玄參水提物對(duì)CCL4所致大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用研究

玄參水提物對(duì)CCL4所致大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用研究

劉冠璋1，董婉茹1，于卉1，高鑫1，李自輝1，劉樹(shù)民1,2*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040；2.教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150040)

摘要：目的研究玄參水提物對(duì)四氯化碳(CCL4)所致大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。方法40只SD雄性大鼠隨機(jī)分為空白組，CCL4模型組，聯(lián)苯雙酯組，玄參水提物高，低劑量組。高、低劑量給藥組大鼠分別給予5.4，1.35 g/kg玄參水提取液灌胃，聯(lián)苯雙酯組大鼠給予0.2 g/kg混懸液灌胃,空白組及模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)7 d。末次給藥后1 h,除空白組腹腔注射10 mL/kg橄欖油外，其余各組按10 mL/kg劑量腹腔注射10%CCL4橄欖油溶液。腹腔注射CCL4后，禁食不禁水,24 h后稱重20%烏拉坦麻醉，腹主動(dòng)脈取血,并迅速摘取肝組織，觀察比較各組大鼠肝組織病理學(xué)變化及部分肝功能指標(biāo)的差異。結(jié)果玄參水提物能明顯降低肝損傷大鼠肝臟指數(shù)、ALT、AST活性及MDA含量,并且增強(qiáng)SOD和GSH-Px活性，同時(shí)對(duì)血清中TBiL活性具有一定的降低作用。結(jié)論玄參水提物對(duì)CCL4所致大鼠急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：玄參水提物；四氯化碳；肝損傷；丙二醛；超氧化物歧化酶

DOI:10.13463/j.cnki.jlzyy.2015.05.022

中圖分類(lèi)號(hào)：R575文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1003-5699(2015)05-0504-04

基金項(xiàng)目:國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃“973計(jì)劃”(2013CB531804)；黑龍江省高等學(xué)?？萍紕?chuàng)新團(tuán)隊(duì)——研究方向中藥藥性理論研究。

作者簡(jiǎn)介:劉冠璋(1990-)，男，碩士研究生，主要從事中藥藥性理論方面的研究。

收稿日期:(責(zé)任編輯：張瑞彬2014-12-31)

*通信作者:劉樹(shù)民，電話-(0451)82193278，電子信箱-keji-liu@163.com

Laria ningpoensis Hemsl.for CCL4-induced liver injury in rats

LIU Guanzhang1,DONG Wanru1,YU Hui1,GAO Xin1,LI Zihui1,LIU Shumin1,2*

(1.Heilongjiang University of Chinese Medicine,Harbin 150040,China;

2.Key Laboratory of North Medicine Basic and Applied Research,Ministry of Education,Harbin 150040,China)

Abstract:ObjectiveA study on the protective effect and the mechanism of aqueous extract of the Radix Scrophulariae for CCL4-induced liver injury in rats.Methods40 male SD rats were randomly divided into blank group,model group,bifendate pills group,high dose group and low dose group.The high and low dose groups were administered intragastrically with 5.4,1.35 g/kg,bifendate pills group were administered intragastrically with 0.2 g/kg suspension.While rats in the blank

and model groups were given the same volume normal saline,once a day for 7 days.One hour after the last administration,except for the blank group with olive oil solution 10 mL/kg,rats in the other groups were given 10% CCL4olive oil solution 10 mL/kg by intraperitoneal injection.After i.p.administration,forbid food but not water,weighing after 24 h,rats in all groups were anaesthetized with 20% urethane and the blood samples were obtained from abdonminal aorta,and samples of liver tissues were harvested rapidly.Observe and compared the changes of liver tissues pathology and the difference of partial liver function indices.ResultsQueous extract of the Radix Scrophulariae significantly decreased the liver index,the activities of ALT,AST and the content of MDA,increased the activities of SOD,GSH-Px,meanwhile,decreased the activities of TBiL in serum to some extent.ConclusionQueous extract of the Radix Scrophulariae has a significant protection effect on the liver injury induced by CCL4in rats.

