大孔吸附樹脂分離純化苦豆草總生物堿的工藝研究

大孔吸附樹脂分離純化苦豆草總生物堿的工藝研究

王秀芬，冷曉紅，郭鴻雁

(寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，銀川750021)

摘要：目的 采用大孔樹脂分離純化苦豆草總生物堿，優(yōu)選最佳工藝條件。方法以苦豆草總生物堿的吸附量及解吸率為評價指標(biāo)，比較DF01、D101等8種型號大孔樹脂對苦豆草總生物堿的分離純化性能，選出最佳樹脂并優(yōu)選純化工藝。結(jié)果D101型大孔樹脂對苦豆草總生物堿具有較好的吸附分離性能，在實驗條件下對苦豆草總生物堿的吸附量和解吸率可達到9.2 mg·mL-1和90%以上。結(jié)論該優(yōu)選工藝可為苦豆草總生物堿純化的產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：苦豆草；總生物堿；大孔吸附樹脂；純化

doi:10.3969/j.issn.1004-2407.2015.06.005

中圖分類號：R284文獻標(biāo)志碼：A

基金項目：科技部國家支撐項目(編號：2011BA105B04)

收稿日期：(2015-03-10)

Study on the total alkaloids separation and purification fromSophoraalopecuroidesL. using macroporous resin

WANG Xiufen，LENG Xiaohong，GUO Hongyan(Ningxia Polytechnic Vocational College， Yinchuan 750021，China)

Abstract:ObjectiveTo find out the suitable process conditions for separation and purification of total alkaloids of Sophora alopecuroides L. by using macroporous resin. MethodsThe separation and purification performance of 8 types of macroporous resins，such as DF01 and D101 was compared.The adsorption capacity and desorption rate of the total alkaloids of Sophora alopecuroides L.，were used as an evaluation index. ResultsUnder the experimental conditions，the separation and adsorption performance of D101 was better than other types of macroporous resins，for which the adsorption capacity and desorption rate of the total alkaloids was reached to 9.2 mg·mL-1 and more than 90%, respectively. ConclusionThis result provides the basis for the industrial purification of the total alkaloids from Sophora alopecuroidesL.

Key words:SophoraalopecuroidesL.；total alkaloids；macroporous adsorption resin；purification

苦豆草為豆科槐屬植物苦豆子SophoraalopecuroidesL.的干燥地上部分，是西北地區(qū)道地的沙生植物，具有清熱利濕、抗菌消炎的作用[1]?？喽共菘偵飰A含20多種單體，其中主要含有槐定堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、苦參堿、槐果堿和苦豆堿[2]，具有鎮(zhèn)靜、抗心律失常、抑菌、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用。各類苦豆子生物堿制劑如婦炎栓、苦參素膠囊、苦參素注射液和苦豆子總堿直腸栓已應(yīng)用于臨床。藥理學(xué)研究表明，苦豆子中多種已經(jīng)確定的療效作用仍有較大發(fā)展空間[3]，尤其是其中所含的苦參堿和槐定堿具有顯著的抗癌作用[4-5]。因此，分離純化苦豆草總生物堿具有重要意義。

有機溶劑萃取法是生物堿類純化的經(jīng)典技術(shù)，但溶劑萃取法所用提取溶劑多為甲苯、氯仿等有機溶劑，生產(chǎn)中防護不當(dāng)會危害人體健康、造成環(huán)境污染，且在苦豆草總生物堿中存在有機溶劑殘留。大孔樹脂吸附分離技術(shù)具有吸附快、解吸易、對環(huán)境無污染等優(yōu)勢，已被廣泛用于中草藥有效成分的分離純化[6-7]。本實驗通過比較不同型號大孔樹脂對苦豆草總生物堿的分離純化，篩選出最佳大孔樹脂，采用乙醇-水(30∶70)和(70∶30)的配比梯度洗脫液進行洗脫，中試生產(chǎn)采用三柱并聯(lián)，實現(xiàn)中試規(guī)模單次上樣量1 000 L，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1儀器與試藥

