miRNA-25對(duì)人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE1增殖的影響

miRNA-25對(duì)人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE1增殖的影響

張偉1,2△，周勇慧3，龐一強(qiáng)4

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院1病理教研室，2第一附屬醫(yī)院病理科，3第一附屬醫(yī)院普外科二病區(qū)， 內(nèi)蒙古 包頭 014010；4包頭市第四醫(yī)院神經(jīng)外科， 內(nèi)蒙古 包頭 014030)

[摘要]目的： 探討過表達(dá)/沉默微小RNA-25(microRNA-25，miRNA-25)對(duì)人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE1增殖能力的影響及其作用機(jī)制。方法: RT-PCR檢測(cè)各臨床樣品組織中miRNA-25的表達(dá)水平。建立miRNA-25過表達(dá)/沉默的TE1細(xì)胞株，采用CCK-8法、BrdU實(shí)驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)TE1細(xì)胞增殖能力的變化及細(xì)胞周期狀態(tài)；Western blot法和RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞周期調(diào)控因子細(xì)胞周期蛋白E1(cyclin E1)和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)的蛋白與mRNA表達(dá)水平。結(jié)果: miRNA-25在食管黏膜組織中具有特異性表達(dá)并在TE1細(xì)胞中呈高表達(dá)。CCK-8法和BrdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)miRNA-25的TE1細(xì)胞的增殖能力顯著增加(P<0.05)，而沉默miRNA-25抑制TE1細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示過表達(dá)miRNA-25可明顯促進(jìn)TE1細(xì)胞從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，沉默miRNA-25則抑制其轉(zhuǎn)換。同時(shí)Western blot和RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示過表達(dá)miRNA-25后，cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著增加(P<0.05)，沉默miRNA-25后則顯著減少(P<0.05)。結(jié)論: miRNA-25能夠促進(jìn)人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE1的增殖，其作用機(jī)制可能與促進(jìn)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)換及上調(diào)cyclin E1和CDK2的表達(dá)水平有關(guān)，提示miRNA-25可作為治療食管鱗狀細(xì)胞癌的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

[關(guān)鍵詞]微小RNA-25; 人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE1; 細(xì)胞增殖; 細(xì)胞周期蛋白E1; 細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2

[中圖分類號(hào)]R363.1+4[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.11.009

Effects of miRNA-25 on proliferation of human esophageal squamous-cell carcinoma cell line TE1ZHANG Wei1,2, ZHOU Yong-hui3, PANG Yi-qiang4

(1DepartmentofPathophysiology，2DepartmentofPathology,FirstAffiliatedHospital,3WardIIofGeneralSurgeryDepartment,FirstAffiliatedHospital,BaotouMedicalCollege,InnerMongoliaUniversityofTechnology,Baotou014010,China;4DepartmentofNeurosurgery,FourthHospitalofBaotou,Baotou014030,China.E-mail:xbkld@163.com)

ABSTRACT[]AIM: To investigate the effects and mechanisms of microRNA-25 (miRNA-25) on the proliferation of human esophageal squamous-cell carcinoma cell line TE1. METHODS: The abundance of miRNA-25 in different tissues was measured by RT-PCR. After silencing or over-expression of miRNA-25 with mimics or inhibitor in TE1 cells, the cell proliferation, cell cycle distribution and the expression of cyclin E1 and cyclin-dependent kinase 2 (CDK2) at mRNA and protein levels were measured by CCK-8 assay, BrdU detection, flow cytometry, RT-PCR and Western blot, respectively. RESULTS: miRNA-25 was prominent in esophageal mucosal tissue and highly expressed in TE1 cells (P<0.05). Over-expression of miRNA-25 increased TE1 cell proliferation, promoted the cell cycle progression and enhanced the entrance of the cells into S phase (P<0.05). Inverse results were obtained after down-regulation of miRNA-25 (P<0.05). Furthermore, the expression of cyclin E1 and CDK2 at mRNA and protein levels was significantly increased after over-expression of miRNA-25, but decreased after down-regulation of miRNA-25 (P<0.05). CONCLUSION: miRNA-25 enhances cell cycle transition by increasing the expression of cyclin E1 and CDK2, thus accelerating TE1 cell proliferation. This study provides a novel mechanism by which miRNA-25 increases the proliferation of human esophageal squamous-cell carcinoma cell line TE1, suggesting that down-regulation of miRNA-25 may be a potential new therapeutic strategy for treating esophageal squamous-cell carcinoma.

