川芎嗪對PGcABCG-2蛋白影響的研究

川芎嗪對PGcABCG-2蛋白影響的研究

楊棟1，張培彤1*，王耀焓1，郭秀偉1，馬雪曼2

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤科,北京 100053；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029)

摘要：目的研究川芎嗪對肺癌PG-BE1干細胞樣細胞ABCG-2蛋白表達的影響。方法采用無血清成球培養(yǎng)法分選PG-BE1中的干細胞樣細胞亞群，并檢驗其干性,采用MTT法檢測PG-BE1干細胞樣細胞與原代細胞對常用化療藥的耐藥性。采用Western blot法檢測PG-BE1干細胞樣細胞與原代細胞ABCG-2蛋白表達及不同濃度川芎嗪對ABCG-2蛋白表達的影響。結(jié)果PG-B1干細胞樣細胞的干細胞相關(guān)蛋白表達及克隆灶形成數(shù)目與原代細胞差異有統(tǒng)計學(xué)意義；PG-BE1干細胞樣細胞化療藥耐藥性強于原代細胞；PG-BE1干細胞樣細胞ABCG蛋白表達高于原代細胞；川芎嗪對ABCG蛋白的表達有抑制作用。結(jié)論無血清成球培養(yǎng)法可有效富集PG-BE1干細胞樣細胞，PG-BE1干細胞較其原代細胞有更強的耐藥性，這可能與其高表達ABCG-2蛋白有關(guān),川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞ABCG-2蛋白有抑制作用。

關(guān)鍵詞：細胞耐藥;肺癌干細胞;ABCG-2;川芎嗪

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.08.024

中圖分類號：R273文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1003-5699(2015)08-0833-04

基金項目:國家自然科學(xué)基金面上項目(81173450)；國家自然科學(xué)基金青年項目(81302963)。

作者簡介:楊棟(1985-)，男，博士研究生，醫(yī)師，主要從事肺癌血瘀證研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：趙玉芝2014-03-06)

*通信作者:張培彤，電話-13910678101，電子信箱-zhangpeitong@sohu.com

Study on the effect of TMP on the expression of PGcABCG-2 protein

YANG Dong1,ZHANG Peitong1*,WANG Yaohan1,GUO Xiuwei1,MA Xueman2

(1.Department of Oncology,Guang’anmen Hospital,China Academy of Chinese Medical Science,Beijing 100053,China;

2.Beijing University of Chinese Medicine,Beijing 100029,China)

Abstract:ObjectiveTo study on the effect of TMP,which is the effective composition of Chuanxiong,on the expression of ABCG-2 protein of high metastatic human lung cancer(PG-BE1) cells.MethodsFirst of all,we sort the cancer stem cell(CSC) subgroup from the high metastatic human lung cancer cells(PG-BE1) by serum free sphere culture method and examine the properties of stem cells.MTT is used to exam the resistance to common chemotherapy medicine of the PG-BE1 CSC like cells and parental cells. Then we use the western blot experiment to verify the expression of ABCG-2 protein in the PG-BE1 CSC like cells and parental cells and the influence of different concentration of TMP on the expression of ABCG-2 protein.ResultsThe number of clone formation and the expression of CSC related protein show significant differences.PG-BE1 CSC cells have stronger chemotherapy resistance than parental cells.The expression of ABCG-2 protein is higher than parental cells.TMP can inhibit the expression of ABCG-2 protein.ConclusionThe serum free sphere culture method can effective enrich the CSC like cells and the PG-BE1 CSC like cells show stronger chemothrepy resistance than their parental cells.High expression of ABCG-2 protein may contribute to the themotherapy resistance.TMP can inhibit the expression of the ABCG-2 protein of PG-BE1 CSC like cells.