1.1儀器TU1810型紫外分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；1220型高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；GZX-9030MBE型恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司)；FA214型電子天平(上海海恒機電儀表有限公司)；LD-S-101型低速離心機(北京時代北利離心機有限公司)；SHL-30型水浴振蕩器(北京億安天成科技有限公司)。

1.2試藥苦參堿、氧化苦參堿、氧化槐果堿、槐定堿對照品購于中國藥品生物制品檢定研究院；槐果堿、苦豆堿購于寧夏紫荊花藥業(yè)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%；苦豆草提取液(實驗室采用酶解后酸水提取[8]，相對密度1.0～1.1)；甲醇、乙腈為色譜純；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.3材料實驗級D101樹脂(上海天蓮樹脂有限公司)；實驗級AB-8樹脂(上海天蓮樹脂有限公司)；實驗級樹脂DF01、NKA-12、DA301、BS-67-3、D2026、X-5(蚌埠市遼源樹脂生物科技有限公司)。

2方法與結(jié)果

2.1分析測定方法

2.1.1苦豆草總生物堿含量測定(采用紫外分光光度法)苦豆草總生物堿中槐定堿的含量最高，參考相關(guān)文獻[9]，采用溴麝香草酚藍比色法以槐定堿為指標(biāo)成分測定苦豆草中總生物堿含量。

2.1.1.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作稱取槐定堿對照品5 mg，精密稱定，置于5 mL量瓶中，加無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻即得。吸取槐定堿標(biāo)準(zhǔn)溶液0,10,20,30,40,50,60,70,80,90和100 μL，分別置于25 mL的磨口錐形瓶中，揮盡乙醇，加溴麝香草酚藍pH 7.6緩沖液6.00 mL、三氯甲烷6.00 mL，密塞，劇烈振搖2 min提取，靜置2 h，分出三氯甲烷層，以未加槐定堿標(biāo)準(zhǔn)溶液管為空白，于410 nm處測定提取液的吸光度，以三氯甲烷提取液質(zhì)量濃度C對吸光度A進行回歸，得回歸方程：A=0.013 3C-0.013 4，r=0.999 6。

2.1.1.2樣品含量測定精密吸取苦豆草提取液1 mL，加無水乙醇溶解并定容至10 mL，吸取0.2 mL置于25 mL的磨口錐形瓶中，揮盡乙醇，加溴麝香草酚藍pH 7.6緩沖液6.0 mL、三氯甲烷6.0 mL，密塞，劇烈振搖2 min,提取，靜置2 h，分出三氯甲烷層，以對應(yīng)的提取溶劑1 mL加溴麝香草酚藍pH 7.6緩沖液6.0 mL和三氯甲烷6.0 mL同比操作，為空白液，于410 nm處測定提取液的吸光度A，從制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得相應(yīng)的生物堿質(zhì)量濃度，并計算苦豆草總生物堿的含量(以槐定堿計)。

2.2樹脂篩選

2.2.1實驗器材樹脂柱：Φ1.5×30 cm玻璃柱8根(定制);吸附液：苦豆草酸水提取濃縮液，按照紫外分光光度法測總生物堿的含量3.46 mg·mL-1(以槐定堿計)，用50 g·L-1的氫氧化鈉溶液調(diào)成堿性(pH約為9)，4 500r·min-1離心分離，去沉淀，取上清液，再次采用紫外分光光度法測總生物堿含量3.28 mg·mL-1(以槐定堿計);洗脫液：體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇。

2.2.2實驗過程提取液→通過大孔樹脂吸附→解吸→收集洗脫液→回收洗脫劑→藥液

2.2.2.1大孔吸附樹脂的預(yù)處理大孔樹脂分別用乙醇浸泡24 h以上，使其充分溶脹，用乙醇洗至洗脫液與水混合(1∶2)不呈白色渾濁為止，再用純化水洗至無醇味，20 mL·L-1的鹽酸溶液浸泡3 h，水洗至中性，50 g·L-1的氫氧化鈉溶液浸泡3 h，水洗至中性，備用。

2.2.2.2 吸附將充分溶脹的8種樹脂，各量取15 mL，分別裝入8根玻璃柱中，分別取吸附液100 mL，以平均5 BV·h-1的流速通過吸附液。對各柱流出液分別取樣，以備測定。