[KEY WORDS]MicroRNA-25; Human esophageal squamous-cell carcinoma cell line TE1; Cell proliferation; Cyclin E1; Cyclin-dependent kinase 2

依據(jù)全球惡性腫瘤統(tǒng)計(jì)資料顯示，食管癌的5年生存率小于15%[1]，死亡率排名第4位，是常見的十大惡性腫瘤之一[2]。其發(fā)病率具有顯著的人群種族差異。食管癌主要分為食管腺癌(esophageal adenocarcinoma，EA)和食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous-cell carcinoma，ESCC)，其中鱗狀細(xì)胞癌占食管癌的90%以上。食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生尚無確定病因，可能由多種因素綜合作用，主要有吸煙、酗酒、空氣污染、病毒感染等，且發(fā)病率呈現(xiàn)逐年增加的趨勢(shì)。目前的治療手段主要有手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療以及手術(shù)與放射治療結(jié)合[3]。

目前已發(fā)現(xiàn)約有一萬多種miRNAs，廣泛存在于動(dòng)物、植物及病毒等不同的細(xì)胞和組織中，表達(dá)形式各異[4]。近年研究發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)可能作為一種潛在的腫瘤早期診斷指標(biāo)以及潛在治療靶點(diǎn)。miRNA-25在多種腫瘤組織中存在異常表達(dá)。miRNA-25屬于miRNA-106b-25簇，有研究表明該家族成員在人類腦內(nèi)呈高表達(dá)狀態(tài)，并在癌癥的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。本研究建立了過表達(dá)/沉默miRNA-25的人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE1，通過CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)方法檢查癌細(xì)胞周期變化，以及Western blot和RT-PCR檢測(cè)TE1細(xì)胞的周期調(diào)控因子細(xì)胞周期蛋白E1(cyclin E1)及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2(cyclin-dependent kinase 2, CDK2)的蛋白與mRNA表達(dá)的變化，探討miRNA-25表達(dá)的變化對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌發(fā)生發(fā)展的潛在影響。

材料和方法

1材料與試劑

胎牛血清、RPMI-1640培養(yǎng)基和Opti-NEM培養(yǎng)基購(gòu)于Gibco；LipofectamineTMRNAiMAX購(gòu)于Invitrogen；人食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株TE1購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；cyclin E1和CDK2抗體購(gòu)于Santa Cruz；BrdU細(xì)胞增殖分析試劑盒購(gòu)于Chemicon；miRNA-25-mimic/inhibitor由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2樣本收集

收集內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2012年8月～2014年2月食管鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤組織及癌旁組織樣本49例，另取正常食管黏膜組織46例、正常鼻咽黏膜組織40例、正常胃黏膜組織38例、正常腸黏膜組織37例和正常卵巢組織29例，樣本年齡均大于18歲。所有組織樣本存放于-80 ℃液氮中保存。所有活體組織經(jīng)內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院病理專家診斷證實(shí)，臨床標(biāo)本的獲取經(jīng)倫理委員會(huì)同意，患者簽署知情同意書。

3實(shí)驗(yàn)方法

3.1細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組將TE1細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔1～2 d換液1次。細(xì)胞消化并種植于24孔培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合至40%～50%左右，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞置于無血清的培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，隨后進(jìn)行下一步處理，組別分為空白對(duì)照(control，Con)組；陰性對(duì)照組(negative control-mimics，NC-m或negative control-inhibitor，NC-i)；轉(zhuǎn)染組(miRNA25-mimics，25-m或miRNA-25-inhibitor，25-i) 。將以上miRNA分別溶解于Opti-MEM培養(yǎng)基中，加入LipofectamineTMRNAiMAX，輕柔混合，室溫靜置20～30 min，形成復(fù)合體。將復(fù)合體加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，室溫孵育4 h，轉(zhuǎn)換為正常細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。

3.2CCK-8法和BrdU法測(cè)定細(xì)胞增殖水平將各組的TE1細(xì)胞以每孔2×103個(gè)細(xì)胞，加入96孔培養(yǎng)板中，每孔加入Opti-MEM培養(yǎng)基100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24 h、48 h、72 h和96 h加入10 μL CCK-8溶液，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育1 h。選擇450 nm波長(zhǎng)，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔吸光度值(A)。另設(shè)單孔只加入培養(yǎng)基不加入TE1細(xì)胞作為空白對(duì)照。

