糖尿病潰瘍中Wnt/β-catenin信號通路表達的變化

糖尿病潰瘍中Wnt/β-catenin信號通路表達的變化*

趙亞男1，劉明2△，張玥2，王彬2，張玉冬2，蘇海文3，任曉蘭4，郝清智2

(山東中醫(yī)藥大學1第一臨床醫(yī)學院，2附屬醫(yī)院周圍血管病科，山東 濟南 250014；青島市第三人民醫(yī)院3麻醉科，4心內科，山東 青島 266000)

[摘要]目的： 觀察糖尿病(DM)潰瘍中Wnt/β-catenin信號通路表達的變化，探討該信號通路在糖尿病難愈性潰瘍中的作用。方法: 雌性Wistar大鼠采用高脂高糖飼料聯(lián)合小劑量鏈脲佐菌素液腹腔注射法制備糖尿病模型。分別取正常對照組與DM組制作潰瘍模型。觀察創(chuàng)面造模后第3天、第7天和第14天對照組及DM組創(chuàng)面愈合情況的變化，并采用HE染色法檢測創(chuàng)面組織形態(tài)結構的變化，采用ELISA法和RT-PCR法檢測創(chuàng)面組織中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3蛋白及mRNA的變化。結果: DM組大鼠的創(chuàng)面愈合率明顯低于對照組(P<0.05)，且與對照組相比，其創(chuàng)面組織中含有較少的炎性細胞、纖維母細胞及新生毛細血管。DM組大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin和Rspo-3蛋白及mRNA的表達水平均低于對照組，GSK-3β蛋白及mRNA的表達水平均高于對照組(P<0.05)。結論: Wnt/β-catenin通路的下調有可能導致了糖尿病潰瘍的難愈，而該通路的下調可能源自于Rspo-3蛋白表達的下降。

[關鍵詞]糖尿病潰瘍； Wnt信號通路； β-catenin； GSK-3β； Rspo-3

[中圖分類號]R587.1; R363.2[文獻標志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.018

[文章編號]1000-4718(2015)11-2039-08

[收稿日期]2015-03-23[修回日期] 2015-09-22

[基金項目]*國家科技重大專項(No. 2009ZX09503-025)

通訊作者△Tel: 0851-28608065; E-mail: cellgene@163.com

Expression changes of Wnt/β-catenin signaling pathway in diabetic ulcerZHAO Ya-nan1, LIU Ming2, ZHANG Yue2, WANG Bin2, ZHANG Yu-dong2, SU Hai-wen3, REN Xiao-lan4, HAO Qing-zhi2

(1FirstMedicalCollege,2DepartmentofVascularSurgery,TheAffiliatedHospital,ShandongUniversityofTraditionalChineseMedicine,Jinan250014,China;3DepartmentofAnesthesiology,4DepartmentofCardiology,TheThirdPeople’sHospitalofQingdao,Qingdao266000,China.E-mail:liuming404@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To observe the effect of Wnt/β-catenin signaling pathway on diabetic ulcer. METHODS: Diabetic animal model was established in the female Wistar rats by intraperitoneal injection of low-dose streptozotocin following high-fat diet feeding. A circular wound was made on the dorsum of the rats in both control group and diabetic group. The condition of wound healing was recorded and the structures of the wound tissues were observed by HE staining in the 2 groups at 3, 7 and 14 d after wounding. The expression of β-catenin, GSK-3β and Rspo-3 at mRNA and protein levels in the wound tissues was detected by RT-PCR and ELISA. RESULTS: In diabetic group, the wound healing rate was lower (P<0.05), and the inflammatory cells， fibroblast cells and new capillaries in the wound tissues were fewer than those in control group. The expression of β-catenin and Rspo-3 at mRNA and protein levels in the wound tissues in control group was significantly higher than those in diabetic group, and the expression of GSK-3β was exactly the opposite (P<0.05). CONCLUSION: The down-regulation of Wnt/β-catenin probably resultes from the decreased level of Rspo-3, which may be one of the reasons for delaying the diabetic ulcer healing.