2.2.2.3解吸取6倍樹脂柱體積的洗脫液，以平均1 BV·h-1的流速，解吸8根吸附量確定的樹脂柱。對解吸液分別取樣，以備測定。

2.2.3實驗結(jié)果采用紫外分光光度法測定各樣品吸附流出液和解吸流出液的苦豆草總生物堿含量，各柱吸附流出液和解吸流出液均為等量。計算公式如下：

吸附量(mg·mL-1)=(吸附液質(zhì)量濃度-流出液質(zhì)量濃度)×吸附液體積/濕樹脂體積(mL)

解吸率=解吸出總生物堿量/吸附總生物堿量×100%

實驗結(jié)果見表1。

表1樹脂篩選

Tab.1 Resin screening

樹脂粒徑/mm比表面/m2·g-1孔徑/nm吸附量/mg·mL-1洗脫量/mg解吸率/%DF010.3～10.00400～420130～1408.33113.2690.61AB-80.3～1.25480～520130～1409.01124.7992.32NKA-120.3～1.00570～590150～1567.21100.8693.31D1010.3～1.25500～55090～1009.20128.3493.09DA3010.3～1.2530～35100～1207.86108.0991.70BS-67-30.3～1.00400～450130～1408.92120.4489.99D20260.3～1.2040～5090～1109.13123.2789.33X-50.3～1.25500～600290～3008.59119.2892.56

從表1可以看出，取相同吸附液量，采用動態(tài)吸附，D101大孔樹脂吸附量與解吸率最強，樹脂的性能良好。因此選用D101型大孔吸附樹脂分離純化苦豆草總生物堿。

2.3吸附條件優(yōu)化

2.3.1動態(tài)吸附最大上樣量考察量取經(jīng)預(yù)處理的D101樹脂15 mL，裝入玻璃柱中，取苦豆草酸水提取吸附液(生物堿含量3.28 mg·mL-1，以槐定堿計)，以平均5 BV·h-1的流速，樹脂柱自上而下通過吸附液，收集流出液，每15 mL收集1份，測定其苦豆草總生物堿含量。實驗結(jié)果表明，當(dāng)吸附液體積達4 BV時，流出液中出現(xiàn)少量苦豆草總生物堿，開始泄露；吸附液至5 BV時，流出液中苦豆草總生物堿含量逐步增大，泄露明顯，吸附接近泄露點；當(dāng)上樣達到10 BV時，流出液中苦豆草總生物堿含量增加不明顯，吸附達到飽和。考慮到生產(chǎn)工藝中要避免造成總生物堿的泄漏，確定使用單柱吸附時，苦豆草酸水提取吸附液(生物堿含量3.28 mg·mL-1，以槐定堿計)最大上樣量為5 BV，使用串聯(lián)樹脂柱吸附時，苦豆草酸水提取吸附液(生物堿含量3.28 mg·mL-1,以槐定堿計)最大上樣量為10 BV。

2.3.2徑高比的考察取4根玻璃柱分別按徑高比1∶5，1∶6，1∶7和1∶8濕法裝入D101大孔吸附樹脂，分別加入苦豆草酸水提取吸附液(生物堿含量3.28 mg·mL-1，以槐定堿計)100 mL，預(yù)吸附1 h，流速為5 BV·h-1，吸附完畢后，用100 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇洗脫，流速為1 BV·h-1。依次吸取流出液和洗脫液，采用紫外分光光度法測定苦豆草總生物堿的含量，并計算吸附量及解吸率。實驗結(jié)果見表2。

表2徑高比的考察

Tab.2 Investigation of the column diameter ratio

徑高比吸附量/mg·mL-1洗脫量/mg·mL-1解吸率/%1∶59.848.6587.881∶610.128.9488.261∶710.639.4188.541∶810.929.9791.26

