NLRP3炎癥小體在早期動(dòng)脈粥樣硬化ZDF大鼠中的表達(dá)及阿托伐他汀的干預(yù)

研究報(bào)告

NLRP3炎癥小體在早期動(dòng)脈粥樣硬化ZDF大鼠中的表達(dá)及阿托伐他汀的干預(yù)

馬全鑫1，楊欽欽1，陸曄楓2，陳小真1，陳誠(chéng)1，壽旗揚(yáng)1，蔡月琴1，陳民利1

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究中心，杭州310053；2.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州225009)

【摘要】目的觀察NLRP3炎癥小體及其介導(dǎo)的炎癥因子在早期動(dòng)脈粥樣硬化(AS)Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠主動(dòng)脈組織中的表達(dá)，以及阿托伐他汀(ATV)的干預(yù)作用。方法高脂飼喂聯(lián)合小劑量多次注射VD3建立ZDF大鼠早期AS模型，并給予ATV干預(yù)；檢測(cè)血糖血脂、胰島素、ox-LDL和hsCRP，并進(jìn)行主動(dòng)脈組織病理學(xué)檢查和NLRP3、caspase 1、IL-1β和TNF-α基因表達(dá)的檢測(cè)。結(jié)果高脂飼喂后ZDF大鼠血糖、血脂、胰島素和ox-LDL水平均顯著上升(P<0.05)。注射VD3后，hsCRP水平均顯著上升(P<0.05)，主動(dòng)脈組織出現(xiàn)明顯的早期AS病變，且NLRP3、caspase 1、IL-1β和TNF-α基因表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，而ATV組ZDF大鼠血脂、ox-LDL和hsCRP水平均明顯下降(P<0.05)，AS病變程度減輕，且主動(dòng)脈組織中NLRP3、Caspase 1、IL-1β和TNF-α基因表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 NLPR3炎癥小體及其介導(dǎo)的炎癥因子參與了ZDF大鼠早期AS的炎癥反應(yīng)，而ATV可抑制NLRP3炎癥小體的表達(dá)，抑制AS的炎癥反應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】動(dòng)脈粥樣硬化；NLRP3炎癥小體；2型糖尿?。籞DF大鼠

[基金項(xiàng)目]浙江省自然科學(xué)基金(LY12C04002)。

[作者簡(jiǎn)介]馬全鑫(1988-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：中藥藥理與比較醫(yī)學(xué)，E-mail： mqx1025@hotmail.com。

[通訊作者]陳民利(1963-)，女，教授、碩士，研究方向：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，E-mail： cmli991@126.com。

【中圖分類(lèi)號(hào)】R33【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.001

Expression of NLRP3 inflammasome in early atherosclerosis ZDF

rats and intervention effect of atorvastatin

MA Quan-xin1, YANG Qin-qin1, LU Ye-feng2, CHEN Xiao-zhen1, CHEN Cheng1,

SHOU Qi-yang1, CAI Yue-qin1, CHEN Min-li1

(1.Laboratory Animal Research Center, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China;

2.College of Veterinary Medicine, Yangzhou University, Jiangsu,Yangzhou225009 )

Abstract【】ObjectiveTo observe the expression of NLRP3 inflammasome and its mediated inflammatory factors in the aorta of Zuker diabetic fatty (ZDF) rats with early atherosclerosis(AS), and observe the intervention effect of atorvastatin. MethodsZDF rats models of type 2 diabetes mellitus(T2DM) and AS were established by feeding high-fat diet accompanied with multiple injections of vitamin D3(VD3). Meanwhile, half of these rats were also given atorvastatin(ATV). Changes of serum glucose, lipids, insulin, ox-LDL and hsCRP were tested. Morphological changes of aorta tissues were examined by histopathology. The gene expressions of NLRP3 and some other inflammatory mediators were also quantified. Results After feeding high-fat diet, the glucose, lipids, insulin and ox-LDL levels of ZDF rats in the model group were significantly increased(P<0.05).After VD3 injecting, pathological changes also occurred in the early stage AS. Moreover, the hsCRP level was increased along with elevated gene expressions of NLRP3, caspase 1, IL-1β and TNF-α in the aorta tissues (P<0.05). Nevertheless, the serum glucose, lipids, insulin, ox-LDL and hsCRP levels in ZDF rats of the ATV group were significantly decreased (P<0.05). The pathological changes were attenuated and gene expressions of NLRP3, caspase-1, IL-1β and TNF-α in the aorta tissues also significantly reduced (P<0.05). ConclusionsNLPR3 inflammasome and its mediated inflammatory mediators participate in the inflammatory responses during the early AS development. ATV can inhibit the gene expression of NLRP3 inflammasome, and alleviate the inflammatory responses during atherosclerosis.

