溫度對(duì)兩種不同蛋白源的對(duì)蝦配合飼料中黃曲霉毒素產(chǎn)生的影響

■王小瑞 申 亮 郭 冉 夏 輝 解 偉 王美雪

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北秦皇島066003）

凡納濱對(duì)蝦作為當(dāng)今我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量較高的品種之一，有著殼薄體肥肉鮮的優(yōu)點(diǎn)，具有豐富的營(yíng)養(yǎng)。作為養(yǎng)殖品種，具有廣溫廣鹽性和抗病能力強(qiáng)的特點(diǎn)。對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展在促進(jìn)沿海經(jīng)濟(jì)發(fā)展的同時(shí)，也促進(jìn)了對(duì)蝦飼料產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。對(duì)蝦養(yǎng)殖中配合飼料投喂的比例越來(lái)越大，高蛋白高脂肪的配合飼料極易產(chǎn)生霉菌毒素的污染。從配合飼料原料的角度出發(fā)，由于魚(yú)粉和魚(yú)油資源的短缺和價(jià)格的上漲，導(dǎo)致了植物蛋白和脂肪源的添加量不斷增加。常用的替代原料包括大豆、玉米、谷物和油料作物等。這些原料在生長(zhǎng)到變成原料的整個(gè)過(guò)程中都非常容易受到霉菌的污染；當(dāng)外界環(huán)境適宜時(shí)，這些霉菌就可快速增長(zhǎng)，并產(chǎn)生劇毒成分“霉菌毒素”。對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)受氣候、行情影響較大，飼料生產(chǎn)和利用不同步，商品料配合原料和工藝不同以及儲(chǔ)藏方法不當(dāng)，霉菌污染，繼而對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成影響。該行業(yè)的相關(guān)學(xué)者對(duì)霉菌毒素污染危害進(jìn)行大量的研究表明，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中影響較大的霉菌毒素主要有黃曲霉毒素、赭曲霉毒素A、單端孢霉烯毒素(嘔吐毒素和T2毒素)等。其中影響和危害最大的就是黃曲霉毒素(Aflatoxin，AFB1)，該物質(zhì)的產(chǎn)生受到多種因素的影響，包括霉菌生長(zhǎng)的基質(zhì)、儲(chǔ)存溫度、相對(duì)濕度和pH值等。除原料影響外，儲(chǔ)藏的濕度和溫度也是飼料中產(chǎn)生黃曲霉毒素的主要因素。黃曲霉毒素進(jìn)入動(dòng)物機(jī)體后，會(huì)造成肝臟發(fā)生組織學(xué)病變，主要表現(xiàn)為：肝臟變得蒼白、變脆以及膽管的上皮產(chǎn)生增生，肝臟變得腫大；另外，黃曲霉毒素還能對(duì)磷脂的合成以及膽固醇的合成產(chǎn)生抑制作用，影響脂類從肝臟的運(yùn)輸，從而使脂肪在肝臟中沉積，造成肝臟過(guò)多的脂肪累積浸潤(rùn)，產(chǎn)生肝臟肥大。另外，AFB1還能夠在動(dòng)物中造成免疫損傷，對(duì)于單核巨噬系統(tǒng)中的巨噬細(xì)胞，AFB1會(huì)造成其活性減弱，抑制其超敏性。若將微量的結(jié)晶的AFB1飼喂虹鱒、斑點(diǎn)叉尾鮰和鯉魚(yú)時(shí)，均能引起這些魚(yú)類的膽管增生，引發(fā)肝癌。給斑節(jié)對(duì)蝦投喂含不同濃度AFB1的飼料時(shí)，其肝臟的上皮細(xì)胞會(huì)發(fā)生萎縮，還伴隨有炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)與毒素作用時(shí)間和添加劑量相關(guān)。炎癥發(fā)生初期，肝小管管腔之間的間質(zhì)被血細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥進(jìn)一步發(fā)展會(huì)產(chǎn)生纖維變性及組織壞死。有報(bào)道指出，給蝦類投喂含有AFB1的飼料，不僅會(huì)對(duì)飼料轉(zhuǎn)化率和表觀消化率產(chǎn)生影響，同時(shí)還會(huì)影響蝦類的生長(zhǎng)、引起生理失調(diào)，肝胰腺組織的病變，影響生產(chǎn)性能，從而導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失。黃曲霉毒素不易被代謝排出體外，所以當(dāng)攝入含有毒素的飼料后，AFB1可能在水產(chǎn)動(dòng)物肌肉、臟器等器官或組織中累積，直接影響了對(duì)蝦產(chǎn)品安全。同時(shí)，受霉菌毒素污染的動(dòng)物抗病力下降，養(yǎng)殖戶為保證其正常生產(chǎn)，增加抗生素用量，這也提高了抗生素在對(duì)蝦產(chǎn)品中殘留的風(fēng)險(xiǎn)。研究?jī)?chǔ)存條件和飼料中易產(chǎn)生黃曲霉菌的原料對(duì)凡納濱對(duì)蝦飼料存儲(chǔ)過(guò)程中AFB1產(chǎn)生量的影響，為對(duì)蝦配合飼料的配方設(shè)計(jì)以及飼料儲(chǔ)存方面都有指導(dǎo)意義?？紤]到植物蛋白源可以顯著節(jié)約飼料成本，因此將試驗(yàn)對(duì)象定為以魚(yú)粉為主要蛋白源和以植物蛋白為主要蛋白源的兩種飼料，在不同儲(chǔ)存條件下儲(chǔ)存兩個(gè)月，研究飼料中黃曲霉毒素的產(chǎn)生量以及變化規(guī)律，為更好的儲(chǔ)存配合飼料提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