[KEY WORDS]Diabetic ulcer; Wnt signaling pathway; β-catenin; GSK-3β; Rspo-3

糖尿病潰瘍(diabetic ulcer，DU)是極具代表性的難愈性潰瘍。據統(tǒng)計，30%的糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者會發(fā)生皮膚潰瘍，且反復發(fā)作，經久不愈，嚴重者會導致截肢或者引發(fā)膿毒血癥而危及生命[1]。導致DU難愈的原因較復雜，信號通路表達的變化是其中之一。有研究發(fā)現(xiàn)，Wnt信號通路與創(chuàng)面愈合密切相關[2]。為了研究糖尿病潰瘍中Wnt/β-catenin信號通路表達的變化，我們制作糖尿病潰瘍的大鼠模型，通過觀察潰瘍組織形態(tài)結構的變化，及檢測創(chuàng)面組織中Wnt信號通路相關的β-連環(huán)素(β-catenin)、糖原合成激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)和R-spondin 3(Rspo-3)的蛋白及mRNA的表達水平，以探討Wnt/β-catenin信號通路在糖尿病潰瘍創(chuàng)面難愈中的作用機制。

材料和方法

1材料

鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)購于Sigma；大鼠ELISA試劑盒購于R&D；Oligo(dT)、Ribonuclease Inhibitort和DEPC購于Bio Basic INC；Reverse Transcriptase、Taq DNA Polymerase和GeneRulerTM100 bp DNA Ladder購于Fermentas； dNTP Mix、Agarose I-B購于上海生工生物工程有限公司。引物由上海博尚生物技術有限公司合成。

2方法

2.1糖尿病大鼠模型的建立及分組清潔級雌性Wistar大鼠34只，體重160 g～180 g，購自山東大學動物實驗中心。大鼠按隨機數字表隨機分為正常對照(control)組和糖尿病(DM)組。適應性飼養(yǎng)1周后，分別記錄2組大鼠的體重、進食量、飲水量、排泄量，并采用斷尾取血法測定大鼠的隨機血糖。對照組給予普通飼料繼續(xù)飼養(yǎng)，DM組給予高脂高糖飼料(59%基礎飼料、20%蔗糖、18%豬油、3%蛋黃，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司加工制作)飼養(yǎng)。飼養(yǎng)4周后，分別記錄2組大鼠的體重、進食量、飲水量、排泄量及隨機血糖。此后，2組大鼠均禁食12 h，DM組給予30 mg/kg、1%的STZ溶液(臨用前用0.1 mol/L、pH 4.5的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液配制)單次腹腔注射，對照組注射等體積的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。注射后第3天測隨機血糖，血糖≥16.67 mmol/L為糖尿病造模成功；造模不成功者再次空腹12 h后注射10 mg/kg、1% STZ溶液。維持高血糖狀態(tài)4周后，再次記錄2組大鼠的體重、進食量、飲水量、排泄量及血糖，并進行創(chuàng)面造模。

2.2糖尿病潰瘍大鼠模型的建立維持高血糖狀態(tài)4周后，將2組大鼠以3%的戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射進行麻醉，麻醉成功后，背部脫毛，常規(guī)消毒，在背部制作直徑約為2.5 cm的圓形創(chuàng)面，深至皮下。潰瘍造模時，2組大鼠各死亡1只。每組大鼠各隨機選取15只，進行觀察。

2.3創(chuàng)面愈合情況觀察創(chuàng)面造模后第3、7和14天對創(chuàng)面進行大體觀察，主要包括創(chuàng)面顏色、腫脹程度、滲液量等，并用數碼相機拍照，通過Photoshop軟件，記錄創(chuàng)面面積[3]。