Keywords:aqueous extract of the Radix Scrophulariae;carbon tetrachloride;liver injury;malondialdehyde;superoxide dismutase

玄參為玄參科植物玄參(ScrophuLarianingpoensisHemsl.)的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，列為中品，味甘、苦、咸，性微寒，歸肺、胃、腎經(jīng)。我國(guó)江南大部均有產(chǎn)出，其中以浙江出產(chǎn)的玄參為道地藥材，稱“浙玄參”。中藥玄參的化學(xué)成分主要為環(huán)烯醚萜類(lèi)、苯丙素苷類(lèi)、芳香糖苷類(lèi)等[2]。主要功效為涼血滋陰，瀉火解毒。臨床上常用其“清血分、營(yíng)分之邪熱”治療溫病熱入營(yíng)血，陰虛內(nèi)熱等證。另有記載玄參能夠“泄肝陽(yáng)”“滋肝木……明目”，中醫(yī)臨床上常用其養(yǎng)陰解毒的功效治療肝炎[3]。但是現(xiàn)代臨床并未將玄參治療肝臟疾病的作用作為其主要的臨床用途，故而本實(shí)驗(yàn)試圖通過(guò)CCL4建立大鼠急性肝損傷模型來(lái)初步探討中藥玄參對(duì)肝損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1實(shí)驗(yàn)材料

1.1儀器GLAMOUR 2000全自動(dòng)生化分析儀(北京華士信醫(yī)療設(shè)備有限公司)，AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，HHS型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，UVmini-1240紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(島津國(guó)際貿(mào)易上海有限公司)，KDC-160HR臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)，LEICA RM2255病理切片機(jī)(北京中儀光科科技發(fā)展有限公司)，玻璃勻漿器。

1.2藥材與試劑玄參飲片購(gòu)自黑龍江省藥材公司(批號(hào):20120623012)，經(jīng)黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與開(kāi)發(fā)教研室王振月教授鑒定為玄參科植物玄參(ScrophularianingpoensisHemsl.)的干燥根。聯(lián)苯雙酯由浙江萬(wàn)邦藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)(產(chǎn)品批號(hào)：20140204)。橄欖油購(gòu)于哈爾濱海浪科技有限公司?？捡R斯亮藍(lán)蛋白、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)試劑盒均購(gòu)自南京市建成生物工程研究所。實(shí)驗(yàn)中所用其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠40只，SPF級(jí)，雄性，體質(zhì)量(240±20) g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào)：SCXK(黑)2013-004。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)大鼠的使用和喂養(yǎng)嚴(yán)格遵照動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)所規(guī)定的有關(guān)條款。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1藥物的制備玄參干燥根經(jīng)適量粉碎后，等量分為6份，每份600 g。一煎10倍量水，二煎8倍量水，分別加熱回流提取各1.5 h，合并兩煎藥液，于低溫干燥機(jī)中凍干，得到6批質(zhì)地如羽毛狀輕軟、棕黃色的玄參凍干粉末(出膏率：49.76%)。

2.2實(shí)驗(yàn)分組及處置實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后隨機(jī)分為5組，每組8只，即:空白組，CCL4模型組，聯(lián)苯雙酯組，玄參水提物高、低劑量組。各組均在每日9：00-10：00按照10 mL/kg(體質(zhì)量)灌胃給予相應(yīng)的試劑，連續(xù)7 d，1次/d。其中玄參水提物高、低劑量給藥組大鼠分別給予5.4,1.35 g/kg玄參水提取液，聯(lián)苯雙酯組大鼠給予0.2 g/kg混懸液，空白組及CCL4模型組大鼠給予等體積生理鹽水。于末次給藥1 h后,除空白組腹腔注射10 mL/kg橄欖油外，其余各組按10 mL/kg劑量腹腔注射10%CCL4橄欖油溶液。腹腔注射CCL4后,各組均禁食不禁水，24 h后稱重,20%烏拉坦麻醉，由腹主動(dòng)脈取血，并迅速摘取肝組織留存?zhèn)錂z。