從表2可以看出，從吸附量和解吸率綜合考慮，選擇1∶8徑高比濕法裝柱效果最佳。

2.3.3吸附液質(zhì)量濃度對吸附的影響取處理好的D101樹脂15 mL，濕法裝柱。分別取實驗室制備的吸附液(總生物堿含量3.28 mg·mL-1,以槐定堿計)25，50，75和100 mL，加水定容至100 mL，搖勻，以平均5 BV·h-1的流速，自上而下分別通過4根吸附柱，收集流出液，吸附3 h后，用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗脫，收集洗脫液，測定流出液和洗脫液中苦豆草總生物堿的含量(以槐定堿計)，實驗結(jié)果見表3。

表3吸附液質(zhì)量濃度對吸附的影響

Tab.3 Effects of the adsorption concentration on adsorption behovior

上樣液質(zhì)量濃度/mg·mL-1吸附量/mg·mL-1解吸率/%0.822.9688.411.646.2880.242.467.8682.453.289.3292.14

從表3可以確定，上樣液質(zhì)量濃度為3.28 mg·mL-1(以槐定堿計)即1 mL相當(dāng)于原生藥0.23 g。

2.3.4吸附液pH值對吸附量的影響取苦豆草酸水提取吸附液(生物堿含量3.28 mg·mL-1，以槐定堿計)，采用碘化鉍鉀試液鑒別生物堿，當(dāng)流出液中出現(xiàn)顯色反應(yīng)，停止通液。檢測各柱流出液量與質(zhì)量濃度，計算吸附量。結(jié)果以吸附液pH為9.0時吸附效果最好。

2.4解吸條件優(yōu)化為減少產(chǎn)品的有害溶劑殘留，從常用的洗脫劑中選擇乙醇與水為洗脫劑。

2.4.1不同pH值乙醇-水(70∶30)的解吸效果將8等份乙醇-水(70∶30)洗脫液分別調(diào)pH值為3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0和10.0，分別洗脫吸附飽和的等量樹脂，流速均為1.0 BV·h-1。結(jié)果采用乙醇-水(70∶30)pH為9.0的洗脫液進行解吸，效果最好。

2.4.2洗脫液用量量取經(jīng)過預(yù)處理的D101樹脂15 mL，裝入玻璃柱中，取苦豆草酸水提取吸附液(生物堿含量3.28 mg·mL-1,以槐定堿計)，按最大上樣體積為樹脂量的5倍上柱，吸附流速為5 BV·h-1，洗脫用體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇、pH為9.0的洗脫液進行解吸，分段收集洗脫液，每1 BV為一份，測定苦豆草總生物堿的含量。實驗結(jié)果表明，洗脫液用量為柱體積的6倍時基本洗脫完全，為簡化工藝流程，降低成本，采用6倍柱體積的洗脫液進行洗脫。

2.4.3不同乙醇-水配比梯度洗脫的解吸效果由于苦豆草總生物堿中含有多種單體生物堿，極性強的生物堿在低濃度洗脫量高，非極性生物堿在高濃度洗脫量高，為洗脫完全，實驗中采用不同乙醇-水配比進行梯度洗脫。如表4中所標(biāo)識不同乙醇-水配比洗脫液，調(diào)節(jié)pH為9.0，流速為1.0 BV·h-1，分別梯度洗脫吸附飽和的等量樹脂。實驗結(jié)果如表4所示。

表4不同乙醇-水配比梯度洗脫的解吸率

Tab.4 Different ethanol-water ratio gradient elution rate of desorption

序號吸附總堿量/mg乙醇-水洗脫液用量/BV洗脫總堿/mg合計/mg解吸率/%113870∶306.0123.65118.6585.923413813813830∶7050∶5070∶3090∶1020∶8040∶6060∶4080∶2030∶7070∶301.51.51.51.51.51.51.51.53.03.029.6035.3048.0321.9024.6040.2040.9029.5449.1084.76134.83133.24133.8697.796.697.0

結(jié)果如表4所示，第1組單純使用乙醇-水(70∶30)的洗脫液，解吸率為85.9%，不能洗脫完全；第2,3和4組采用不同乙醇-水配比梯度洗脫，解吸率高于第1組10%以上；其中第2組的解吸率最高，但生產(chǎn)工藝比較復(fù)雜；第4組解吸率較第2組稍低，但工藝簡單，便于操作，工業(yè)蒸發(fā)回收的乙醇體積分?jǐn)?shù)可達到70%，可以循環(huán)利用。故采用不同乙醇-水配比梯度洗脫，且選用第4組乙醇-水(30∶70)和(70∶30)的配比梯度進行洗脫。