將細(xì)胞以每孔1 000個(gè)接種至96孔板中，培養(yǎng)24 h后加入BrdU，培養(yǎng)24 h，加入100 μL固定液，放置30 min，洗板3次，5% 胎牛血清封閉30 min。加入甲酰胺100 ℃變性5 min，洗滌，加入抗小鼠BrdU單抗，蘇木素襯染，顯微鏡下計(jì)數(shù)。

3.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期將對(duì)數(shù)期的TE1細(xì)胞培養(yǎng)于Opti-MEM培養(yǎng)基24 h，消化處理后，800 r/min離心5 min，用PBS漂洗2次，再次800 r/min離心5 min，PBS重懸，加入70%預(yù)冷無水乙醇，4 ℃避光過夜。900 r/min離心8 min，PBS洗去乙醇，加入碘化丙啶，避光孵育30 min，記錄流式細(xì)胞儀于激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處的熒光強(qiáng)度，重復(fù)3次。

3.4TE1細(xì)胞中cyclin E1和CDK2的蛋白表達(dá)水平測(cè)定提取TE1細(xì)胞蛋白定量，調(diào)整蛋白量。取等量裂解產(chǎn)物，加入4倍體積上樣緩沖液進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，脫脂牛奶室溫封閉2 h，加入 I 抗4 ℃孵育4 h，TBST洗滌3次，每次10 min；再加入相對(duì)應(yīng) II 抗室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，每次10 min，暗室中進(jìn)行熒光顯色。

3.5RT-PCR檢測(cè)取適量食管癌組織、癌旁組織、正常食管黏膜組織、正常鼻咽黏膜組織、正常胃黏膜組織、正常腸黏膜組織、正常卵巢組織和經(jīng)過相應(yīng)處理的TE1細(xì)胞，按照TRIzol說明書提取總RNA，測(cè)定RNA樣品的A280值并定量。以逆轉(zhuǎn)錄酶催化合成cDNA，并在聚合酶催化下進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。擴(kuò)增樣品在2.0%瓊脂糖凝膠中電泳，以β-actin為內(nèi)參照，于凝膠成像系統(tǒng)觀察目的基因條帶并進(jìn)行定量分析。采用Genetool軟件設(shè)計(jì)的相應(yīng)引物序列見表1。

表1　RT-PCR的引物序列

F: forward; R: reverse.

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Bonferroni法進(jìn)行組間均數(shù)的兩兩比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1miRNA-25在不同組織中的表達(dá)水平

RT-PCR的結(jié)果顯示，miRNA-25在正常食管黏膜組織中呈高表達(dá)；在正常胃黏膜組織和卵巢組織中低表達(dá)；在正常鼻咽黏膜組織和正常腸黏膜組織中幾乎不表達(dá)，見圖1。同時(shí)，與正常食管黏膜以及癌旁組織相比，miRNA-25在食管癌組織中表達(dá)明顯增加，見圖2。以上結(jié)果提示，miRNA-25的高表達(dá)與食管癌的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系。

2RT-PCR法檢測(cè)miRNA-25-mimic/inhibitor在TE1細(xì)胞中的表達(dá)效率

通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miRNA25-mimic/inhibitor至TE1細(xì)胞，采用RT-PCR檢測(cè)miRNA-25表達(dá)水平的變化，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染了miRNA25-mimic后，TE1細(xì)胞的miRNA-25水平顯著升高；而轉(zhuǎn)染了miRNA-25 inhibitor后，TE1細(xì)胞的miRNA-25水平則顯著降低，與空白對(duì)照組相比均有顯著差異(P<0.05)，見圖3。

Figure 1.The expression of miRNA-25 in different normal tissues. Mean±SD.

圖1食管、胃、卵巢、鼻和腸道正常粘膜組織中miRNA-25的表達(dá)水平

Figure 2.The expression levels of miRNA-25 in normal, paracancerous and cancerous esophageal tissues. Mean±SD.*P<0.05vsnormal esophageal mucosa.

圖2正常食管黏膜組織、癌旁組織和食管癌組織中miRNA-25的表達(dá)水平

Figure 3.The expression levels of miRNA-25 in the TE1 cell after over-expression/down-regulation of miRNA-25. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCon.