2.4創(chuàng)面組織HE染色分別于創(chuàng)面造模后第3、7和14天，每組大鼠各隨機抽取5只，戊巴比妥鈉麻醉成功后，采集創(chuàng)面及創(chuàng)周2 mm的組織，4%多聚甲醛固定后，經沖洗-取材-脫水-透明-浸蠟-包埋-切片-貼片等步驟后制成組織切片，再將石蠟切片脫蠟、水化后，進行組織切片的HE染色，以觀察創(chuàng)面的組織學變化，包括毛細血管、膠原蛋白、成纖維細胞等的變化。

2.5創(chuàng)面組織β-catenin、GSK-3β和Rspo-3蛋白的ELISA檢測分別于創(chuàng)面造模后第3、7和14天，每組大鼠各隨機抽取5只，戊巴比妥鈉麻醉成功后，采集創(chuàng)面及創(chuàng)周2 mm的組織，應用ELISA法檢測其中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3蛋白的的含量。

2.6RT-PCR檢測創(chuàng)面組織β-catenin、GSK-3β和Rspo-3的mRNA表達分別于潰瘍造模后第3、7和14 d，每組大鼠各隨機抽取5只，戊巴比妥鈉麻醉成功后，采集創(chuàng)面及創(chuàng)周2 mm的組織，應用RT-PCR法檢測其中β-catenin、GSK-3β、Rspo-3的mRNA含量。檢測前，先將組織剪碎，采用TRIzol法提取總RNA，測RNA濃度及純度，調整RNA濃度，建立30 μL的RT-PCR體系[Oligo(dT)1 μL+RNA 17 μL+5× buffer 6 μL+dNTP 3 μL+RNase 1.5 μL+M-MLV 1.5 μL]。產物進行PCR，再建立25 μL體系(template DNA 4 μL+2× Taq Master Mix 12.5 μL+P1/P2 10 μmol/L 2 μL+RNase-free water 6.5 μL)。通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物。其中β-catenin的上游引物序列為5’-CTGACCAAACTGCTAAATGACG-3’，下游引物序列為5’-GTGGTGATGGCGTAGAACAGTA-3’；GSK-3β的上游引物序列為5’-GGACCTCGGAGCAAGTTTCA-3’，下游引物序列為5’-AGGCTCCCTCCAAGATCCAT-3’；Rspo-3的上游引物序列為5’-GTACACTGTGAGGCCAGTGAA-3’，下游引物序列為5’-ATGGCTAGAACACCTGTCCTG-3’。

3統(tǒng)計學處理

實驗數據以均數±標準差(mean±SD)表示，統(tǒng)計處理用SPSS 20.0軟件進行分析，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1大鼠一般情況的變化

糖尿病造模后，隨著病情的進展，DM組大鼠毛色逐漸灰暗、枯黃、雜亂，皮膚及皮下脂肪變薄，多飲、多食、多尿明顯。而對照組大鼠毛發(fā)細密、光亮，皮下脂肪豐滿，體重逐漸增加。

2大鼠體重、進食量、飲水量、排泄量和血糖的變化

適應性飼養(yǎng)1周后及注射STZ之前，2組大鼠的體重、平均每日進食量、飲水量和排泄量均無明顯差異；而注射STZ后，DM組大鼠進食量、飲水量和排泄量均增加，體重增長緩慢，與對照組相比，差異顯著(P<0.05)，見表1。注射STZ之前，2組大鼠的隨機血糖無明顯差異，注射STZ后，DM組隨機血糖明顯高于對照組，差異顯著(P<0.05)，見表2。

表1　大鼠體重、進食量、飲水量和排泄量的變化

*P<0.05vscontrol group.

表2大鼠血糖的變化

Table 2.The changes in the blood glucose level of the rats (mmol/L. Mean±SD.n=17)

Group1weekafteradaptivebreedingBeforeinjectingSTZBeforewoundingControl6.06±0.306.09±0.295.99±0.15DM6.13±0.326.11±0.3126.89±2.78*

*P<0.05vscontrol group.