2.5正交實驗設(shè)計以吸附液pH值(A)、洗脫液體積分?jǐn)?shù)(B)和洗脫液pH值(C)為因素，確定每個因素3個水平，按表L9(33)設(shè)置正交實驗，上樣量為5 BV，以苦豆草總生物堿的分離純化提取率為評價指標(biāo)。正交實驗因素水平和正交實驗結(jié)果見表5和表6。實驗結(jié)果表明，苦豆草總生物堿最佳的分離純化工藝條件是：A3B3C3，即吸附液pH值為9.0，洗脫液體積分?jǐn)?shù)乙醇-水(30∶70)和(70∶30)的配比梯度洗脫液，洗脫液pH值為9.0，其中吸附液pH值對分離純化提取率的影響最大。

表5正交實驗因素水平表L9(33)

Tab.5 Levels and factors of orthogonal test L9(33)

水平因素A,吸附液pH值B,洗脫液體積分?jǐn)?shù)(乙醇-水)C,洗脫液pH值15.030→904.027.020→806.039.030→709.0

注：

30→90指采用乙醇-水配比梯度：30∶70，50∶50，70∶30，90∶10進行洗脫

20→80指采用乙醇-水配比梯度：20∶80，40∶60，60∶40，80∶20進行洗脫

30→70指采用乙醇-水配比梯度：30∶70，70∶30進行洗脫

表6正交實驗結(jié)果

Tab.6 Results of the orthogonal test

序號A,吸附液pH值B,洗脫液體積分?jǐn)?shù)(乙醇-水)C,洗脫液pH值生物堿分離純化提取率/%1530→90490.22520→80691.23530→70991.44720→80492.15730→70692.56730→90992.87930→70493.28930→90692.79920→80993.1均值190.9391.9091.83均值292.4792.1392.13均值393.0092.3792.43極差2.070.470.60主次順序A>C>B優(yōu)水平A3B3C3優(yōu)組合A3B3C3

2.6中試驗證通過實驗室確定的大孔樹脂吸附法分離純化苦豆草總生物堿的最佳工藝條件，進行3批中試工藝驗證，采用大孔樹脂三柱并聯(lián)分離純化苦豆草總生物堿，采用噴霧干燥，計算出膏率，分別為3.01%，3.03%和2.99%，苦豆草總生物堿的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為66.75%，66.63%和66.42%。說明該工藝分離純化苦豆草總生物堿穩(wěn)定可行。

3討論

采用大孔樹脂分離純化技術(shù)，吸附液和洗脫液的pH值都是影響樹脂純化效果的重要因素[10]，本實驗對吸附液和洗脫液的pH值進行考察，確定吸附液和洗脫液的pH為9.0時，分離純化效果最好。

上樣液質(zhì)量濃度是影響吸附效果的重要因素，劉霞等[11]通過大孔樹脂純化鹿藥總皂苷和總黃酮的研究表明，隨著上樣液質(zhì)量濃度增加，總皂苷在樹脂上的吸附量逐漸降低。采用大孔樹脂吸附分離時，一般將上樣液質(zhì)量濃度控制在一定范圍內(nèi)。本研究對苦豆草上樣液質(zhì)量濃度進行考察，上樣液質(zhì)量濃度越大，樹脂對其吸附量越大，解吸率相對越大。如果上樣液質(zhì)量濃度較低，生產(chǎn)中成本較高；但溶液質(zhì)量濃度太大，溶液黏稠，溶液堵塞柱子。綜合考慮，確定上樣液質(zhì)量濃度為3.28 mg·mL-1(以槐定堿計)即1 mL相當(dāng)于原生藥0.23 g。

本實驗通過吸附曲線和洗脫曲線考察，確定單柱最大上樣量和洗脫液用量，采用乙醇-水(30∶70)和(70∶30)的配比梯度洗脫液進行洗脫，為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)采用大孔樹脂三柱并聯(lián)生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

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