【Key words】Atherosclerosis;NLRP3 inflammasome;Type 2 diabetes mellitus; Zuker diabetic fatty rats

動(dòng)脈粥樣硬化(AS)不僅是2型糖尿病(T2DM)中最常見(jiàn)的大血管并發(fā)癥，也是T2DM患者致殘致死的重要原因[1]。近來(lái)，越來(lái)越多的研究者認(rèn)為炎癥是AS和糖尿病共同的病理基礎(chǔ)，NOD樣受體蛋白3(NLRP3)炎癥小體是其中重要的調(diào)控因子[2]。NLRP3炎癥小體是一種蛋白質(zhì)復(fù)合體，作為固有免疫的重要組分不僅在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，而且是連接炎癥與代謝性疾病的橋梁：由NLRP3介導(dǎo)產(chǎn)生的白介素(IL)-1β和IL-18會(huì)干擾胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)而導(dǎo)致胰島素抵抗，同時(shí)IL-1β使得動(dòng)脈粥樣硬化斑塊易于破裂[3]。因此，作為炎癥反應(yīng)的核心，NLRP3炎癥小體可能為防治T2DM并發(fā)AS提供新的靶點(diǎn)。阿托伐他汀(ATV)是臨床常用的抗AS藥物，具有一定的抗炎作用。目前尚無(wú)關(guān)于ATV對(duì)NLRP3炎癥小體干預(yù)作用的報(bào)道，且NLRP3炎癥小體在T2DM并發(fā)AS動(dòng)物模型中的研究較少。Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠是由Zucker肥胖(ZF)大鼠近交后得到的高血糖品系，為常用的T2DM疾病模型[4]，且伴有血管病變與炎癥反應(yīng)[5]。本文采用高脂飲食聯(lián)合維生素D3(VD3)建立ZDF大鼠T2DM并發(fā)早期AS模型，研究NLRP3炎癥小體及其介導(dǎo)的相關(guān)炎癥因子在主動(dòng)脈組織中的表達(dá)特點(diǎn)以及ATV的干預(yù)作用。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及實(shí)驗(yàn)環(huán)境

SPF級(jí)7～8周齡雄性ZDF大鼠12只及同周齡的雄性Zucker瘦型(ZL)大鼠6只，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供【SCXK(京)2012-0001】；飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心屏障實(shí)驗(yàn)室【SYXK(浙)2013-184】，環(huán)境溫度：(22±2)℃，相對(duì)濕度：50%～60%，光照： 12h/12h明暗交替，噪聲<50 db；每籠IVC籠內(nèi)飼養(yǎng)2只大鼠，自由飲食，并在試驗(yàn)過(guò)程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則給以人道主義關(guān)懷，并在適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

高脂飼料配方：膽固醇1%、起酥油10%、蛋黃粉10%、3號(hào)膽鹽0.5%、基礎(chǔ)飼料78.5%。

1.2試劑與儀器

VD3注射液，購(gòu)自上海通用藥業(yè)股份有限公司；ATV鈣片，輝瑞制藥有限公司生產(chǎn)；RNA提取試劑盒和熒光定量試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；大鼠超敏C反應(yīng)蛋白(hsCRP) ELISA試劑盒，購(gòu)自杭州誠(chéng)維生物科技有限公司；大鼠胰島素檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自ALPCO公司。診斷檢測(cè)試劑購(gòu)自上海申能-德賽診斷技術(shù)有限公司；CD68+抗體(ab31630)購(gòu)自abcam公司。7020型全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Thermo光譜掃描多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)，ST5010染色機(jī)(德國(guó)Leica公司)，80I相差顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.3動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

取ZDF大鼠12只，連續(xù)高脂飼喂4周后，進(jìn)行眼眶靜脈叢取血，測(cè)定血清膽固醇(CHOL)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、血糖(GLU)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。根據(jù)血脂血糖及體重，分為模型組(model group)和ATV組(ATV group)，每組6只；另取6只ZL大鼠飼喂基礎(chǔ)飼料，作為正常對(duì)照組(control group)。ATV組ZDF大鼠每天經(jīng)口灌服5 mg/kg ATV，模型組和正常對(duì)照組每天給予10 mL/kg蒸餾水。模型組與ATV組大鼠繼續(xù)飼喂高脂飼料，并經(jīng)腹腔注射60萬(wàn)IU/kg VD3(分3次，每隔3 d注射1次)。