圖3TE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后miRNA-25的表達(dá)水平

3CCK-8法和BrdU實(shí)驗(yàn)測(cè)定TE1細(xì)胞的增殖水平

采用CCK-8法，在miRNA-25-mimic/inhibitor轉(zhuǎn)染TE1細(xì)胞后，分別于24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)檢測(cè)細(xì)胞活力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miRNA-25后，TE1的細(xì)胞活力顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05)，而沉默miRNA-25后，TE1的細(xì)胞活力顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05)；而NC-m、NC-i與空白對(duì)照組間的差異不顯著，見表2。

BrdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)miRNA-25后，DNA合成顯著高于空白對(duì)照組；而沉默miRNA-25后，結(jié)果相反；而NC-m、NC-i與空白對(duì)照組間的差異不顯著，見圖4。

4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)分析過表達(dá)/沉默miRNA-25后TE1細(xì)胞周期的變化。結(jié)果顯示，過表達(dá)miRNA-25后，G0/G1期的細(xì)胞數(shù)占百分比為減少至(46.52±5.08)%，S期細(xì)胞數(shù)所占百分比增加至(43.96±4.67)%，而沉默miRNA-25后，G0/G1期的細(xì)胞數(shù)占百分比為增加至(84.52±4.78)%，S期細(xì)胞數(shù)所占百分比減少至(6.05±2.64)%，說明過表達(dá)miRNA-25促進(jìn)TE1細(xì)胞周期從G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，而沉默miRNA-25則抑制其轉(zhuǎn)換，見圖5。

5Cyclin E1和CDK2的蛋白表達(dá)水平

收集成功轉(zhuǎn)染miRNA-25-mimic/inhibitor的TE1細(xì)胞，提取蛋白，通過Western blot檢測(cè)TE1細(xì)胞中cyclin E1 和CDK2的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果顯示，相對(duì)于未轉(zhuǎn)染的TE1細(xì)胞，過表達(dá)miRNA-25后cyclin E1和CDK2的蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，而沉默miRNA-25后，則顯著降低二者的蛋白表達(dá)水平(P<0.05)，見圖6。

表2miRNA-25對(duì)TE1細(xì)胞活力的影響

Table 2.The effect of miRNA-25 on the viabiliy of the TE1 cells transfected with miRNA-25-mimic/inhibitor determined by CCK-8 assay (%. Mean±SD.n=6)

Group0h24h48h72h96hCon08.51±0.7352.69±5.4192.64±8.99111.64±10.24NC-m09.61±0.6456.84±6.92100.42±8.59126.97±11.42NC-i09.42±0.7354.31±5.6796.47±7.63118.34±10.3425-m034.93±2.98*100.48±8.97*189.72±12.34*243.53±15.64*25-i03.46±0.31*19.47±0.97*46.51±3.14*64.25±5.43*

*P<0.05vsCon.

Figure 4.The quantitative analysis of DNA synthesis in the TE1 cells transfected with miRNA-25-mimic/inhibitor determined by BrdU assay. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCon.

圖4各組TE1細(xì)胞的DNA合成量比較

6Cyclin E1和CDK2的mRNA表達(dá)水平

采用RT-PCR測(cè)定TE1細(xì)胞轉(zhuǎn)染miRNA25-mimic/inhibitor后，cyclin E1和CDK2的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果顯示，過表達(dá)miRNA-25后，cyclin E1和CDK2的mRNA表達(dá)水平顯著增加，而沉默miRNA-25后，兩者的表達(dá)降低，兩者與空白對(duì)照組相比均具有顯著差異(P<0.05)，見圖7。

討論

食管癌是一種人類常見的消化道惡性腫瘤，在我國(guó)，食管癌主要表現(xiàn)為食管鱗狀細(xì)胞癌。以太行山周邊的河北、河南，以及廣東的部分地區(qū)為高發(fā)地區(qū)[6]。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)食管鱗狀細(xì)胞癌患者的臨床樣本進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)癌變組織中miRNA-25的表達(dá)水平顯著高于癌旁組織和正常食管黏膜組織，表明miRNA-25在食管鱗狀細(xì)胞癌中呈高表達(dá)。再者，通過對(duì)臨床收集的正常食管黏膜組織、正常鼻咽黏膜組織、正常胃黏膜組織、正常腸黏膜組織、正常卵巢組織樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常食管黏膜組織中的miRNA-25的表達(dá)高于實(shí)驗(yàn)中的其他組織，正常鼻炎黏膜組織和正常腸黏膜組織中幾乎不表達(dá)，提示miRNA-25在食管組織中具有特異性的表達(dá)，可作為治療食管鱗狀細(xì)胞癌的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。

Figure 5.The cell cycle of the TE1 cells transfected with miRNA-25-mimic/inhibitor analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCon.

