不同針灸方法對膜迷路積水模型豚鼠聽力及耳蝸形態(tài)結構的影響

研究報告

不同針灸方法對膜迷路積水模型豚鼠聽力及耳蝸形態(tài)結構的影響

蔣麗元， 倪芳英， 王燦軍， 陳華德

(浙江中醫(yī)藥大學，杭州，浙江310053)

【摘要】目的探討不同針灸方法干預對豚鼠膜迷路積水的效應差異。方法50只豚鼠隨機分為空白組、模型組、針刺組、艾灸組、電針組，每組10只。采用腹腔注射醛固酮的方法誘導膜迷路積水模型。各治療組分別在“百會”“聽宮”實施相應穴位刺激，每日1次，連續(xù)治療10 d。治療結束后，行聽覺腦干誘發(fā)電位測試，觀察聽閾值。HE染色法觀察耳蝸積水程度，計算蝸管橫截面積與蝸管加前庭階橫截面積之和的比值(R值)。結果1針刺組、艾灸組、電針組聽閾值均較模型組降低(P<0.01)，電針組聽閾值較艾灸組、針刺組降低(P<0.01)，艾灸組聽閾值較針刺組降低(P<0.05)。2針刺組、艾灸組、電針組R值均較模型組降低(P<0.01)，電針組R值較針刺組、艾灸組降低(P<0.01，P<0.05)，艾灸組R值較針刺組降低(P<0.01)。結論針刺、艾灸、電針刺激“百會”“聽宮”均能減輕豚鼠膜迷路積水，并且改善耳蝸聽功能。電針表現出最好的效應，優(yōu)于艾灸、針刺；艾灸優(yōu)于針刺。

【關鍵詞】針刺；艾灸；電針；膜迷路積水；豚鼠

[基金項目]國家自然科學基金資助(編號：81373757)。

[作者簡介]蔣麗元(1985-)，女，浙江中醫(yī)藥大學第三臨床醫(yī)學院2013級博士生，研究方向：針灸治療眩暈的臨床與實驗研究。E-mail： 360741751@qq.com。

[通訊作者]陳華德(1957-)，男，醫(yī)學博士，教授、博士生導師、主任中醫(yī)師。E-mail： docchd@sina.com。

【中圖分類號】R33【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.006

Effects of acupuncture, moxibustion and electro-acupuncture on the

hearing and morphology of cochlea in guinea pig models of

endolymphatic hydrops

JIANG Li-yuan, NI Fang-ying, WANG Can-jun, CHEN Hua-de

(Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053，China)

Abstract【】ObjectiveThis study was conducted to compare the efficacy of acupuncture, moxibustion and electro-acupuncture on guinea pig models of cochlear endolymphatic hydrops. Methods Fifty healthy male guinea pigs (body weight 200-250 g) were randomly divided into five groups: the normal group, model group, acupuncture group, moxibustion group, and electro-acupuncture group (n=10 in each group). Forty guinea pigs received a once-daily intraperitoneal injection of aldosterone in a dose of 100 μg/100 g/d for 5 days to induce endolymphatic hydrops. After a 2-month interval, the animals of the acupuncture, moxibustion and electro-acupuncture groups were treated with corresponding acupoints stimulation at points Baihui (GV 20) and Tinggong (SI 19) once a day for 10 days, respectively. We measured the hearing threshold of the auditory brainstem response (ABR) and evaluated pathologically the degree of hydrops using hematoxylin-eosin staining, and then the ratio of scala media (SM) area / [SM + scala vestibuli (SV) area] was calculated. Results1. The hearing threshold of ABR in the acupuncture, moxibustion and electro-acupuncture groups were all significantly lower than that of the model group (P<0.01). The ABR threshold in the electro-acupuncture group was significantly decreased in comparison with that of the acupuncture and moxibustion groups (P<0.01 for both). The hearing threshold of the moxibustion group was significantly lower than that of the acupuncture group (P<0.05). 2. The ratio of SM / (SM + SV) in the acupuncture, moxibustion and electro-acupuncture groups were all significantly lower than that of the model group (P<0.01). The ratio in the electro-acupuncture group was significantly decreased in comparison with that of the acupuncture and moxibustion groups (P<0.01, P<0.05). The ratio of the moxibustion group was significantly lower than that of the acupuncture group (P<0.01). ConclusionsOur findings suggest that all acupuncture, moxibustion and electro-acupuncture at the acupoints Baihui (GV 20) and Tinggong (SI 19) can significantly suppress the development of endolymphatic hydrops and improve the cochlear function in guinea pigs. Electro-acupuncture is the most effective in this experiment, and moxibustion therapy shows better effect than acupuncture.