選取兩種蛋白源配比不同的凡納濱對(duì)蝦配合商業(yè)飼料，記為一號(hào)料和二號(hào)料，其中一號(hào)料以植物蛋白為主要蛋白源，二號(hào)料的主要蛋白源為魚(yú)粉，二者的蛋白營(yíng)養(yǎng)與其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)均達(dá)到對(duì)蝦生長(zhǎng)的需求量，對(duì)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)效果沒(méi)有顯著影響。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)一采用2×7雙因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，即儲(chǔ)存條件（A因素）和儲(chǔ)存時(shí)間（B因素），其中儲(chǔ)存條件（A因素）為2個(gè)水平，即室溫條件（參考試驗(yàn)地點(diǎn)當(dāng)?shù)貧鉁嘏c相對(duì)濕度，見(jiàn)表1）和模擬的實(shí)際儲(chǔ)存條件（溫度16℃，相對(duì)濕度50%條件下儲(chǔ)存30 d后移到溫度26℃，相對(duì)濕度50%的條件下儲(chǔ)存）；儲(chǔ)存時(shí)間（B因素）設(shè)7個(gè)水平，即0、10、20、30、40、50、60 d，每個(gè)處理三個(gè)重復(fù)。考察一號(hào)料中黃曲霉毒素B1的發(fā)生情況。

試驗(yàn)二采用與試驗(yàn)一相同的試驗(yàn)設(shè)計(jì)與處理，考察二號(hào)料中黃曲霉毒素B1的發(fā)生情況。

除分析單種飼料外，也將試驗(yàn)一與試驗(yàn)二結(jié)果進(jìn)行交叉分析，將相同儲(chǔ)存條件下的兩種配合飼料AFB1的累積量進(jìn)行比較，以此分析不同的蛋白配比對(duì)AFB1累積量的影響。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

檢測(cè)AFB1的試劑盒購(gòu)于上海佑隆生物科技公司，原理采用的是酶聯(lián)免疫吸附法。

表1 試驗(yàn)期間試驗(yàn)地點(diǎn)的氣溫

1.4 數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)結(jié)果采用“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)”表示，再進(jìn)行單因子方差分析(One-way ANOVA)，若組間差異顯著，再采用Duncan's多重比較法進(jìn)行多重比較，差異顯著性水平為P＜0.05，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)使用SPSS13.0分析軟件。

