針刺對(duì)血管性癡呆大鼠Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

針刺對(duì)血管性癡呆大鼠Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

鹿俊磊,頓玲露,盧昌均,曾鑒源,吳玉芬,王少洲,徐榛,趙世亮

(柳州市中醫(yī)院，柳州 545001)

摘要：目的探討針刺對(duì)血管性癡呆大鼠血清中Bax和Bcl-2表達(dá)的影響。方法將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和針刺組。間斷夾閉頸總動(dòng)脈法建立VaD模型，Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)模型是否成功，酶聯(lián)免疫吸附法分析(ELISA)檢測(cè)血清中Bax和Bcl-2的含量。結(jié)果針刺治療后Bax表達(dá)較模型組〔(410.176±65.942) pg/mL比(612.353±92.554) pg/mL〕下降(P<0.01),Bcl-2較模型組表達(dá)〔(275.509±60.833) pg/mL比(119.246±20.562) pg/mL〕明顯升高(P<0.01)。結(jié)論針刺可通過上調(diào)大鼠Bcl-2水平,下調(diào)Bax表達(dá)，對(duì)抗腦缺血所致的細(xì)胞凋亡，防止繼發(fā)性損傷，達(dá)到促進(jìn)神經(jīng)修復(fù)的作用。

關(guān)鍵詞：針刺；血管性癡呆；Bax蛋白；Bcl-2蛋白；大鼠

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.026

中圖分類號(hào)：R259文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1003-5699(2015)08-0841-03

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然基金地區(qū)科學(xué)基金(81160472)；廣西自然科學(xué)基金(2012GXNSFAA053165)；廣西中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)研究課題(P2012109、P2012107);柳州市科技創(chuàng)新能力與條件建設(shè)項(xiàng)目(2013F010401)。

作者簡(jiǎn)介:鹿俊磊(1981-)，男，碩士研究生，主治醫(yī)師，主要從事中西醫(yī)結(jié)合治療腦血管病的基礎(chǔ)與臨床研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：趙玉芝2014-12-03)

*通信作者:頓玲露，電話-(0772)5357192，電子信箱-lingluhome@aliyun.com

Effect of Needling on Bax/Bcl-2 signaling pathway of rats with vascular dementia

LU Junlei,DUN Linglu,LU Changjun,ZENG Jianyuan,WU Yufen,WANG Shaozhou,XU Zhen,ZHAO Shiliang

(Liuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine,Liuzhou 545001,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the role of needling affect to expression of Bax and Bcl-2 of the rats after vascular dementia (VaD).MethodsThe rats were randomly divided into sham operation group,VaD model group and Needling treatment group.The rat model of VaD was built by intermittently clipping common carotid artery.Morris water maze test whether the surgery had been successful and detection the changes of Bax and Bcl-2 by Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsBax expression (410.176±65.942) pg/mL compare (612.353±92.554) pg/mL decreased after acupuncture treatment (P<0.01),the Bcl-2 expression (275.509±60.833) pg/mL compares (119.246±20.562) pg/mL increased significantly,Bax/Bcl-2 ratio decreased compared with model group (P<0.01).ConclusionThe acupuncture therapy on vascular dementia maybe related to up-regulated the expression of Bcl-2 protein in rat and decreased Bax protein expression thus regulate anti-apoptotic effect and promotes neurological function recovery in cerebral ischemia injury and prevent secondary injury,to promote the role of nerve repair.

Keywords:needling;vascular dementia;Bax;Bcl-2;rat

血管性癡呆(vascular dementia,VaD)是由一系列腦血管疾病(包括缺血性卒中和出血性卒中)引起的腦功能障礙，表現(xiàn)為患者的認(rèn)知能力，學(xué)習(xí)記憶力，判斷和計(jì)算能力減退,核心癥狀為獲得性智能障礙[1]。隨著人口的老齡化，我國(guó)血管性癡呆的發(fā)病率呈上升趨勢(shì)，據(jù)統(tǒng)計(jì)[2]，65歲以上老年人群中，各種類型的癡呆發(fā)生率為4.5%，其中血管性癡呆占20%，成為僅次于阿爾茲海默病的第二大癡呆類型。有研究指出，VaD是目前唯一可以通過早期干預(yù)手段防治的癡呆類型[3]。但由于其發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，目前仍缺乏有效的治療手段[4]。因此，認(rèn)識(shí)VaD的發(fā)病機(jī)理，探討預(yù)防和治療其發(fā)生發(fā)展的有效途徑，是當(dāng)前血管性癡呆研究領(lǐng)域的重要內(nèi)容。

Bcl-2和Bax是Bcl-2家族成員中的一對(duì)凋亡調(diào)控基因。Bcl-2是抗凋亡基因,可阻止許多因素所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,而Bax是促凋亡基因，二者的比例是決定細(xì)胞是否發(fā)生凋亡的重要調(diào)控因素。多項(xiàng)研究表明，抑制細(xì)胞凋亡是VaD防治的重點(diǎn)[5]。在細(xì)胞凋亡的基因調(diào)控過程中，Bcl-2家族成員起著至關(guān)重要的作用[6]。針灸治療VaD是當(dāng)前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和方向,但是其作用規(guī)律和內(nèi)在機(jī)制尚未十分清楚。本研究通過針刺VaD動(dòng)物模型，探討其改善VaD學(xué)習(xí)記憶機(jī)制，為針灸治療VaD提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SCXK(桂)2009-0002]；“華佗牌”不銹鋼針，30號(hào)0.5寸毫針；Bcl-2酶聯(lián)免疫(Rat cAMP ELISA KIT)試劑盒(批號(hào)：201405)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；Bax酶聯(lián)免疫(Rat PKA ELISA KIT)試劑盒(批號(hào)：201406)購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(DG5033A型，南京華東電子集團(tuán)醫(yī)療裝備有限責(zé)任公司)。

