Bcl-2介導(dǎo)的芹菜素抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷作用

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2014-12-4 13:45網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/doi/10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.026.html

Bcl-2介導(dǎo)的芹菜素抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷作用

周敏1，游嘉振2,何歡2，劉丹2，廖章萍2，湯蕾2，尹東1，何明2

(南昌大學(xué)1.第二附屬醫(yī)院江西省分子醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、2.藥學(xué)院江西省基礎(chǔ)藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌330006)

中國(guó)圖書分類號(hào)：R-332；R284.1；R329.24；R329.411；R845.22

摘要:目的探討芹菜素(apigenin, Api)在心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷中的作用，并闡明Api對(duì)心肌損傷的保護(hù)作用是否主要由Bcl-2介導(dǎo)。方法培養(yǎng)H9c2心肌樣細(xì)胞；隨機(jī)分為正常對(duì)照(Cont)組、缺氧/復(fù)氧 (Anoxia/Reoxygenation, A/R) 組、Api預(yù)處理組、Api+ABT-737組。MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率；Western blot法檢測(cè)Bcl-2表達(dá)；比色法檢測(cè)培養(yǎng)液LDH活性、細(xì)胞SOD及GSH-Px活性、MDA含量；流式細(xì)胞儀檢測(cè)心肌細(xì)胞ROS含量、線粒體膜電位及細(xì)胞凋亡。結(jié)果 Api預(yù)處理25 h后，心肌細(xì)胞Bcl-2表達(dá)呈劑量依賴性上調(diào)(P<0.01)；細(xì)胞存活率升高，培養(yǎng)液LDH活性降低，細(xì)胞SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量與ROS生成減少，線粒體膜電位更為穩(wěn)定，細(xì)胞凋亡減少(P<0.01)；Bcl-2抑制劑ABT-737則可取消Api的上述心肌保護(hù)作用。結(jié)論Api抗心肌A/R損傷作用涉及Bcl-2信號(hào)通路，至少部分依賴于其對(duì)Bcl-2表達(dá)水平的上調(diào)。

關(guān)鍵詞:芹菜素；Bcl-2；缺氧/復(fù)氧損傷；心肌細(xì)胞保護(hù)；細(xì)胞凋亡；線粒體

doi:10.3969/j.issn.1001-1978.2015.01.026

文章編號(hào)：

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A1001-1978(2015)01-0122-06

收稿日期:2014-09-21,修回日期:2014-10-28

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No 81160402)

作者簡(jiǎn)介：周敏(1986-),女,碩士生，助教，研究方向：心肌急性損傷與保護(hù)， E-mail：34543795@qq.com；

通訊作者尹東(1956-)，女，碩士，教授，研究方向：細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞，，E-mail：dongyin24@126.com； 何明(1956-)，男，博士，教授，研究方向：心肌急性損傷與保護(hù)；，E-mail：jxhm56@163.com

Abstract:AimTo investigate the relationship between the cardioprotection of apigenin (Api)from anoxia/reoxygenation (A/R) injury and Bcl-2 pathway．MethodsH9c2 cardiomyocytes were cultured and divided into normal control group, A/R group, Api pretreatment group(Api), Api+Bcl-2 inhibitor group (Api+ABT-737). Expression of Bcl-2 was determined by Western blot，and cell viability was measured by MTT method. LDH, SOD, GSH-Px, MDA activity were determined by chromometry．ROS generation, mitochondrial membrane potential and apoptosis were determined by flow cytometry. Results25h after apigenin precondition，the expression of Bcl-2 was upregulated in cardiomyocytes (P<0.01). In the group pretreated with 40 μmol·L`(-1) apigenin before A/R, the activity of LDH in culture medium decreased; the activity of intracellular SOD, GSH-Px increased; the content of MDA and ROS generation decreased; cell viability increased; mitochondrial membrane potential could be more stable and cell apoptosis decreased (P<0.01). However, all these protective effects were attenuated significantly in the group pretreated with apigenin and Bcl-2 inhibitor ABT-737. ConclusionThe effect of apigenin against A/R injury in cardiomyocytes involves Bcl-2 pathway, and at least partly depends on its effect on upregulating the expression of Bcl-2.