2.3血清及肝臟生化指標(biāo)的測(cè)定取血后，室溫靜置20 min，4 ℃，4 000 r/min離心10 min取上清液，于-80 ℃低溫保存用于ALT，AST，TBiL生化指標(biāo)測(cè)定。用冷生理鹽水盡可能去除肝臟殘留的血，濾紙吸干后稱重，計(jì)算肝臟指數(shù)。肝臟指數(shù)=肝質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。同一肝小葉上取1.00 g肝組織加9倍量冷生理鹽水于冰水浴上手動(dòng)勻漿制備10%肝組織勻漿,4 ℃,3 500 r/min離心10 min取上清用于肝組織中MDA，SOD，GSH-PX的測(cè)定，具體操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。剩余肝臟10%甲醛固定,送黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科做組織切片，進(jìn)行HE染色，在光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1玄參水提物對(duì)急性肝損傷大鼠肝臟指數(shù)的影響與空白組比較，CCL4模型組肝臟指數(shù)顯著性升高(P<0.01)，說(shuō)明CCL4可引起肝組織明顯腫大；與CCL4模型組比較,玄參水提物高、低劑量組肝臟指數(shù)均顯著性降低(P<0.01或P<0.05)；與聯(lián)苯雙酯組比較，玄參水提物高劑量組肝臟指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，低劑量組肝臟指數(shù)雖有降低趨勢(shì)，但差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)果表明,玄參水提物對(duì)CCL4所致大鼠急性肝損傷肝臟指數(shù)具有改善作用，且高劑量組更為明顯。結(jié)果見(jiàn)表1。

組別劑量/(g/kg)肝臟指數(shù)/%空白組 —3.04±0.10 CCL4模型組 —4.46±0.41▲▲ 聯(lián)苯雙酯組 0.23.40±0.20## 玄參水提物低劑量組1.353.99±0.32#△△玄參水提物高劑量組5.43.54±0.22##

注：與CCL4模型組比較，#P<0.05，##P<0.01;與聯(lián)苯雙酯組比較，△△P<0.01；與空白組比較，▲▲P<0.01

3.2玄參水提物對(duì)急性肝損傷大鼠血清ALT、AST及TBiL活性的影響與空白組比較,CCL4模型組大鼠血清中ALT、AST及TBiL顯著性升高(P<0.01)，說(shuō)明CCL4造模成功；與CCL4模型組比較，玄參水提物高、低劑量組大鼠血清中ALT、 AST均顯著性降低(P<0.01)，玄參水提物高、低劑量組大鼠血清中TBiL雖有降低趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與聯(lián)苯雙酯組比較，玄參水提物高劑量組大鼠血清中ALT、AST差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,低劑量組大鼠血清中ALT、AST差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但仍有降低趨勢(shì)，各組大鼠血清中TBiL均無(wú)顯著性差異。結(jié)果表明，玄參水提物對(duì)急性肝損傷大鼠血清中ALT、AST具有降低作用，且高劑量組效果更好。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　玄參水提物對(duì)CCL 4 所致大鼠急性肝損傷血清ALT、AST、TBiL的影響

注：與空白組比較，##P<0.01；與CCL4模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與聯(lián)苯雙酯組比較，▲P<0.05

3.3玄參水提物對(duì)急性肝損傷大鼠肝臟SOD、GSH-Px活力和MDA含量的影響與空白組比較，CCL4模型組大鼠肝臟中SOD活性顯著性降低(P<0.01)，MDA含量顯著性升高(P<0.01)，GSH-Px活性明顯降低(P<0.05)；與CCL4模型組比較，玄參水提物高劑量組SOD活性顯著性升高，MDA含量顯著性降低(P<0.01)，玄參水提物低劑量組SOD活性顯著性升高(P<0.01),GSH-Px活性明顯升高(P<0.05)；與聯(lián)苯雙酯組比較，玄參水提物高劑量組大鼠肝臟中SOD、GSH-Px活性及MDA含量差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,低劑量組大鼠肝臟中SOD、GSH-Px活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,MDA含量降低趨勢(shì)不明顯(P<0.05)。結(jié)果表明,玄參水提物對(duì)急性肝損傷大鼠肝臟中SOD、GSH-Px活性及MDA含量具有改善作用。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　玄參水提物對(duì)CCL 4所致大鼠急性肝損傷肝臟中SOD、GSH-Px活性及MDA含量的影響

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與CCL4模型組比較，△P<0.05，△△P<0.01；與聯(lián)苯雙酯組比較，▲P<0.05