Keywords:chemotherapy resistance;lung cancer stem cells;ABCG-2;Ligustrazine

腫瘤多藥耐藥(multidrug resistance,MRD)是腫瘤化療失敗和療后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，逆轉(zhuǎn)MRD是增強化療療效和減少腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。關(guān)于MRD的產(chǎn)生，學(xué)者多從細胞藥物外排能力增強、細胞靶標(biāo)變異、DNA損傷修復(fù)能力增強及凋亡逃避等角度解讀。腫瘤干細胞(cancer stem cells,CSCs)是近年來被發(fā)現(xiàn)的腫瘤組織中含量極少但對腫瘤的發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等起關(guān)鍵作用的細胞亞群，因CSCs具有高表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白、多處于靜息期、DNA損傷修復(fù)能力強、高表達凋亡抑制基因等生物學(xué)特性，使其在細胞耐藥方面體現(xiàn)出優(yōu)勢，因而被認為是腫瘤MRD的關(guān)鍵，靶向殺傷CSCs有望有效逆轉(zhuǎn)MRD。

1材料

高轉(zhuǎn)移性人巨細胞肺癌細胞PG-BE1，由中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院腫瘤研究室提供。Human FGF-basic：美國Pepro Tech公司，貨號：AF-100-18B;Human EGF：美國Pepro Tech公司，貨號：AF-100-15;B27 Supplement(50×):美國Gibco公司，貨號：7504-044；MTT：美國Sigma公司，貨號：M2128；OCT-4 antibody：美國CST公司，貨號：2750;SOX-2 antibody：美國CST公司，貨號：3579;Nanog antibody:美國CST公司，貨號：4893;β-Actin(13E5) Rabbit mAb:美國CST公司，貨號：4970；Anti-BCRP/ABCG2 antibody[BXP-21]:美國abcam公司，貨號：ab3380；Goat Anti-Rabbit IgG H&L(HRP)：美國abcam公司，貨號：ab97051;Goat F(ab’)2 polyclonal Secondary Antibody to mouse IgG+IgM+IgA-H&L(HRP):美國abcam公司，貨號：ab6006；鹽酸川芎嗪：中國藥品生物制品鑒定所，批號：110817-200305；順鉑(DDP)注射液：云南個舊生物藥業(yè)有限公司，批號：H53021740；紫杉醇注射液：北京協(xié)和藥廠，產(chǎn)品批號：130907；注射用鹽酸吉西他濱：江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司；產(chǎn)品批號：140105；凝膠成像分析系統(tǒng)：美國BIO-RAD公司；酶標(biāo)儀：美國BioTek公司，型號：SIAFRT SYNERGYHT。

2方法

2.1細胞培養(yǎng)與干細胞分選常規(guī)復(fù)蘇、培養(yǎng)PG-BE1細胞，待其進入指數(shù)生長期,胰酶消化后用PBS反復(fù)清洗3遍，重懸于含有1%雙抗、20 μg/L FGF、20 μg/L EGF、2% B27及5 μg/mL insulin的DMEM/F12培養(yǎng)基中，調(diào)整其濃度為2×104cells/mL，后接種于超低吸附6孔板中，每孔接種2 mL，待細胞成球且細胞球表面顏色變暗，折光度變低時收集細胞用于以下實驗。

2.2平板克隆形成實驗檢測PG-BE1成球細胞與原代細胞克隆形成能力收集PG-BE1原代細胞及成球細胞，消化后重懸于含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，調(diào)整其濃度為200 cells/mL，分別接種于6孔板中，每孔接種2 mL，置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 d，后棄去培養(yǎng)液，95%乙醇固定后行結(jié)晶紫染色,倒置顯微鏡下(40倍)觀察每孔隨機5個視野下超過10個細胞的克隆灶的數(shù)目。

2.3Western blot法檢測PG-BE1成球細胞與原代細胞OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表達收集PG-BE1原代細胞及成球細胞，提取細胞總蛋白，用BCA法測定各組總蛋白濃度，分別制備濃縮膠與分離膠，加樣后分別行蛋白電泳、電轉(zhuǎn)移,5%脫脂奶粉封閉后，一抗(稀釋倍數(shù)為1∶1 000)、二抗(稀釋倍數(shù)為1∶2 000)孵育各1 h，后于暗室中滴加超敏發(fā)光液孵育5 min，于凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用Quantity one軟件分析各組蛋白表達量。