游嘉振(1994-)，男，本科，E-mail:674334219@qq.com;

Fliss等[1]指出心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)損傷細(xì)胞死亡本質(zhì)上可能是細(xì)胞凋亡。后者由許多調(diào)控基因直接控制，其中Bcl-2家族是已知細(xì)胞凋亡中最重要的調(diào)控因子[2-4]。因此，可望通過適度干預(yù)Bcl-2基因表達(dá)以阻斷細(xì)胞凋亡過程，實(shí)現(xiàn)抗心肌I/R損傷。

芹菜素(apigenin, Api)，化學(xué)名為4′, 5, 7-三羥基黃酮，分子式為C15H10O5。近年來研究發(fā)現(xiàn)Api能抑制心肌I/R損傷引起的細(xì)胞凋亡[5]、明顯縮小心肌I/R梗死面積[6]、抗心律失常[7]；尚具有減輕腦缺血性損傷[8]等心血管藥理活性，但其對(duì)心肌I/R損傷保護(hù)作用的具體機(jī)制還不很清楚。

本文選用大鼠H9c2心肌樣細(xì)胞，行缺氧/復(fù)氧(anoxia/reoxygenation, A/R) 損傷，經(jīng)Api預(yù)處理產(chǎn)生心肌保護(hù)作用后，用Western blot檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白表達(dá)水平； 加用Bcl-2特異性抑制劑ABT-737[9]，探討Api預(yù)處理抗心肌A/R損傷作用與其對(duì)Bcl-2 蛋白表達(dá)水平上調(diào)之間的關(guān)系及其細(xì)胞線粒體功能的影響。

1材料與方法

1.1受試藥品與試劑芹菜素(Api)：中國(guó)藥品生物制品檢定所；ABT-737：Selleck公司；Bcl-2抗體、β-actin 抗體及相應(yīng)二抗：Santa Cruz；蛋白提取試劑盒：北京普利來公司； MEM培養(yǎng)基：Gibco BRL公司產(chǎn)品；胎牛血清：杭州四季青生物工程材料有限公司；增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光印跡試劑、硝酸纖維素膜(Amersham, UK)、MTT、HEPES、PMSF、亮肽素、丙烯酰胺、SDS、亞甲基雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、EDTA和DTT：Sigma公司；其它試劑均為分析純。

2結(jié)果

2.1不同濃度Api預(yù)處理對(duì)H9c2細(xì)胞A/R損傷后細(xì)胞存活率影響MTT結(jié)果顯示(Fig 1)，A/R處理后，細(xì)胞存活率降低(P<0.01)，表明A/R損傷模型構(gòu)建成功；Api預(yù)處理細(xì)胞存活率在10～40 μmol·L-1區(qū)間呈劑量依賴性升高(P<0.01)，表現(xiàn)出較好的細(xì)胞保護(hù)作用；而80 μmol·L-1Api細(xì)胞存活率反而降低，提示該劑量對(duì)心肌細(xì)胞可能已產(chǎn)生毒性損傷。

Fig 1Effects of apigenin on cell viability of H9c2

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsA/R group

2.2不同濃度Api預(yù)處理對(duì)H9c2細(xì)胞A/R損傷后Bcl-2蛋白表達(dá)影響Western blot 結(jié)果所示(Fig 2)，與Cont組和A/R相比，在10~40 μmol·L-1Api預(yù)處理區(qū)間Bcl-2蛋白表達(dá)呈劑量依賴性上調(diào)，其中40 μmol·L-1Api預(yù)處理組Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)最為明顯(P<0.01)；而80μmol·L-1Api Bcl-2蛋白表達(dá)反而下調(diào)，與上述細(xì)胞存活率實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。根據(jù)上述結(jié)果，本文后續(xù)實(shí)驗(yàn)中凡涉及Api預(yù)處理之終濃度均為40 μmol·L-1。