【Key words】Acupuncture; Moxibustion; Electro-acupuncture; Endolymphatic hydrops; Guinea pig

梅尼埃病(Meniere’s disease，MD)是一種臨床常見疾病。膜迷路積水被認為是MD的基本病理改變[1]。其典型的臨床表現為陣發(fā)性眩暈，感音神經性聽力下降，耳悶、耳鳴伴惡心、嘔吐，嚴重影響患者生活。臨床對于MD尚無特效治療方法[2]，西醫(yī)主要是使用利尿劑、激素、麻醉劑、血管擴張劑[3]等藥物，其對癥狀改善不甚理想。手術治療適應范圍較窄，療效不穩(wěn)定，并且術后可能出現各種并發(fā)癥[4]。

MD屬于祖國醫(yī)學“眩暈”范疇。《丹溪心法》中說：“眩者言其黑運轉旋，其狀目閉眼暗，身轉耳鳴，如立舟車之上，起則欲倒?！笔菍D很形象的描述。歷代醫(yī)家在針灸治療眩暈病方面積累了豐富的經驗[5]?，F代研究表明，針刺療法可使眩暈癥狀在短期內消失[6]，耳鳴耳聾減輕，對癥狀的改善可能與其改善血管運動神經、植物神經功能，緩解迷路痙攣，減輕膜迷路積水有關[7]。電針是針刺方法的一種，是在傳統(tǒng)針刺基礎上發(fā)展起來的。與傳統(tǒng)針刺相比，電針通過不間斷的電流刺激提高穴位局部治療效應。另外，電流產生的電場使耳部組織的離子發(fā)生定向運動，產生正負極化共振過程，促進組織恢復[8]。艾灸對MD的治療臨床也多有報道[9]。研究者分析認為，艾灸在燃燒過程中輻射出的近紅外線，可以激發(fā)穴位內生物分子氫鍵，通過神經-體液系統(tǒng)傳遞人體細胞所需能量，從而緩解臨床癥狀[7]。針刺、電針、艾灸治療MD效果滿意[10,11]。本實驗通過觀察針刺、電針、艾灸三種針灸療法刺激“百會”“聽宮”穴治療豚鼠膜迷路積水的效應差異，以期為臨床優(yōu)選治療MD療法提供實驗依據。

1材料和方法

1.1實驗動物

健康白色紅目豚鼠50只，雄性，體重(200～250)g，耳廓 Preyer 反射靈敏，耳鏡檢查無中耳疾病，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供(生產合格證號:SCXK(浙)2013-0060，使用合格證號:SYXK(浙)2013-0184 )。實驗過程中對動物的處置符合《關于善待實驗動物的指導性意見》的規(guī)定。

1.2主要試劑及儀器

醛固酮(Sigma，A9477)，RapidCal·ImmunoTM脫鈣劑(北京中杉金橋生物技術有限公司)，無煙艾條(120 mm×13 mm)，華佗牌無菌針灸針(0.25 mm×25 mm)，HANS-100A型鎮(zhèn)痛電針儀(南京醫(yī)療儀器廠)，聽覺腦干誘發(fā)電位儀(美國GSI公司)。

1.3動物分組與模型建立

將50只豚鼠按隨機數字表法分為空白組、模型組、針刺組、艾灸組、電針組，每組10只。除空白組外，其余4組動物按100 μg/100 g/d給予醛固酮腹腔注射，連續(xù)5 d，第6天開始各組不予處理，常規(guī)飼養(yǎng)，60 d后造模結束[12,13]，開始實施干預措施。