2 結(jié)果

2.1 不同儲(chǔ)存條件下一號(hào)料AFB1累積量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)（見(jiàn)圖1）

圖1 不同儲(chǔ)存條件下一號(hào)料AFB1累積量隨時(shí)間變化趨勢(shì)

在本試驗(yàn)期間范圍內(nèi)，所有試驗(yàn)飼料中黃曲霉毒素的含量均未超過(guò)國(guó)家限定的安全水平，飼料衛(wèi)生國(guó)標(biāo)中黃曲霉毒素 B1允許量：≤10 μg/kg（引自GB13078—2001），也未出現(xiàn)明顯的霉變形態(tài)，所以為保障飼料安全，本試驗(yàn)提高安全標(biāo)準(zhǔn)，暫取黃曲霉毒素累積量到達(dá)8 μg/kg的時(shí)間作為對(duì)比不同飼料和不同環(huán)境對(duì)飼料中AFB1累積影響的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

由圖1可知，對(duì)比一號(hào)料在不同的儲(chǔ)存條件下AFB1累積情況，一號(hào)料在試驗(yàn)期間內(nèi)AFB1的累積量不斷升高，不同的貯藏環(huán)境對(duì)其前30 d影響不大，但是當(dāng)試驗(yàn)溫度從16℃升到26℃的僅10 d里，飼料中AFB1的累積量迅速增加，在第30～40 d飼料中黃曲霉毒素的含量超過(guò)8 μg/kg，而在室溫下儲(chǔ)藏的飼料在40～50 d這個(gè)范圍內(nèi)才出現(xiàn)快速累積，含量超過(guò)8 μg/kg。

2.2 不同儲(chǔ)存條件下二號(hào)料AFB1累積量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)（見(jiàn)圖2）

圖2 不同儲(chǔ)存條件下二號(hào)料AFB1累積量隨時(shí)間變化趨勢(shì)

由圖2得到，對(duì)比二號(hào)料在不同的儲(chǔ)藏環(huán)境下AFB1累積情況，二號(hào)料并沒(méi)有因?yàn)?0～40 d的時(shí)候的溫度變化而受到過(guò)多影響，所以環(huán)境影響比較?。浑m然在試驗(yàn)期間黃曲霉毒素B1的積累量不斷增加，不過(guò)增長(zhǎng)速率緩慢，無(wú)論以哪種方式儲(chǔ)存，在第60 d的時(shí)候，飼料中黃曲霉毒素B1的積累量都沒(méi)有超過(guò)8 μg/kg。

2.3 室溫儲(chǔ)存條件下兩種飼料AFB1累積量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)（見(jiàn)圖3）

圖3 不同飼料AFB1累積量在室溫環(huán)境下隨時(shí)間變化趨勢(shì)

由圖3可知，兩種飼料在同樣的室溫環(huán)境下儲(chǔ)存，受到相同的環(huán)境因子的影響，其AFB1的累積量均呈上升趨勢(shì)。試驗(yàn)開(kāi)始前飼料中黃曲霉毒素的含量一號(hào)料要略低于二號(hào)料，在第20 d超過(guò)二號(hào)料。隨著試驗(yàn)進(jìn)行，黃曲霉毒素不斷累積，前30 d一號(hào)料的毒素累積速率要大于二號(hào)料；第30～40 d，一號(hào)料的黃曲霉毒素含量降低，二號(hào)料增加超過(guò)一號(hào)料；但是第40 d后一號(hào)料受環(huán)境影響黃曲霉毒素的含量迅速增加，累積量超過(guò)8 μg/kg，在試驗(yàn)結(jié)束的第60 d其含量達(dá)到9.31 μg/kg，接近國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的限定水平。二號(hào)料在試驗(yàn)結(jié)束累積量則只達(dá)到7.77 μg/kg。