Fig 2　Apigenin pretreatment upregulates Bcl-2 expression in

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsA/R group

2.3Api預(yù)處理對(duì)A/R損傷后H9c2細(xì)胞存活率與培養(yǎng)液中LDH活性的影響如Fig 3所示：40 μmol·L-1Api預(yù)處理可使得心肌細(xì)胞存活率明顯升高(P<0.01)、培養(yǎng)液中LDH活性明顯降低(P<0.01)，表現(xiàn)出良好的抗A/R損傷作用；而Api+ABT-737組細(xì)胞存活率降低(P<0.01)、培養(yǎng)液中LDH活性增加(P<0.01)，表明Bcl-2特異性抑制劑ABT-737可基本取消Api預(yù)處理的保護(hù)作用。

2.4Api預(yù)處理對(duì)A/R損傷后H9c2細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響如Fig 4所示：H9c2心肌細(xì)胞經(jīng)A/R處理后，ROS含量峰右移，表明與Cont組比較ROS生成明顯增加(P<0.01)；40 μmol·L-1Api預(yù)處理后，ROS含量峰左移，表明與A/R組相比ROS生成明顯降低(P<0.01)，提示Api預(yù)處理后能減少A/R損傷所致的ROS爆發(fā)；而Bcl-2特異性抑制劑ABT-737可取消Api預(yù)處理的這一作用(P<0.01)。

Fig 3　Effects of apigenin on cell viability and LDH activity

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsA/R group;ΔΔP<0.01vsApi

2.5Api預(yù)處理對(duì)A/R損傷后H9c2細(xì)胞內(nèi)MDA含量、SOD和GSH-Px 活性的影響Tab 1結(jié)果顯示，A/R組心肌細(xì)胞MDA 含量升高，SOD、GSH-Px活性明顯下降(P<0.01)，提示細(xì)胞經(jīng)A/R損傷后發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激；40 μmol·L-1Api預(yù)處理后心肌細(xì)胞MDA含量明顯降低，同時(shí)SOD和GSH-Px活性升高(P<0.01)；而Api+ABT-737組則MDA含量升高、SOD和GSH-Px活性降低(P<0.01)，表明Api預(yù)處理可以減輕A/R引起的細(xì)胞損傷，而Bcl-2特異性抑制劑ABT-737的加入則可取消此作用。

Tab 1Effects of apigenin on intracellular MDA,

GroupMDA/μmol·L-1SOD/U·L-1GSH-Px/μmol·L-1Cont2.36±0.2543.27±3.66126.26±13.11A/R4.33±0.42**24.89±2.18**77.25±7.05**Api2.56±0.33##35.89±3.46##109.89±5.21##Api+ABT-7375.03±0.26ΔΔ25.93±3.91ΔΔ62.43±3.09ΔΔ

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsA/R group;ΔΔP<0.01vsApi group

Fig 4Effects of apigenin on ROS generation in H9c2

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsA/R group;△△P<0.01vsApi group

2.6Api預(yù)處理對(duì)A/R損傷后H9c2細(xì)胞線粒體膜電位變化的影響如Fig 5所示，40 μmol·L-1Api預(yù)處理后，紅色/綠色熒光比值明顯高于A/R組(P<0.01)；而Api+ABT-737組則紅色/綠色熒光比值的明顯降低(P<0.01)，表明Api預(yù)處理可以穩(wěn)定線體粒膜電位，而Bcl-2特異性抑制劑ABT-737可取消這一保護(hù)作用。

Fig 5Effects of apigenin on mitochondria membrane potential

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsA/R group;ΔΔP<0.01vsApi group

2.7Api預(yù)處理對(duì)A/R損傷后H9c2細(xì)胞凋亡的影響如Fig 6所示，A/R組陽性細(xì)胞百分率明顯高于Cont組(P<0.01)；與之相比，40 μmol·L-1Api預(yù)處理后細(xì)胞凋亡水平明顯降低(P<0.01)，說明Api預(yù)處理可以對(duì)抗A/R引起的心肌細(xì)胞凋亡；而Api+ABT-737組凋亡水平明顯高于Api處理組(P<0.01)，說明Bcl-2特異性抑制劑ABT-737可明顯削弱Api的抗凋亡作用。