1.4指標(biāo)測(cè)定

1.4.1血液生化指標(biāo)測(cè)定：在首次注射VD3后2，4，6周時(shí)，將所有大鼠禁食12 h后經(jīng)眼眶靜脈取血1 mL，分離血清，使用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)GLU、CHOL、TG、LDL-C、HDL-C水平，并計(jì)算動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)(AI)，AI=(CHOL-HDL-C)/HDL-C。利用ELISA試劑盒，檢測(cè)hsCRP、胰島素和ox-LDL的含量。

1.4.2主動(dòng)脈病理組織學(xué)觀察[6]：首次注射VD36周后麻醉并處死動(dòng)物，經(jīng)左心室預(yù)冷PBS沖洗，緊貼升主動(dòng)脈根部斷離心臟，立即放入4%中性甲醛中固定48 h后，從心耳下冠狀面剖切心臟。將心臟升主動(dòng)脈根部切面向下包埋，用石蠟切片機(jī)將主動(dòng)脈竇部切成4 μm薄片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化并拍照。

采用免疫組化染色方法檢測(cè)主動(dòng)脈組織中巨噬細(xì)胞的浸潤(rùn)。石蠟切片置于60℃培養(yǎng)箱烘烤1 h，脫蠟至水，3%過(guò)氧化氫溶液15 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，與anti-CD68+一抗孵育，置于4℃冰箱過(guò)夜。沖洗后與二抗結(jié)合15 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封片。巨噬細(xì)胞被標(biāo)記為棕黃色。

1.4.3主動(dòng)脈組織NLRP3及相關(guān)炎癥因子mRNA的表達(dá)測(cè)定：取凍存主動(dòng)脈組織40 mg～60 mg，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA?；蛞镉缮虾Ｉど锕驹O(shè)計(jì)并合成，引物序列見(jiàn)表1。將cDNA用RT-PCR儀進(jìn)行二步法擴(kuò)增，所有反應(yīng)信息資料由Bio-Rad iQ5 PCR儀收集。反應(yīng)體系為20 μL，包括2 μLcDNA溶液，10 μL SYBR?，每種引物1 μL(10 μmol/L)以及6 μL水。擴(kuò)增條件：①95℃預(yù)變性10 min，② 95℃變性15 s，③ 60℃退火1 min，②③循環(huán)40次。GADPH管家基因作為內(nèi)參對(duì)照，目的基因轉(zhuǎn)錄水平通過(guò)公式2-△△CT計(jì)算。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2結(jié)果

2.1空腹血糖、糖化血紅蛋白及胰島素的變化

注射VD3前及首次注射后2、4、6周時(shí)，模型組與ATV干預(yù)組ZDF大鼠空腹血糖均顯著升高(P<0.05)，而模型組與ATV組之間差異無(wú)顯著性 (P>0.05)。在0，6周時(shí)，模型組HbA1c及血清胰島素均顯著高于正常組(P<0.05)，但ATV組與模型組之間差異無(wú)顯著性 (P>0.05)(圖1)。

表1　RT-PCR引物序列

注：與正常組相比， *P<0.05。與模型組相比， #P<0.05。 圖1　大鼠血糖、糖化血紅蛋白和血清胰島素的變化 Note. Compared with the control group, *P<0.05. Compared with the model group, *P<0.05. Fig.1　Changes of GLU, HbA1c and insulin in the rats

2.2血脂與AS指數(shù)的變化

注射VD3前及首次注射后2、4、6周時(shí)，模型組ZDF大鼠血清總CHOL、LDL-C、TG和AI均高于正常組(P<0.05)，而ATV組ZDF大鼠在首次注射VD3后第4、6周時(shí)CHOL和LDL-C水平均顯著低于模型組(P<0.05)，并在第4周時(shí)AI顯著低于模型組(P<0.05(圖2)。

2.3血清hsCRP和ox-LDL的改變

注射VD3前模型組、ATV組和正常組血清hsCRP差異無(wú)顯著性 (P>0.05)。首次注射VD3后2，4，6周時(shí)，模型組大鼠血清hsCRP水平顯著高于正常組(P<0.05)而ATV干預(yù)組血清hsCRP則顯著低于模型組(P<0.05)。首次注射VD3后第6周模型組ZDF大鼠血清ox-LDL含量高于正常組(P<0.05)，而ATV干預(yù)組ox-LDL顯著低于模型組(P<0.05)(圖3)。