1.4處理方法

空白組：同樣固定不進行任何處理；模型組：膜迷路積水模型，同樣固定；針刺組：用針灸針在百會穴向前平刺2 mm，左側聽宮穴直刺3 mm(穴位定位參照《實驗針灸學》[14])，留針20 min，1次d，連續(xù)治療10 d；艾灸組：將艾條點燃施灸，點燃的一端與百會穴、左側聽宮穴處皮膚保持2~3 cm距離，反復均勻地旋轉移動進行灸治，灸20 min，1次d，連續(xù)治療10 d；電針組：用針灸針在百會穴向前平刺2 mm，左側聽宮穴直刺3 mm，接HANS-100A型鎮(zhèn)痛電針儀。刺激參數：輸出電流1 mA，頻率為2/15疏密波，留針20 min，1次d，連續(xù)治療10 d。

1.5指標檢測

1.5.1ABR檢測[15，16]：治療結束后，3%戊巴比妥鈉30 mg/kg腹腔注射麻醉豚鼠，采用聽覺腦干誘發(fā)電位儀在聲電屏蔽室內記錄豚鼠左耳ABR反應閾值。電極位置為：記錄電極置于顱頂正中，參考電極置于受檢耳后乳突區(qū)，接地電極置于對側耳后乳突區(qū)。刺激聲為0.1 ms交替脈沖激發(fā)的交替短聲(click)，刺激時間為10 ms，疊加1 024次，刺激聲強度從80 dB nHL開始測試，開始以10 dB遞減，待III 波不甚明顯或者延遲靠后時，說明接近閾值，然后改為5 dB遞減，以剛能分辨出III 波的刺激強度確定閾值，并至少重復2次，取其平均值作為閾值。

1.5.2組織學指標： 豚鼠ABR測試結束后，自胸骨劍突處作“U”型切口打開胸腔雙側達腋下，暴露心包，剪開心包，以灌注針頭自心尖刺入，達主動脈根部，固定針頭，剪開右心耳，先以生理鹽水灌注，至右心耳流出液體變?yōu)榍辶粒臑?%多聚甲醛 (pH 7.4)灌注，至頭頸、四肢完全僵硬后快速斷頭，取出左側聽泡，打開聽泡后剪修，充分暴露耳蝸。將標本置于4%多聚甲醛中固定，48 h后，將耳蝸標本置于RapidCal·ImmunoTM脫鈣劑內，脫鈣約3 d后，自來水沖洗過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。將耳蝸標本沿平行于蝸軸的平面切片，切片厚度為4.5 μm，每個標本取2張切片行HE染色。

1.6圖像分析

運用Image Pro Plus 6.0圖像采集分析系統(tǒng)分析HE染色切片。以耳蝸第二轉觀察膜迷路積水程度[17]，計算蝸管橫截面積與蝸管加前庭階橫截面積之和的比值(R)，2張切片取平均值，作為該只豚鼠的R值。膜迷路積水分度標準[12]：R值介于1/3～1/2之間為輕度積水，R值介于1/2～2/3之間為中度積水，R值在2/3以上為重度積水。

1.7統(tǒng)計學方法

2結果

2.1聽閾值變化

與空白組比較，模型組聽閾值顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，各治療組聽閾值顯著降低(P<0.01)；各治療組間比較，電針組聽閾值低于針刺組、艾灸組(P<0.01，P<0.05)，艾灸組聽閾值低于針刺組(P<0.05)(表1)。

表1　各組聽閾值比較

注：與空白組比較，★★P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01；與針刺組比較，■P<0.05，■■P<0.01；與艾灸組比較，※※P<0.01。

Note.★★P<0.01 vs. control group;△△P<0.01 vs. model group;■P<0.05,■■P<0.01 vs. acupuncture group;※※P<0.01 vs. moxibustion group.

2.2HE染色

空白組10只豚鼠耳蝸均無膜迷路積水；模型組表現為6只中度積水，4只重度積水；針刺組表現為2只輕度積水，8只中度積水；艾灸組表現為7只輕度積水，3只中度積水；電針組表現為1只無膜迷路積水，8只輕度積水，1只中度積水。與空白組比較，模型組R值顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，各治療組R值顯著降低(P<0.01)；各治療組間比較，電針組R值顯著低于艾灸組、針刺組(P<0.01)，艾灸組R值顯著低于針刺組(P<0.01)(表2)。

