be used for the quality control for Bufonis venenum.

Key words:Bufonisvenenum；pureonebio；recibufogenin；HPLC

蟾酥(Bufonisvenenum)為蟾蜍科動(dòng)物大蟾蜍或黑眶蟾蜍的干燥分泌物，扁圓形團(tuán)塊狀或片狀，呈紅褐色或紅棕色[1]。中醫(yī)認(rèn)為，其味甘、辛，性溫，有毒，主治小兒疳疾、腦疳、背部疔瘡及一切腫毒。除此之外，還有強(qiáng)心和止痛等作用[2]。其在臨床上被廣泛應(yīng)用于治療多種癌癥、結(jié)核病、心臟病、惡性血液病、頑固性呃逆、周期性面部神經(jīng)麻痹、急性咽炎和慢性乙肝等，還可以用于局部麻醉[3]。

蟾蜍漿液即蟾酥中的苷元，都是有強(qiáng)烈藥理作用的甾族，不少無(wú)藥理作用的甾族和尚含有一定藥理作用的吲哚系堿類成分。主要涉及:①蟾蛛毒素類，包括蟾毒、蟾毒配基脂肪酸酯和蟾毒配基硫酸酯等；②蟾毒配基類，是蟾蛛毒素在加工炮制過(guò)程中的分解產(chǎn)物，如酯蟾毒配基、華蟾毒精等[4-5]。

隨著蟾酥的適用范圍和使用手段日趨增長(zhǎng)，對(duì)其藥材的質(zhì)量控制和檢測(cè)方法需要不斷地發(fā)展和提高[6]。因此，筆者收集到市場(chǎng)上的蟾酥樣品，通過(guò)建立和優(yōu)化HPLC檢測(cè)手段，考察蟾酥樣品的質(zhì)量狀況，為今后質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高和方法更新提供一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1儀器與試藥

1.1儀器Waters e2695高效液相色譜儀， 配Waters 2998檢測(cè)器(美國(guó)Waters 公司)；Mettler ToledoXS105型電子分析天平(瑞士Mettler 公司)；超聲波發(fā)生器(天津市恒奧科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))；Thermo Biofuge Primo R 低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Thermo公司)；Milli-Q 超純水處理系統(tǒng)。

1.2試藥蟾酥樣品共10批次取樣于江蘇境內(nèi)，均經(jīng)南京市中醫(yī)院藥劑科鑒定為藥典收載品種；華蟾酥毒基(批號(hào)110803-201406，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.6%)和酯蟾毒配基(批號(hào)110718-201108，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.9%)對(duì)照品，均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，達(dá)到定量分析的要求。實(shí)驗(yàn)所用甲醇、乙腈為色譜純(德國(guó)Merck公司)；磷酸、磷酸二氫鈉為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件Boston Green ODS C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm， 5 μm)；流動(dòng)相為乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液(含0.02 mol·L-1磷酸二氫鈉60∶40)，等濃度洗脫；流速為1 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為296 nm。在此條件下，各色譜峰間分離度均達(dá)到定量要求，見(jiàn)圖1。

圖1 HPLC圖

A. 對(duì)照品；B. 蟾酥樣品；C. 空白對(duì)照；1. 華蟾酥毒基；2. 酯蟾毒配基

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference substances； B.sample； C.blank sample；1.pureonebio； 2.recibufogenin

2.2溶液制備對(duì)照品溶液的制備:取華蟾酥毒基和酯蟾毒配基約10 mg，精密稱定，置于25 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為單一對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取各單一對(duì)照品儲(chǔ)備液1 mL，置于25 mL量瓶中，用甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，備用。

供試品溶液的制備:參照《中國(guó)藥典》2010年版一部蟾酥藥材含量測(cè)定項(xiàng)下方法，取10批蟾酥樣品，量取各樣品約25 mg，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，稱定質(zhì)量，加入甲醇20 mL，超聲提取30 min，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量， 搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液，進(jìn)樣前用0.45 μm濾膜濾過(guò)。

2.3線性關(guān)系取2.2項(xiàng)下對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋成一系列質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，進(jìn)樣分析，以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。華蟾酥毒基的回歸方程為:Y=7.463X-7.112(r=0.999 9)，線性范圍為1.446～361.5 μg·mL-1；酯蟾毒配基的回歸方程為:Y=6.226X-4.192(r=0.999 8)，線性范圍為1.226～306.5 μg·mL-1。結(jié)果顯示,華蟾酥毒基和酯蟾毒配基在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。