2.4主動(dòng)脈組織病理學(xué)觀察

觀察ZDF大鼠主動(dòng)脈瓣部位AS形成情況。HE染色顯示，正常組ZL大鼠內(nèi)皮平滑，無(wú)明顯增厚和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，平滑肌排列整齊；模型組ZDF大鼠主動(dòng)脈瓣根部有泡沫細(xì)胞、膽固醇晶體聚集，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，部分有鈣化形成；而ATV干預(yù)組有少量泡沫細(xì)胞和膽固醇晶體形成。免疫組化結(jié)果顯示，正常組大鼠主動(dòng)脈組織中未見(jiàn)巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組ZDF大鼠主動(dòng)脈組織中有較多巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，而ATV組相比于模型組主動(dòng)脈組織中巨噬細(xì)胞減少(圖4，見(jiàn)封二)。

2.5主動(dòng)脈組織NLRP3及相關(guān)炎癥因子mRNA的表達(dá)

與正常組比，模型組大鼠主動(dòng)脈組織中NLRP3、caspase 1、IL-1β和TNF-α的mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)；而ATV干預(yù)組則顯著下調(diào)上述基因的表達(dá)(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

注：與正常組相比， *P<0.05。與模型組相比， #P<0.05。 圖2　大鼠血脂、LDL-C和AI指數(shù)的變化 Note. Compared with the control group, *P<0.05. Compared with the model group, #P<0.05. Fig.2　Changes of blood CHOL, LDL-C and AI index in the rats

注：與正常組相比， *P<0.05。與模型組相比， #P<0.05。 圖3　大鼠血清hsCRP與ox-LDL的變化 Note. Compared with the control group, *P<0.05. Compared with the model group, *P<0.05. Fig.3　Changes of serum hsCRP and ox-LDL in the rats

注：與正常組相比， *P<0.05。與模型組相比， #P<0.05。 圖5　大鼠主動(dòng)脈組織NLRP3與相關(guān)炎癥介質(zhì)mRNA的表達(dá) Note. Compared with the control group, *P<0.05. Compared with the model group, *P<0.05. Fig.5　Expression of NLRP3 and related inflammatory mediators mRNA in the aorta tissue of rats

3討論

AS是T2DM中常見(jiàn)的大血管并發(fā)癥，發(fā)病率高達(dá)70%，是導(dǎo)致T2DM患者死亡的主要原因[7]。目前國(guó)內(nèi)外多用ZDF大鼠作為研究T2DM及相關(guān)并發(fā)癥的動(dòng)物模型。ZDF大鼠因胰島β細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄功能缺陷而導(dǎo)致胰島素抵抗，在16～24周齡時(shí)，會(huì)出現(xiàn)冠狀動(dòng)脈和主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙[8]。嚙齒類(lèi)動(dòng)物不易形成AS[9]，但用大劑量注射VD3可形成鈣超載，高鈣協(xié)同高血脂破壞動(dòng)脈管壁內(nèi)皮的完整性，從而有利于血漿脂質(zhì)對(duì)管壁的損傷、侵入和沉積，形成AS斑塊[10]，且VD3還能夠激活機(jī)體相關(guān)炎癥信號(hào)通路[11]。因此，高脂飼喂聯(lián)合VD3注射是目前建立大鼠AS模型常用的方法[12]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)飼喂高脂飼料加速ZDF大鼠T2DM的發(fā)病進(jìn)程，并在4周后階段性注射VD3以促進(jìn)AS的形成，建立早期AS模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ZDF大鼠高脂飼喂4周后體重、尿量、血脂、血糖、胰島素水平均顯著上升，表明出現(xiàn)典型的T2DM癥狀。此時(shí)，進(jìn)行VD3注射并持續(xù)高脂飼喂，6周后模型組ZDF大鼠主動(dòng)脈瓣根部?jī)?nèi)膜增厚，有泡沫細(xì)胞和巨噬細(xì)胞侵入和少量膽固醇晶體形成，部分動(dòng)物出現(xiàn)鈣化斑塊，說(shuō)明已形成早期的AS。