3創(chuàng)面愈合情況

對照組的創(chuàng)面在造模后第3天可見色紅潤，輕度水腫，少量滲出，可見少量肉芽組織；第7天，創(chuàng)面縮小明顯，肉芽色紅潤，無明顯滲出，表面有痂皮覆蓋，創(chuàng)緣可見淡紅色新生上皮；第14天，創(chuàng)面縮小明顯，創(chuàng)周可見淡紅色新生上皮。DM組的創(chuàng)面組織在造模后第3天呈輕度水腫，色暗紅，滲出較多，可見少量黃白色分泌物；第7天，肉芽水腫，色暗紅、無光澤，滲出多；創(chuàng)傷后第14天，創(chuàng)面縮小，滲出減少，創(chuàng)周可見淡紅色上皮爬行，見圖1。

Figure 1.The changes of wound healing in the rats.

圖1大鼠創(chuàng)面愈合情況的變化

4創(chuàng)面愈合率

創(chuàng)面造模后第3、7和14天，對照組大鼠的創(chuàng)面愈合率均高于DM組，差異顯著(P<0.05)，見表3。

表3大鼠創(chuàng)面愈合率的變化

Table 3.The changes of the wound healing rate in the rats (%. Mean±SD)

GroupDay3Day7Day14Control20.87±1.3949.99±1.5891.60±1.58DM5.21±0.94*31.70±1.21*62.20±1.37*

*P<0.05vscontrol group.

5創(chuàng)面組織的HE染色

對照組的創(chuàng)面在造模后第3天可見炎癥細胞浸潤明顯，有少量纖維母細胞及少量新生毛細血管；第7天可見肉芽組織，纖維母細胞生長活躍，新生毛細血管數量增加，有較多炎癥細胞及少量膠原纖維；第14天可見新生表皮及肉芽組織，有少量炎細胞、纖維母細胞及毛細血管，可見較多膠原纖維。DM組的創(chuàng)面在造模后第3天有少量炎癥細胞、纖維母細胞及新生毛細血管；第7天可見炎癥細胞浸潤，有少量纖維母細胞及新生毛細血管，少量膠原纖維；第14天可見新生表皮及肉芽組織，有少量炎細胞、纖維母細胞及毛細血管，可見膠原纖維，見圖2。

Figure 2.The changes of the structure of the wound tissues (HE staining, ×100).

圖2大鼠創(chuàng)面組織的HE染色

6創(chuàng)面組織中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3蛋白的表達

ELISA結果顯示，創(chuàng)面造模后第3、7和14天，DM組創(chuàng)面組織中β-catenin和Rspo-3蛋白的含量均低于對照組(P<0.05)。而DM組創(chuàng)面組織中GSK-3β蛋白的含量高于對照組(P<0.05)，見圖3。

Figure 3.The protein expression of β-catenin, GSK-3β and Rspo-3 in the wound tissues. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖3大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3蛋白的表達

7創(chuàng)面組織中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3的 mRNA表達

RT-PCR的結果顯示，創(chuàng)面造模后第3、7和14天，DM組創(chuàng)面組織中β-catenin和Rspo-3 的mRNA含量均低于對照組(P<0.05)。而DM組創(chuàng)面組織中GSK-3β的mRNA含量高于對照組(P<0.05)，見圖4。

Figure 4.The mRNA expression of β-catenin, GSK-3β and Rspo-3 in the wound tissues. Mean±SD.n=5.*P<0.05vscontrol group.

圖4大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin、GSK-3β和Rspo-3的mRNA表達

討論

糖尿病潰瘍是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，具有發(fā)病原因復雜、病程長、治療困難、預后較差的特點，往往遷延不愈，嚴重者可導致膿毒血癥或截肢。糖尿病患者中發(fā)生足部潰瘍的概率大約為12%～25%[4]。Dohmen等[5]報道，在德國每年有40 000例截肢患者，其中70%是糖尿病患者。導致DU難愈的原因較復雜，信號通路表達的變化是其中之一。