2.4 16℃和26℃儲(chǔ)存條件下兩種飼料AFB1累積量隨時(shí)間的變化趨勢(shì)（見(jiàn)圖4）

由圖4得到，兩種飼料在16℃和26℃這種相同的變溫環(huán)境下儲(chǔ)藏，兩種飼料的黃曲霉毒素的累積情況區(qū)別于室溫環(huán)境下。一號(hào)料中黃曲霉毒素的累積速率快速增加，毒素含量在第30～40 d超過(guò)二號(hào)料，達(dá)到8.68 μg/kg，并持續(xù)增長(zhǎng)；在試驗(yàn)結(jié)束的第60 d達(dá)到9.28 μg/kg。二號(hào)料受溫度變化的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于一號(hào)料，雖持續(xù)增長(zhǎng)但在試驗(yàn)結(jié)束的第60 d僅達(dá)到7.97 μg/kg，處于安全水平。

2.5 兩種飼料在不同儲(chǔ)存條件下AFB1增長(zhǎng)速率（見(jiàn)圖5）

圖5 不同飼料在不同儲(chǔ)存環(huán)境下AFB1增長(zhǎng)速率

由圖5可知，從兩種飼料中AFB1累積的速率分析，一號(hào)料的毒素產(chǎn)生速率總體要快于二號(hào)料，而且一號(hào)料的毒素的產(chǎn)生速率受環(huán)境因素變化影響顯著，其中溫度對(duì)其影響最為明顯；二號(hào)料的毒素產(chǎn)生速率雖然沒(méi)有受到環(huán)境的顯著影響，但是50～60 d后AFB1的產(chǎn)生速率都顯著提高。

2.6 兩種不同品質(zhì)飼料在不同環(huán)境下綜合對(duì)比（見(jiàn)圖6）

圖6 兩種不同飼料在不同環(huán)境下綜合對(duì)比

由圖6可以看出，無(wú)論哪種儲(chǔ)存條件，長(zhǎng)達(dá)60 d的儲(chǔ)存時(shí)間均會(huì)使AFB1的累積量顯著增加。而室溫儲(chǔ)存下二號(hào)料的毒素累積量雖顯著增加但總體增加的速率較小，而在16℃和26℃的條件下，二號(hào)料即便是儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)達(dá)60 d也未顯示出顯著性差異。

2.7 儲(chǔ)存時(shí)間≥40 d后兩種飼料AFB1累積量在不同儲(chǔ)存條件下綜合對(duì)比（見(jiàn)圖7）

圖7 儲(chǔ)存時(shí)間≥40 d后兩種不同品質(zhì)飼料在不同儲(chǔ)存條件下綜合對(duì)比

在試驗(yàn)期中，兩種飼料中的黃曲霉毒素的累積量在前30 d幾乎沒(méi)有出現(xiàn)顯著差異。但由圖7可知，在第40 d的時(shí)候，處于16℃和26℃儲(chǔ)存條件下一號(hào)料的AFB1累積量顯著高于其他三組；第50 d的時(shí)候一號(hào)料兩種儲(chǔ)存條件下的AFB1累積量都顯著高于二號(hào)料；而對(duì)于二號(hào)料來(lái)說(shuō)，雖然隨著儲(chǔ)存時(shí)間的推移，AFB1的累積量增加，但是在通用的儲(chǔ)藏條件及時(shí)間里，可以保證處于安全水平。