T2DM的特征癥狀為向心性肥胖，其脂肪組織被巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)。IL-1β、TNF-α等炎癥因子對(duì)胰島β細(xì)胞有毒害作用，加劇了糖尿病病癥的惡化；同時(shí)，這些炎癥因子釋放進(jìn)入血液，對(duì)主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞造成損傷，誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的產(chǎn)生[13,14]。實(shí)驗(yàn)顯示，模型組在注射VD3前糖尿病癥狀明顯，但血清hsCRP含量不高，炎癥反應(yīng)不嚴(yán)重。自注射VD3后2周起，隨著hsCRP水平的上升、炎癥反應(yīng)的加劇，動(dòng)脈粥樣硬化指數(shù)也逐漸上升，呈一定的正相關(guān)性，提示T2PM中的炎癥反應(yīng)是誘發(fā)動(dòng)脈粥樣硬化的重要因素。給予ATV后，hsCRP水平顯著降低，AS程度有一定的減輕，說(shuō)明ATV有抗炎癥反應(yīng)及早期AS形成的作用。

T2DM與AS中的炎癥反應(yīng)受NLRP3炎癥小體調(diào)控。NLRP3炎癥小體復(fù)合物是由成核受體蛋白、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白包含半胱天冬酶募集域(ASC)和caspase 1組成，可被多種因子激活。NLRP3的激活包括2步：首先，氧化修飾的LDL被巨噬細(xì)胞的Toll樣受體和清道夫受體識(shí)別，激活NF-κB通路，釋放TNF-α和IL-1β前體等炎癥因子。隨后，AS病變產(chǎn)生的膽固醇晶體和T2DM中產(chǎn)生的胰島淀粉樣多肽(IAPP)寡聚物被巨噬細(xì)胞吞噬，引起溶酶體破裂，釋放組織蛋白酶，組織蛋白酶可調(diào)節(jié)NLRP3的激活形成多聚體，產(chǎn)生成熟的IL-1β并釋放到胞外，從而使免疫細(xì)胞的聚集，引起炎癥反應(yīng)和AS斑塊的形成[15]。Duewell等[16]在ApoE缺陷小鼠中發(fā)現(xiàn)，ox-LDL與CHOL能激活NLRP3炎癥小體，釋放IL-1β，促進(jìn)AS的形成；Jourdan等[17]利用ZDF大鼠闡述了膽固醇晶體激活NLRP3炎癥小體，從而產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致胰島細(xì)胞的死亡。本實(shí)驗(yàn)觀察到，模型組ZDF大鼠血清中ox-LDL與CHOL含量顯著上升，主動(dòng)脈組織中NLRP3與caspase 1基因表達(dá)上調(diào)，而NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥因子IL-1β和TNF-α表達(dá)同樣上調(diào)。提示ZDF大鼠經(jīng)高脂誘導(dǎo)后血清ox-LDL水平上升，刺激了IL-1β前體與TNF-α的產(chǎn)生；而TNF-α與主動(dòng)脈組織中的CHOL晶體可激活NLRP3炎癥小體，上調(diào)caspase 1的表達(dá)，促進(jìn)IL-1β前體成熟并釋放，加劇炎癥反應(yīng)，使AS病變程度進(jìn)一步加深。而ATV干預(yù)后能明顯降低ox-LDL水平并下調(diào)NLRP3及其相關(guān)炎癥基因的表達(dá)，因此，ATV可能通過(guò)降低LDL的氧化修飾反應(yīng)和抑制TNF-α的產(chǎn)生，并減少了主動(dòng)脈組織中CHOL晶體的形成，抑制NLRP3炎癥小體的激活，進(jìn)而降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，減輕AS的病變程度。

綜上所述，高脂飲食聯(lián)合VD3可誘導(dǎo)ZDF大鼠建立T2DM并發(fā)早期AS模型；該模型中NLRP3炎癥小體及其調(diào)控的相關(guān)炎癥介質(zhì)基因表達(dá)顯著上調(diào)，參與了T2DM與AS中的炎癥反應(yīng)；同時(shí)ATV能抗ZDF大鼠AS的形成并降低機(jī)體的炎癥反應(yīng)，可能與下調(diào)NLRP3及相關(guān)炎癥介質(zhì)有關(guān)；因此，該模型可用于T2DM與AS的發(fā)病機(jī)制研究，或作為NLRP3炎癥小體靶向藥物篩選的理想動(dòng)物模型。

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〔修回日期〕2014-11-28

更正

《中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志》2014年12月第24卷第12期《LP小鼠突變基因的定位及鑒定》， 第四作者李怡單位(中文)由原來(lái)的“揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心”變更為“南京師范大學(xué)”，特此更正。