2.4MTT法檢測PG-BE1原代細胞與干細胞樣細胞的化療藥耐藥性收集PB-BE1原代細胞及干細胞樣細胞，重懸于PBS緩沖液中，調(diào)整其濃度為5×104個/mL。上述兩種細胞均隨機分為順鉑組、吉西他濱組及紫杉醇組(各化療藥均設(shè)置高、中、低不同濃度)，各組細胞經(jīng)藥物干預(yù)后接種于96孔板中，每孔接種200 μL。培養(yǎng)48 h后向各孔內(nèi)加入5 mg/mL MTT溶液20 μL，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。吸出各孔中液體,向各孔加入DMSO 150 μL，于低速震蕩板上震蕩10 min后，于酶標(biāo)儀上490 nm處測得各孔吸光值，根據(jù)各孔吸光值，計算各組細胞生長抑制率。

細胞生長抑制率=[(對照組OD值-實驗組OD值)/對照組OD值]×100%

2.5Western blot法檢測PG-BE1原代細胞與干細胞樣細胞以及川芎嗪干預(yù)后PG-BE1干細胞樣細胞ABCG-2蛋白表達分別收集PG-BE1原代細胞、干細胞樣細胞(分常氧環(huán)境和低氧環(huán)境,低氧環(huán)境為5%O2、5%CO2、90%N2)以及經(jīng)高(500 μg/mL)、中(300 μg/mL)、低(100 μg/mL)濃度川芎嗪干預(yù)后的PG-BE1干細胞樣細胞，按2.3步驟行ABCG-2蛋白含量檢測。

2.6統(tǒng)計方法采用專業(yè)統(tǒng)計軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計，PG-BE1干細胞樣細胞與原代細胞的比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析,多組內(nèi)兩組間比較采用LSD檢驗。

3結(jié)果

3.1PG-BE1干細胞樣細胞分選接種后第3天，可見有小球體形成，隨培養(yǎng)時間延長，球體體積逐漸增大，至第6天時，細胞球球體顏色變暗，折光度降低。

注：圖A1為貼壁生長的PG-BE1細胞，圖A2-8分別為剛接種及1～6 d的干細胞球形成情況。 圖1　倒置顯微鏡觀察PG-BE1干細胞樣細胞形成(×200)

3.2PG-BE1干細胞樣細胞與原代細胞平板克隆形成實驗PG-BE1成球細胞與原代細胞的平板克隆灶形成數(shù)目分別為(3.94±1.06)個和(8.06±1.31)個，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，鏡下可見克隆灶呈散在分布，每個克隆灶由多個細胞組成，呈較規(guī)則的圓形。

注:圖B1為平板克隆形成實驗所用的6孔板，其中，上3孔為PG-BE1細胞，下3孔為PG-BE1 sphere細胞；圖B2為倒置顯微鏡下克隆灶形態(tài)(結(jié)晶紫染色法，×200) 圖2　PG-BE1干細胞樣細胞與原代細胞平板克隆形成實驗

3.3PG-BE1干細胞樣細胞與原代細胞OCT-4、SOX-2、Nanog蛋白表達PG-BE1成球細胞表面的干細胞相關(guān)表面標(biāo)志SOX-2、OCT-4、Nanog的表達均高于原代細胞(見圖3)，以原代細胞光密度值作為參照值，成球細胞SOX-2、OCT-4、Nanog的相對光密度值分別為(1.99±0.59)、(1.52±0.21)、(1.44±0.36)，2種細胞比較的P值分別為0.017、0.01、0.004。見圖3。

3.4PG-BE1干細胞樣細胞與原代細胞化療耐藥比較除48 h低濃度吉西他濱條件下，PG-BE1干細胞樣細胞與原代細胞的耐藥性(生長抑制率)無區(qū)別外(P=0.878)，在24,48，72 h的時間點上，PG-BE1干細胞樣細胞對DDP、吉西他濱、紫杉醇的耐藥性均強于其原代細胞(P<0.05)。