3 討論

3.1 儲(chǔ)存條件對(duì)對(duì)蝦配合飼料中AFB1累積量的影響

針對(duì)一號(hào)料，試驗(yàn)結(jié)果顯示隨著時(shí)間的累積，兩種儲(chǔ)存條件下其AFB1的累積量均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，且儲(chǔ)存時(shí)間越久，AFB1的累積量差異性越顯著。但增加最快的時(shí)間點(diǎn)不同，在16℃和26℃這種條件下，則是在30～40 d的階段達(dá)到最快的累積速率，原因可能是因?yàn)榈?0 d后飼料轉(zhuǎn)移到26℃的環(huán)境下儲(chǔ)存，而26℃則是達(dá)到了黃曲霉菌的最佳產(chǎn)毒溫度，從而使得AFB1的累積量迅速增加；而在室溫條件下，飼料中的AFB1累積量在第40 d迅速增加，其毒素的累積速率在第50 d達(dá)到最大，結(jié)合試驗(yàn)地點(diǎn)溫度分析，溫度也是達(dá)到26℃，造成毒素的快速累積。加之降雨天數(shù)的增加，濕度變大，為霉菌的生長(zhǎng)創(chuàng)造了條件。同時(shí)，儲(chǔ)存40 d后一號(hào)料累積的黃曲霉毒素已達(dá)到8 μg/kg，接近飼料安全標(biāo)準(zhǔn)，屬于重度霉變。

針對(duì)二號(hào)料，試驗(yàn)結(jié)果同樣顯示兩種儲(chǔ)存條件下AFB1的累積量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，但增長(zhǎng)速率相對(duì)緩慢，且溫度變化較大時(shí)也不會(huì)對(duì)AFB1累積量有較明顯的影響。且儲(chǔ)存長(zhǎng)達(dá)60 d時(shí)，二號(hào)料中AFB1的累積量在7.77～7.97 μg/kg，并未達(dá)到試驗(yàn)設(shè)定的毒素上限值(8 μg/kg)，只是產(chǎn)生輕度霉變。

結(jié)合兩種料在不同儲(chǔ)存條件下的AFB1累積量和累計(jì)速率分析，儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)，飼料的毒素含量越高，累積量和累積速率受溫度的影響很大。有研究證實(shí)，對(duì)蝦產(chǎn)業(yè)受氣候、行情影響較大，飼料生產(chǎn)和利用不同步，儲(chǔ)藏方法不當(dāng)，會(huì)對(duì)飼料中霉菌含量造成影響，繼而影響霉菌的產(chǎn)生毒素的量。結(jié)合試驗(yàn)期氣候變化，室溫情況下是受高溫多雨氣候影響，AFB1的累積速率最快的時(shí)段的氣候情況與黃曲霉毒素多發(fā)地區(qū)的氣候相似。如我國(guó)南方特別是長(zhǎng)江中下游地區(qū)，每年受梅雨影響嚴(yán)重，氣溫高、濕度大，有利于霉菌生長(zhǎng)和產(chǎn)毒，因此污染程度要比北方地區(qū)更嚴(yán)重一些。當(dāng)儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)達(dá)40～50 d，毒素累積量和累積速率均顯著增加，不僅使飼料營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)下降，同時(shí)還有可能在對(duì)蝦體內(nèi)造成累積，對(duì)對(duì)蝦存活和生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。Bintvihok等在進(jìn)行了僅10 d后的試驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，低于20 μg/kg的AFB1飼料就足以對(duì)對(duì)蝦的肝胰腺的機(jī)能造成損傷，改變血淋巴正常的生化指標(biāo)。因此，做好對(duì)蝦配合飼料的儲(chǔ)存在實(shí)際生產(chǎn)中有重要的意義。

