黏膜免疫佐劑的篩選Ⅱ.ELISA檢測(cè)

王衛(wèi)紅++孫斌

摘要：以雞新城疫為模型，用ELISA法檢測(cè)SPF雛雞對(duì)左旋咪唑、霍亂毒素B亞單位（CT-B）、白細(xì)胞介素-2（IL-2）、明礬、蜂膠等黏膜免疫佐劑的血清學(xué)應(yīng)答。結(jié)果表明，霍亂毒素B亞單位佐劑新城疫疫苗使雛雞分泌產(chǎn)生的IgA最多，與其他組的差異顯著（P<0.05）；血清和外分泌液中抗體含量較高，差異極顯著（P<0.01）。

關(guān)鍵詞：黏膜免疫；佐劑；疫苗

中圖分類號(hào)：S858.275.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1007-273X（2015）11-0009-02

1 材料與方法

1.1 材料

1日齡SPF雛雞80只，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF動(dòng)物室提供。

酶標(biāo)反應(yīng)板、ELISA檢測(cè)儀、5～50μL八道微量移液器。

霍亂毒素B亞單位購(gòu)于Sigma公司，白細(xì)胞介素-2和蜂膠由本校產(chǎn)科教研室提供，左旋咪唑和明礬購(gòu)于北京化學(xué)試劑公司（分析純）。雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)抗原由本校微生物教研室提供，新城疫V4（NDV4）弱毒苗由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所生產(chǎn)，雞新城疫強(qiáng)毒由哈爾濱獸醫(yī)研究所禽病室提供（F4 819，LD50=1 000）、H2O2、DAB、H2SO4、pH 7.4 PBST、pH 9.6碳酸緩沖液。

SP-9001型試劑盒（正常山羊血清工作液、生物素標(biāo)記羊抗兔IgG工作液、辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液），兔抗雞IgA、兔抗雞IgG、兔抗雞IgM由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系提供。

1.2 方法

1日齡SPF雛雞80只隨機(jī)平均分為8組，即CT-B佐劑組、左旋咪唑佐劑組、白細(xì)胞介素佐劑（1 000 IU/只）組、白細(xì)胞介素佐劑（100 IU）組、明礬佐劑組、蜂膠佐劑組、普通免疫組和非免疫組。14日齡點(diǎn)眼免疫。29日齡采取血清學(xué)材料后進(jìn)行攻毒試驗(yàn)。

23日齡時(shí)，對(duì)各組雛雞進(jìn)行翅下采血0.5～1.0 mL，保存于1.5 mL的微型離心管內(nèi)，室溫靜置12 h或在37 ℃恒箱內(nèi)30 min析出血清，對(duì)沒有析出血清的標(biāo)本可進(jìn)行離心提取。用氨水刺激的方法收集淚液[1]。

ELISA檢測(cè)用間接ELISA法[2]。各組ELISA檢測(cè)值多元統(tǒng)計(jì)分析檢驗(yàn)。

在哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心禽病感染室做攻毒試驗(yàn)。攻毒劑量為1 mL（原毒液1 000倍稀釋）。

2 結(jié)果與分析

2.1 ELISA檢測(cè)

由表1可知，CT-B組淚液中IgA、IgG、IgM均高于其他各組，差異顯著（P<0.05）。由表2可知，CT-B組血液中IgA、IgG、IgM均高于其他各組，差異極顯著（P<0.01）。

2.2 新城疫強(qiáng)毒攻擊試驗(yàn)

30日齡時(shí)，用新城疫強(qiáng)毒攻擊后3天，非免疫組SPF雛雞開始發(fā)生死亡，經(jīng)5天非免疫組雛雞全部死亡。普通免疫組死亡1只。

3 小結(jié)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)各組雛雞血清、淚液的ELISA檢測(cè)結(jié)果，霍亂毒素B亞單位佐劑新城疫疫苗使雛雞外分泌產(chǎn)生的IgA最多，與其他組的差異顯著（P<0.05）；血清中抗體含量較高，差異極顯著（P<0.01）。這表明CT具有很強(qiáng)的黏膜佐劑作用，能誘導(dǎo)強(qiáng)烈的黏膜和系統(tǒng)免疫。但CT的黏膜佐劑機(jī)制以及CT與口服耐受的關(guān)系等有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)闡明。隨著微生物學(xué)、免疫學(xué)和分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，可以成為動(dòng)物黏膜免疫的重要佐劑，從而將具有良好的研究應(yīng)用價(jià)值[3，4]。

CT的強(qiáng)毒性使其應(yīng)用受限。作為未來(lái)的黏膜免疫佐劑，應(yīng)該是無(wú)毒副作用、高效且廣譜。CTB在一些試驗(yàn)中雖取得一定的效果，但其結(jié)果卻高度不一致，這可能與其較差的穩(wěn)定性有關(guān)，其可以被惡劣的腸道環(huán)境所降解，因此B亞基經(jīng)口給藥時(shí)不是一種很有效的佐劑。而A亞基的存在，包括其無(wú)毒突變體都可以增強(qiáng)CTB五聚物的穩(wěn)定性。所以當(dāng)前CT的研究主要是構(gòu)建減毒突變體及嵌合體，目的是使其保持一定的酶活性而獲得足夠的佐劑活性，同時(shí)酶活性又不至于對(duì)動(dòng)物體產(chǎn)生明顯的毒副作用[4，5]。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫 斌，高齊瑜，王彩虹.雞結(jié)膜結(jié)合淋巴組織（CALT）對(duì)新城疫疫苗點(diǎn)眼的免疫應(yīng)答[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1997，28（3）：245-250.

[2] 黃金海，劉業(yè)兵，丁伯良，等.間接ELISA法檢測(cè)雞新城疫抗體[J].中國(guó)獸藥雜志，2005，39（6）：22-26.

[3] 范春玲，孫斌，任鳳蘭.黏膜免疫佐劑的篩選I.組織學(xué)與免疫組織化學(xué)研究[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2008，44（7）：27-28.

[4] 任學(xué)毅，金勇豐，朱成鋼，等.霍亂毒素B亞單位的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2003，38（12）：897-900.

[5] 郝海霞，李潤(rùn)花，殷國(guó)榮.霍亂毒素作為黏膜佐劑的研究進(jìn)展[J].中國(guó)病原生物學(xué)雜志，2012，7（1）：70-74.