2.4檢測(cè)限與定量限將對(duì)照品溶液不斷稀釋后制得一系列不同質(zhì)量濃度的溶液，進(jìn)樣分析后，以信噪比 S/N=3作為檢出限， S/N=10作為定量限。華蟾酥毒基的檢測(cè)限和定量限分別為0.482和1.446 μg·mL-1；酯蟾毒配基的檢測(cè)限和定量限分別為0.409和1.226 μg·mL-1。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn)取任一質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，以各針色譜峰的峰面積值計(jì)算 RSD，結(jié)果表明，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的精密度RSD分別為0.99%和1.02%，均小于2.0%，精密度良好。

2.6回收率實(shí)驗(yàn)量取同一批蟾酥粉末6份，每份約12.5 mg(華蟾酥毒基含量約為28 mg·g-1；酯蟾毒配基含量約為15 mg·g-1)，精密稱定，按照各自含量的80%精密加入混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按照2.2供試品溶液的制備項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算平均回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的平均加樣回收率為98.92%和99.04%，RSD低于 3%，該方法準(zhǔn)確度好，回收率達(dá)到定量要求。

表1樣品回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 The results of recoveries tests

成分編號(hào)稱樣量/mg原有量/mg·g-1加入量/mg·g-1測(cè)得量/mg·g-1回收率/%平均回收率/%RSD/%華蟾酥毒基112.4432326.01269.78588.4098.7698.920.79212.4432238.29190.82427.8699.71312.4800325.23269.78594.5999.93412.4800238.87190.82421.2298.03512.5003330.38269.78592.7298.76612.5003240.26190.82430.9599.97酯蟾毒配基112.4432238.29190.82427.8699.7199.040.82212.4432325.23269.78594.5999.93312.4800238.87190.82421.2298.03412.4800330.38269.78592.7298.76512.5003240.26190.82430.9599.97612.5003325.82269.78586.8498.53

2.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)量取同一批蟾酥粉末6份，每份約20 mg，精密稱定，按照2.2項(xiàng)下供試品溶液的制備方法進(jìn)行操作，進(jìn)樣測(cè)定。計(jì)算RSD。結(jié)果表明，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的RSD分別為1.43%和0.92%，重復(fù)性良好。

2.8穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一批蟾酥粉末約20 mg，精密稱定，按照2.2供試品溶液的制備項(xiàng)下方法進(jìn)行操作，分別在0，1，2，4，8，12，24和36 h進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果表明，在36 h內(nèi)，華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的RSD小于1.32%，基本穩(wěn)定，不影響定量檢測(cè)。

2.9樣品測(cè)定取10個(gè)批次的蟾酥藥材樣品，按照2.2供試品溶液的制備項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，并且按照2.1色譜條件項(xiàng)下高效液相色譜方法檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2，其中10批樣品的華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的總量均高于6.0%，達(dá)到《中國(guó)藥典》2010年版一部相關(guān)項(xiàng)下的含量要求。

表2蟾酥樣品中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的含量結(jié)果

Tab.2 The content results of pureonebio and recibufogenin inBufonisvenenum

( n=10)

3討論

蟾酥作為毒性藥材，并且鑒于其獨(dú)特的功效特點(diǎn)，多年來(lái)一直在臨床上不斷地發(fā)揮著重要的治療效果[7-8]。隨著社會(huì)生態(tài)的變化以及對(duì)于蟾蜍科動(dòng)物的捕殺，該藥材的來(lái)源越來(lái)越局限，質(zhì)量也在逐年下降。因此，針對(duì)市場(chǎng)對(duì)蟾酥的需求，不時(shí)的對(duì)市場(chǎng)中蟾酥藥材進(jìn)行質(zhì)量檢查，并對(duì)檢測(cè)方法的要求提高，都是需要不斷完善和反復(fù)驗(yàn)證的必經(jīng)步驟。

本實(shí)驗(yàn)基于《中國(guó)藥典》2010年版一部[9]相關(guān)方法，建立了同時(shí)測(cè)定蟾酥中2種主要成分華蟾酥毒基和酯蟾毒配基的方法。同時(shí)對(duì)色譜條件和提取方法也進(jìn)行了必要的優(yōu)化。

筆者考察了《中國(guó)藥典》2010年版一部中乙腈-5 mL·L-1磷酸二氫鉀溶液(50∶50)(用磷酸調(diào)節(jié)pH值為3.2)的流動(dòng)相；并且與乙腈-2 mL·L-1磷酸水溶液(含0.02 mol·L-1磷酸二氫鈉)(60∶40)進(jìn)行比較。結(jié)果表明，后者色譜峰峰形好，達(dá)到理想的分離度，配制較為簡(jiǎn)單，省去了調(diào)節(jié)pH的步驟，降低了人為實(shí)驗(yàn)誤差。

筆者考察了《中國(guó)藥典》2010年版一部中的回流提取方法，并且與超聲提取方法相比較。綜合考慮2種方法的穩(wěn)定性、方便性和提取效率，最終選擇甲醇超聲30 min作為本實(shí)驗(yàn)的提取方法。該方法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，并且不影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確度。

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