3.2 飼料成分對(duì)對(duì)蝦配合飼料中AFB1累積量的影響

在這兩種儲(chǔ)存條件下的試驗(yàn)結(jié)果顯示，一號(hào)料中AFB1的累積速率均顯著高于二號(hào)料，儲(chǔ)存時(shí)間越長(zhǎng)，差異越明顯。在累積速率大的同時(shí)，其累積量在第40 d后已經(jīng)超過(guò)試驗(yàn)設(shè)定的安全值8 μg/kg，已經(jīng)達(dá)到重度霉變的程度。而二號(hào)料在儲(chǔ)存時(shí)間長(zhǎng)達(dá)60 d時(shí)，其毒素累積量仍未達(dá)到8 μg/kg，只表現(xiàn)出輕度霉變。同時(shí)，在飼料儲(chǔ)存時(shí)間大于40 d的基礎(chǔ)上分析AFB1的累積量可以看出，無(wú)論何種儲(chǔ)存條件，一號(hào)料的毒素含量均顯著高于二號(hào)料，說(shuō)明飼料原料尤其是蛋白源對(duì)飼料中黃曲霉毒素的累積量影響顯著。有報(bào)道指出，飼料的成分是影響毒素產(chǎn)生的重要因素，一些植物蛋白（如花生粕和棉籽粕等），飼料原料更適合黃曲霉毒素產(chǎn)毒真菌的生長(zhǎng)和毒素的形成。同時(shí)，有研究表明，色氨酸能夠阻止黃曲霉毒素的產(chǎn)生，而酪氨酸對(duì)其有促進(jìn)作用。這可能也是造成一號(hào)料AFB1累積量高于二號(hào)料的原因，可能的原因是植物蛋白中色氨酸、賴氨酸等必需氨基酸的含量較低，而魚(yú)粉所含的必需氨基酸齊全，且蛋白含量高。以魚(yú)粉為主要蛋白源的二號(hào)料隨著儲(chǔ)存時(shí)間推移也會(huì)產(chǎn)生AFB1累積量的增加的現(xiàn)象，這可能與飼料中魚(yú)粉的過(guò)氧化值有關(guān)系。有研究指出，魚(yú)粉在儲(chǔ)存期間的過(guò)氧化值會(huì)隨時(shí)間增加，同時(shí)受溫度影響較大。氧化酸敗的飼料極易造成黃曲霉毒素的累積。但二號(hào)料中毒素累積量不斷增加，但幅度緩慢，且并沒(méi)有因?yàn)?0～40 d的時(shí)候的溫度變化而受到影響，同時(shí)其增長(zhǎng)速率較一號(hào)料低，這可能在一定程度上與黃曲霉菌所感染的底物有關(guān)。另外，二號(hào)料在儲(chǔ)存50～60 d后，其毒素速率明顯增加，可能是因?yàn)轱暳现械聂~(yú)粉是高油脂物質(zhì)，其水解性酸敗產(chǎn)生的游離脂肪酸會(huì)加劇脂肪的酸敗，進(jìn)而加速了魚(yú)粉的氧化酸敗，影響到黃曲霉毒素的產(chǎn)生，并且隨著飼料儲(chǔ)存的時(shí)間的延長(zhǎng)，飼料中油脂的抗氧化性能下降，一旦油脂開(kāi)始氧化，由于其是一個(gè)自身催化加速的過(guò)程，其速度便會(huì)成倍的增加。所以推測(cè)飼料在儲(chǔ)藏60 d后如不使用，也存在AFB1超標(biāo)可能。

4 結(jié)論

凡納濱對(duì)蝦配合飼料在從生產(chǎn)到銷售再到使用整個(gè)階段的儲(chǔ)存中，飼料中黃曲霉毒素B1的累積量隨時(shí)間的推移而增加，且時(shí)間越久其毒素累積速率越大。溫度變化較大的儲(chǔ)存條件對(duì)飼料的儲(chǔ)存存在一定的不利影響。當(dāng)凡納濱對(duì)蝦配合飼料中含有較高的植物蛋白源原料時(shí)，儲(chǔ)存過(guò)程中應(yīng)當(dāng)注意儲(chǔ)存的溫度與條件，溫度以不超過(guò)26℃為宜。盡管以魚(yú)粉作為蛋白源有一定的儲(chǔ)存優(yōu)勢(shì)，但儲(chǔ)存時(shí)間盡量保持在50 d之內(nèi)。

（參考文獻(xiàn)24篇，刊略，需者可函索）