1.2動(dòng)物模型制備根據(jù)Olsson[7]法間歇性?shī)A閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈，形成VaD動(dòng)物模型。應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)確認(rèn)模型制作效果。

1.3針灸取穴操作參照全國(guó)針灸學(xué)會(huì)實(shí)驗(yàn)針灸研究會(huì)制定的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位圖譜”，選取百會(huì)、大椎、水溝；百會(huì)穴向內(nèi)后方斜刺，大椎直刺水溝穴向鼻根部斜刺；留針30 min，留針其間行針2次，行針手法用平補(bǔ)平泄手法，每次30 s，1次/d，連續(xù)4周。

1.4水迷宮測(cè)試Morris水迷宮檢測(cè)分為定向航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)2個(gè)階段。通過自動(dòng)錄像系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)：記錄大鼠在搜索平臺(tái)的路線圖和對(duì)目標(biāo)區(qū)域的穿越次數(shù)。

1.5分組及治療將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、針刺組，每組10只。造模成功后，針刺組開始針刺,1次/d，模型組、假手術(shù)組不予針刺治療，但與針刺組在同一時(shí)間、相同程度的捉抓刺激。持續(xù)15 d后，收集大鼠的血液，離心分離血清，分裝并放置于-80 ℃的冰箱中備用。

1.6測(cè)定Bax和Bcl-2含量按照ELISA法試劑盒說明操作，以450 nm波長(zhǎng)測(cè)吸光度(OD值)，以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的OD值計(jì)算出相應(yīng)的濃度。

2結(jié)果

針刺干預(yù)治療后大鼠血清Bax水平與假手術(shù)組比較,模型組Bax含量明顯升高(P<0.01)。針刺組與模型組比較，Bax含量有顯著性差異(P<0.01)；針刺干預(yù)治療后，模型組Bcl-2與假手術(shù)組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較，針刺組Bcl-2含量明顯升高(P<0.01)，見表1。

表1治療后大鼠血清Bax水平和Bcl-2水平

pg/mL

注：與假手術(shù)組比較，#P<0.01;與模型組比較，△P<0.01

3討論

VaD屬于中醫(yī)“呆病”“郁證”“文癡”“健忘”等范疇。目前認(rèn)為血管性癡呆具有潛在的可防治性，亦被稱為“可逆性癡呆”，因此，早期發(fā)現(xiàn)和預(yù)防具有重要的社會(huì)和醫(yī)學(xué)意義。近年來針刺治療VaD的方法日趨增多,其療效也得到了初步的肯定。本課題組在臨床上長(zhǎng)期運(yùn)用針刺治療VaD，取得了良好的治療效果。中醫(yī)認(rèn)為督脈為陽(yáng)脈之海,元神之府，行于脊里，上行入腦。考慮到督脈與腦以及記憶功能的關(guān)系密切性，在取穴時(shí)多取督脈穴位，其中，百會(huì)、大椎、水溝均是益智要穴，也是臨床上最為常用的一組穴位，因此，我們選用以上3個(gè)穴位作為代表穴位。

研究顯示，在腦血管疾病發(fā)生后，腦組織中神經(jīng)元凋亡現(xiàn)象的過度產(chǎn)生能很大程度上加劇腦損傷，引起一系列機(jī)體正常生理功能障礙和喪失[8]。Bcl-2蛋白是一種由可以對(duì)抗細(xì)胞凋亡現(xiàn)象發(fā)生的凋亡調(diào)控基因[9]合成的蛋白，主要分布在線粒體外膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和核周膜[10]，Bcl-2可以抑制各種機(jī)體病理學(xué)損傷所引起的靶細(xì)胞凋亡，是具有調(diào)節(jié)線粒體膜的通透性,維持線粒體膜電位正常狀態(tài)，抑制CytC和Caspase活性功能的關(guān)鍵蛋白[11]。Bax蛋白作為線粒體膜上離子通道的組成成分,能促進(jìn)CytC穿過線粒體膜，激活Caspases-9，并進(jìn)一步激活Caspases-3，發(fā)揮促進(jìn)凋亡的作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡現(xiàn)象的發(fā)生[12]。研究發(fā)現(xiàn)，這兩類基因表達(dá)的比率決定細(xì)胞的生存或凋亡，而抑制Bax通道可以降低缺血再灌注損傷神經(jīng)元凋亡[13],也表明Bcl-2蛋白家族參與了腦缺血再灌注損傷的發(fā)生發(fā)展，腦缺血時(shí)細(xì)胞凋亡主要出現(xiàn)于缺血半暗區(qū)，與腦梗塞體積大小有著密切關(guān)系[14]，因此針刺能促進(jìn)微血管的新生和病灶側(cè)支循環(huán)的建立，改善缺血性半暗帶的腦血流[15]，抑制 Bax的促凋亡作用，降低缺血再灌注區(qū)的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的存活。

本研究結(jié)果顯示:模型組大鼠血清中Bax表達(dá)較假手術(shù)組明顯升高，Bcl-2表達(dá)無(wú)顯著性差異,Bax/Bcl-2比值增高，表明模型成功，凋亡機(jī)制被激活。針刺治療后Bax表達(dá)較模型組下降，Bcl-2表達(dá)明顯升高，Bax/Bcl-2比值降低。表明:針刺一方面可下調(diào)VaD大鼠血清中促凋亡基因Bax表達(dá)、上調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá),從而減少細(xì)胞凋亡的進(jìn)一步發(fā)生，通過防止繼發(fā)性損害，達(dá)到改善預(yù)后的目的。

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