3.4大鼠肝組織病理學(xué)研究

3.4.1肉眼觀察空白組大鼠肝臟顯紅褐色，質(zhì)軟而脆，邊緣圓頓,各肝小葉間無(wú)黏連。CCL4模型組大鼠肝臟有呈暗紅色或有呈黃褐色，質(zhì)地較韌，體積較大，表面附有蒼白色黏膜，與周?chē)K器黏連較嚴(yán)重，并伴有點(diǎn)狀壞死區(qū)域。玄參水提物低劑量組肝臟顏色偏暗，輕微質(zhì)韌，存在斑點(diǎn)斑塊。聯(lián)苯雙酯組和玄參水提物高劑量組肝臟形態(tài)介于空白組和玄參水提物低劑量組之間。

3.4.2光鏡觀察與空白組比較,CCL4模型組大鼠肝細(xì)胞大面積的空泡性壞死，小葉間動(dòng)靜脈充血，肝小葉結(jié)構(gòu)嚴(yán)重被破壞，匯管區(qū)及小葉內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。聯(lián)苯雙酯組肝細(xì)胞中度的空泡性壞死，竇狀隙內(nèi)有較多的紅細(xì)胞，血管周?chē)倭垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)CCL4所致大鼠急性肝損傷幾乎無(wú)保護(hù)作用。玄參水提物低劑量組情況皆差于聯(lián)苯雙酯組。玄參水提物高劑量組肝細(xì)胞發(fā)生輕度空泡性變形紅染，中央靜脈周?chē)溲獪p輕，肝小葉結(jié)構(gòu)清楚，血管周?chē)倭垦仔约?xì)胞浸潤(rùn)，肝組織病變明顯減輕。表明玄參水提物對(duì)CCL4所致大鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用，且高劑量組效果更好。

4結(jié)論

肝損傷是多因素參與的復(fù)雜過(guò)程，如改變質(zhì)膜的完整性、細(xì)胞內(nèi)離子濃度變化、自由基的作用、免疫變態(tài)反應(yīng)等都可引起肝損傷[4]。

動(dòng)物的肝臟指數(shù)與肝損傷呈正相關(guān)關(guān)系,是反映肝臟受損程度的客觀指標(biāo)[5]。血清中ALT和AST含量在一定程度上反映了肝細(xì)胞受損程度，是反映肝損傷的敏感且最常用的指標(biāo)[6]。當(dāng)肝臟受損時(shí)，由于肝臟處理及排泄間接膽紅素功能障礙，致使血液中的TBiL含量升高[7]。MDA是重要的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，MDA的含量可反映組織過(guò)氧化損傷程度，間接反映細(xì)胞的損傷情況[8]。SOD為高效的清道夫,可抑制自由基啟動(dòng)的脂質(zhì)過(guò)氧化，GSH-Px特異地催化還原性GSH對(duì)過(guò)氧化氫的還原反應(yīng)，起到保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整的作用[9]。SOD與GSH-Px不僅在活性上能協(xié)同作用，還能組成相互保護(hù)的防御群，更有效的清除機(jī)體內(nèi)自由基，保護(hù)細(xì)胞免遭氧化損傷，維持體內(nèi)代謝平衡[10]。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，玄參的氯仿粗提物極其所含的單體化合物，對(duì)硫代乙酰胺誘導(dǎo)的大鼠肝損傷均有較好的保護(hù)作用[11]。玄參中苯丙素苷對(duì)于受損肝細(xì)胞能明顯提高其存活率，降低肝衰竭大鼠的AST、ALT水平，對(duì)肝細(xì)胞損傷有較好的保護(hù)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了傳統(tǒng)意義上玄參水煎煮液對(duì)CCL4所致大鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，玄參水提物對(duì)CCL4所致大鼠急性肝損傷具有明顯的保護(hù)作用,能顯著降低肝損傷大鼠肝臟指數(shù)、ALT、AST活性及MDA含量，并且增強(qiáng)SOD和GSH-PX活性，同時(shí)對(duì)血清中TBiL活性具有一定的降低作用，其機(jī)制可能與阻止肝臟抗氧化酶活性降低，提高肝細(xì)胞清除自由基能力及抗脂質(zhì)過(guò)氧化作用相關(guān)，但其保肝活性成分及更深入的作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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