Fig 6Effects of apigenin on apoptosis of H9c2

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsA/R group;△△P<0.01vsApi group

3討論

Api屬于黃酮類化合物，廣泛存在于多種水果和蔬菜中，以常吃的芹菜中含量最高，被稱為“植物雌激素”。其藥理作用廣泛，研究發(fā)現(xiàn)：Api具有多種藥理作用，保護(hù)心、肝、腦等重要臟器免遭I/R損傷[5~8]。

我們?cè)诖_認(rèn)Api預(yù)處理對(duì)H9c2心肌樣細(xì)胞產(chǎn)生保護(hù)作用后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)水平明顯上調(diào)，這一結(jié)果與史婷婷等[5]報(bào)道一致；但本文進(jìn)一步首次證實(shí)：Bcl-2特異性抑制劑ABT-737可取消或是明顯減弱Api對(duì)心肌細(xì)胞的相關(guān)保護(hù)作用，表明其作用機(jī)制依賴于上調(diào)Bcl-2表達(dá)。

Bcl-2蛋白家族分為抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白兩大類。前者包括Bcl-2、Bcl-xL 和 Bcl-w等，后者包括Bak、Bad、Bax等。其主要定位于線粒體膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜等上，在細(xì)胞凋亡中起著非常關(guān)鍵性作用[2-3]?？沟蛲龅鞍缀痛俚蛲龅鞍锥咧g會(huì)形成二聚體，其比值可決定細(xì)胞的生存或死亡。Bax的BH-3區(qū)域是其活性中心，Bcl-2通過疏水區(qū)與其BH-3活性中心結(jié)合發(fā)揮作用[4]。Bcl-2特異性抑制劑ABT-737等類似Bax BH-3區(qū)域的小分子物質(zhì)，能與Bcl-2的疏水區(qū)結(jié)合，抑制其抗凋亡活性[9]。

研究資料表明：線粒體功能衰竭是心肌I/R損傷過程中的重要事件。I/R發(fā)生時(shí)，線粒體膜上的mPTP (mitochondrial permeability transition pore) 開放可誘發(fā)線粒體膜電位的崩塌；隨之基質(zhì)腫脹，外膜破裂，細(xì)胞色素C等凋亡信號(hào)分子釋放，導(dǎo)致心肌細(xì)胞凋亡[2-3,11]。其中，Bcl-2與促凋亡蛋白Bax二者相互作用，通過影響線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性，發(fā)揮著細(xì)胞凋亡“主開關(guān)”的作用[4]。

本研究證實(shí)，40 μmol·L-1Api預(yù)處理明顯上調(diào)Bcl-2表達(dá)水平后，細(xì)胞存活率增加，細(xì)胞內(nèi)SOD和GSH-Px活性升高，ROS生成及MDA含量降低，線粒體膜電位穩(wěn)定，細(xì)胞凋亡減少；而Bcl-2抑制劑ABT-737可取消或是明顯減弱Api上述保護(hù)作用。

綜上所述，Api預(yù)處理可以上調(diào)A/R損傷的H9c2心肌樣細(xì)胞Bcl-2表達(dá)，而Api的心肌保護(hù)作用涉及Bcl-2信號(hào)通路，至少部分依賴于其對(duì)Bcl-2表達(dá)的上調(diào)，這為我們深入探討Api作為心血管保護(hù)藥物的作用機(jī)制提供了新的思路。

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Role of Bcl-2 signal pathway in apigenin preconditioning against

cardiomyocytes anoxia/reoxygenation injury

ZHOU Min1, YOU Jia-zhen2, HE Huan2, LIU Dan2, LIAO Zhang-ping2, TANG Lei2, YIN Dong1, HE Ming2

(1.JiangxiProvincialKeyLaboratoryofMolecularMedicine，theSecondAffiliatedHospitaltoNanchangUniversity，Nanchang

330006,China; 2.JiangxiProvincialKeyLaboratoryofBasicPharmacology，NanchangUniversity，Nanchang330006,China)

Key words: apigenin; Bcl-2; anoxia/reoxygenation injury; cardiomyocytes protection; apoptosiss; mitochondrial