圖5TE1細(xì)胞的細(xì)胞周期變化

Figure 6.The protein expression of cyclin E1 and CDK2 in the TE1 cells transfected with miRNA-25-mimic/inhibitor. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCon.

圖6Cyclin E1和CDK2的蛋白表達(dá)水平

Figure 7.The mRNA expression of cyclin E1 and CDK2 in the TE1 cells transfected with miRNA-25-mimic/inhibitor. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsCon.

圖7Cyclin E1和CDK2的mRNA表達(dá)水平

miRNA是一類內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，通過與特定的mRNA分子的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)相作用，從而調(diào)節(jié)相應(yīng)蛋白翻譯的過程來調(diào)控基因表達(dá)。在不同的組織器官中，miRNAs的表達(dá)具有明顯差異，提示miRNA可能參與調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)[7-8]。本實(shí)驗(yàn)建立過表達(dá)/沉默miRNA-25的人食管鱗狀細(xì)胞細(xì)胞株TE1，采用CCK-8法和BrdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染miRNA-25-mimics/inhibitor后TE1細(xì)胞的增殖情況，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miRNA-25的TE1細(xì)胞增殖率隨時(shí)間增加而明顯增加，顯著高于空白對(duì)照組，沉默miRNA-25的TE1細(xì)胞增殖率雖然隨時(shí)間增加而增加，但顯著低于空白對(duì)照組，表明過表達(dá)miRNA-25使得TE1細(xì)胞的增殖加快，可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)展有一定的相關(guān)性。

細(xì)胞增殖周期由cyclin、CDK和CDK抑制因子(CDK inhibitor,CKI)共同調(diào)節(jié)。細(xì)胞的分裂與分化主要發(fā)生在G1期，cyclin E1在細(xì)胞分裂G1期轉(zhuǎn)換至S期的過程中作為調(diào)控因子[9]，當(dāng)細(xì)胞受到生長(zhǎng)信號(hào)刺激時(shí)，產(chǎn)生視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤基因蛋白(pRb)磷酸化，釋放出核轉(zhuǎn)錄因子E2F，促使細(xì)胞完成DNA復(fù)制[10]，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖[11]。而在國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)臨床試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中長(zhǎng)檢測(cè)到cyclin E1蛋白過表達(dá)以及基因擴(kuò)增[12-13]。李麗等[14]研究在食管上皮癌變過程中細(xì)胞周期調(diào)控因子的表達(dá)時(shí)，發(fā)現(xiàn)cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA陽性表達(dá)率逐漸上升。本實(shí)驗(yàn)采用免疫印跡法和RT-PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染miRNA-25-mimics/inhibitor TE1細(xì)胞后，細(xì)胞周期調(diào)控因子cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表達(dá)水平，并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后TE1細(xì)胞的細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，過表達(dá)miRNA-25后，TE1細(xì)胞中cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著增加，G0/G1期細(xì)胞數(shù)所占百分比明顯減少，S期細(xì)胞數(shù)所占百分比明顯增加，提示過表達(dá)miRNA-25可加快TE1細(xì)胞的增殖；而沉默miRNA-25后，TE1細(xì)胞中cyclin E1和CDK2的蛋白和mRNA表達(dá)水平均顯著降低；G0/G1期細(xì)胞數(shù)所占百分比明顯增加，S期細(xì)胞數(shù)所占百分比明顯減少，提示沉默miRNA-25可減緩TE1細(xì)胞的增殖。TE1細(xì)胞增殖的加速，可引起食管鱗狀細(xì)胞癌的迅速惡化，擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移，提示miRNA-25的高表達(dá)可能與食管鱗狀細(xì)胞癌的發(fā)生有關(guān)，可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的過度增殖，最終產(chǎn)生惡化遷移。但其確切機(jī)制還需進(jìn)一步深入的研究。

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(責(zé)任編輯：盧萍， 羅森)