圖3　SOX-2、OCT-4、Nanog蛋白表達

3.5Western blot法檢測各組細胞ABCG-2蛋白表達常氧環(huán)境下培養(yǎng)的PG-BE1干細胞樣細胞的ABCG-2蛋白的表達高于PG-BE1原代細胞(P<0.001);不同濃度的川芎嗪及DDP對ABCG-2蛋白的表達有一定的抑制作用(P<0.05)，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見圖4。

注:圖E1為不同氧濃度下PG-BE1干細胞樣細胞及其原代細胞ABCG-2蛋白表達;圖E2為不同濃度川芎嗪對PG-BE1干細胞樣細胞ABCG-2蛋白表達影響。 圖4　不同組別ABCG-2表達

4討論

腫瘤化療耐藥是制約化療療效和療后復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素，探索化療耐藥機制及尋找逆轉(zhuǎn)化療耐藥藥物是腫瘤學(xué)研究的熱點。CSCs是具有異質(zhì)性的腫瘤組織中含量極少的一個細胞亞群，在腫瘤發(fā)生、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中起關(guān)鍵作用。近年來的研究表明，CSCs是引起化療耐藥的關(guān)鍵因素[1-2]，本研究中MTT實驗結(jié)果顯示，PG-BE1干細胞樣細胞在24，48，72 h對DDP、吉西他濱、紫杉醇的耐受性多強于其原代細胞，說明PG-BE1干細胞樣細胞相對于其原代細胞有更強的化療耐藥性，與絕大多數(shù)國內(nèi)外文獻所給出的結(jié)論一致。

CSCs具有耐藥性的原因之一在于高表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白，這已在肝癌[3]、卵巢癌[4]、鼻咽癌[5]、前列腺癌[6]、腎癌[7]等絕大多數(shù)人類惡性腫瘤中得到證實。ABC轉(zhuǎn)運蛋白利用ATP水解所釋放的能量將細胞中的藥物、代謝物、核苷酸、肽類、內(nèi)源性脂質(zhì)等物質(zhì)逆濃度梯度泵出胞外。依據(jù)ABC轉(zhuǎn)運蛋白能將進入細胞中的Hoechst33342等熒光染料排除出細胞的原理,可以將細胞系中高表達ABC轉(zhuǎn)運蛋白的細胞分選出來，即所謂的SP(side population,SP)細胞。進一步的研究證實，SP細胞多表達干細胞相關(guān)標(biāo)志[8]和具有干細胞生物學(xué)特性[9-10]，因而被認為是干細胞樣細胞。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)，PG-BE1干細胞樣細胞的ABCG-2蛋白的表達明顯高于其原代細胞，與上述文獻中的結(jié)論一致。

川芎嗪是常用活血藥川芎的有效成分，具有鈣離子通道阻滯活性，被認為有可能通過抑制ATP依賴的轉(zhuǎn)運蛋白的表達而有助于逆轉(zhuǎn)化療耐藥。魏志霞[11]研究發(fā)現(xiàn),川芎嗪對肝癌多藥耐藥細胞SMMC-7221/ADM的耐藥性有一定的逆轉(zhuǎn)作用，其逆轉(zhuǎn)耐藥作用可能與其抑制細胞表面多藥耐藥蛋白P-gp的表達下調(diào)，從而減少細胞毒性藥物外排有關(guān),類似的研究結(jié)論在卵巢癌[12]、乳腺癌[13]、惡性淋巴瘤[14]、胃癌[15]、結(jié)腸癌[16]等的研究中亦得到證實。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)不同濃度川芎嗪對ABCG-2的表達均有一定的抑制作用，不同濃度之間的抑制作用無差異，川芎嗪對ABC轉(zhuǎn)運蛋白的抑制作用可能會對腫瘤多藥耐藥產(chǎn)生一定的逆轉(zhuǎn)作用。

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