Wnt信號通路是一條高度保守的信號轉導通路，主要有3條途徑，其中經典途徑即Wnt/β-catenin通路。在正常成熟細胞中，Wnt通路處于關閉狀態(tài)，胞漿中幾乎沒有游離的β-catenin[6]。當Wnt信號通路被激活時，Wnt蛋白與細胞表面受體卷曲蛋白(Frizzled，F(xiàn)rz)及低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)結合，胞內散亂蛋白(Dishevelled，Dsh或Dvl)與Frz胞內區(qū)結合后被磷酸化激活，抑制GSK-3β的活性，使得β-catenin不能被磷酸化，不能被泛素-蛋白酶體系降解。不能降解的β-catenin在胞質內大量積累并進入核內，與轉錄活化因子(T-cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)結合，啟動下游靶基因的表達[7]。Wnt信號通路可被皮膚損傷激活，并參與到從炎癥控制到細胞凋亡的傷口愈合的每一個過程中[2]。

β-catenin是胞漿內分子量約為92～95 kD的多功能蛋白質[8]，其在Wnt信號通路中發(fā)揮核心作用，且Wnt通路的刺激是使β-catenin穩(wěn)定性增強的唯一機制[9]。GSK-3β是一種普遍存在于細胞內的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它位于降解復合體β-catenin-APC-Axin的關鍵位置，是決定復合體中β-catenin磷酸化的重要激酶[10]。Rspo蛋白家族包括4個成員(Rspo-1～4)，其與Wnt信號通路之間存在著密切的聯(lián)系。Kazanskaya等[11]首次證明了Rspo蛋白可以激活Wnt信號通路，也有研究認為Rspo蛋白是誘導經典Wnt信號通路的新一類的信號配體[12]。然而，盡管所有的Rspo蛋白均可以激活Wnt通路，但是Rspo-3和Rspo-2比Rspo-1更有效，而相比之下，Rspo-4是不活躍的[13]。

在本實驗中，DM組大鼠與對照組大鼠相比，潰瘍愈合減慢，肉芽生長不良，創(chuàng)面組織的HE染色證實DM組炎癥細胞、纖維母細胞、新生毛細血管等較少，這與勞國娟等[14]研究發(fā)現(xiàn)的糖尿病皮膚創(chuàng)面細胞凋亡增加的結果相近，也證實本實驗成功模擬了糖尿病難愈性潰瘍。

經檢測發(fā)現(xiàn)，DM組大鼠創(chuàng)面組織中β-catenin的表達低于對照組，這與研究發(fā)現(xiàn)的高濃度葡萄糖可使細胞中β-catenin蛋白表達下降的結果相一致[15]。有研究顯示，β-catenin與皮膚發(fā)育、創(chuàng)傷愈合關系密切，參與創(chuàng)面愈合的各個方面[16]，β-catenin的表達增強可促進皮膚表皮細胞、角質細胞、成纖維細胞及血管內皮細胞增殖、分化和遷移能力增強[17]。本實驗中，糖尿病潰瘍大鼠創(chuàng)面組織中呈現(xiàn)出的較少的纖維母細胞、較少的毛細血管，這也與較低水平的β-catenin表達相一致。本實驗檢測尚發(fā)現(xiàn)，糖尿病潰瘍大鼠創(chuàng)面組織中GSK-3β的表達高于對照組，這與GSK-3β作為Wnt信號通路的負性調控因子的生理作用是相符的。Rspo蛋白作為Wnt信號通路的激活因子，在本實驗中發(fā)現(xiàn)，其在糖尿病潰瘍大鼠創(chuàng)面組織中呈現(xiàn)低表達，據此推測糖尿病潰瘍中Wnt信號通路的下調可能源自其對Rspo蛋白的調降作用。

通過本實驗，我們發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin通路的下調有可能導致了糖尿病潰瘍的難愈，而該通路的下調可能源于糖尿病對Rspo蛋白的調降產生，但具體的機制仍需進一步探索。我們試圖通過本實驗從一個新的角度揭示糖尿病潰瘍的難愈機制，擬為臨床治療糖尿病潰瘍提供新的思路。

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(責任編輯： 陳妙玲， 羅森)