空白組耳蝸前庭膜平直無膨隆，與基底膜約成45°角，前庭階、鼓階、蝸管結構均無異常。模型組表現為各回前庭膜向前庭階方向不同程度的隆起擴張，從頂轉到底轉積水程度逐漸加重，尤以第一、二轉積水最為明顯，前庭膜與基底膜之間大于90°角；針刺組、艾灸組、電針組前庭膜膨隆程度較模型組均有不同程度減輕(圖1，見文后彩插5)。

Tab.2Comparison of the R values of cochlea in

組別GroupsR值Rvalue空白組Control0.30±0.01模型組Model0.62±0.07★★針刺組Acupuncturegroup0.56±0.04△△艾灸組Moxibustiongroup0.48±0.03△△■■電針組Electro-acupuncturegroup0.42±0.05△△■■※

注：與空白組比較，★★P<0.01；與模型組比較，△△P<0.01；與針刺組比較，■■P<0.01；與艾灸組比較，※P<0.05。

Note.★★P<0.01 vs. control group;△△P<0.01 vs. model group;■■P<0.01 vs. acupuncture group;※P<0.05 vs. moxibustion group.

3討論

古代文獻對眩暈病的病因病機多有論述。如《靈樞·海論》：“髓海不足，則腦轉耳鳴”，又如《靈樞·口問》：“上氣不足，腦為之不滿，耳為之苦鳴”，均表明髓海不足是該病的關鍵病機所在。百會穴為手足三陽、督脈之會，取百會可通髓海而健腦。MD病位在耳，聽宮穴位于耳前，為手太陽小腸經穴，手太陽小腸經又“卻入耳中”，經脈所過，主治所及，故取聽宮穴可治療內耳疾病。百會、聽宮是臨床治療內耳眩暈的常用組穴[18，19]。因此，實驗選取百會、聽宮二穴治療豚鼠膜迷路積水。結果顯示，針刺、艾灸、電針刺激百會、聽宮均可減輕豚鼠膜迷路積水，并且改善耳蝸聽功能。

MD病程中反復發(fā)作的內淋巴壓力增高可使內耳感覺細胞變性，血管紋萎縮，逐步形成不可逆的感音神經性耳聾[20]。研究表明，醛固酮可能通過激活耳蝸血管紋以及暗細胞內的Na+-K+-ATP酶活性引起內淋巴液離子濃度的改變，產生以底轉為主的膜迷路積水，進而導致高頻聽力下降[13]。這種聽力改變可能與內淋巴超壓影響耳蝸毛細胞的功能有關[15,21]。實驗中腹腔注射醛固酮可使豚鼠耳蝸發(fā)生膜迷路積水，聽閾增高，與文獻報道一致[17]。

針灸局部穴位，可通過神經—內分泌—免疫調節(jié)網絡調節(jié)促腎上腺皮質激素(ACTH)的釋放，改善內分泌功能。三種不同穴位刺激方法作用于百會、聽宮減輕醛固酮引起的膜迷路積水，可能與其對醛固酮分泌的良性調節(jié)有關。另外，還可能與其改善迷路動脈供血，調整迷路血液循環(huán)[19]，改善代謝功能，促使內耳膜迷路水腫吸收[10]有關。與傳統(tǒng)針灸療法相比，電針一方面使脈沖電和針刺同時作用于穴位，通過經絡系統(tǒng)，氣至病所而起作用；另一方面利用對神經干的電刺激，激發(fā)神經系統(tǒng)的一系列反射來達到治療作用。此外，電針與針刺、艾灸在神經傳導通路，對神經遞質以及免疫分子的影響方面也存在差異[22]。這些因素均有可能產生三種穴位刺激方法對膜迷路積水治療效果上的差異。實驗中電針在減輕豚鼠膜迷路積水方面表現出最好的效應，優(yōu)于艾灸、針刺；艾灸優(yōu)于針刺。

波動性聽力改變是MD常見的臨床表現，即聽力隨膜迷路積水的改變而改變，積水增加時聽力減退，積水減輕時聽力水平增進[20]。動物實驗中，研究者也發(fā)現積水程度與聽力改變之間具有一定相關性[15,21]。實驗結果顯示，針刺、艾灸、電針刺激百會、聽宮均能改善豚鼠聽力，且對聽力的改善與對膜迷路積水的改善表現出一致的優(yōu)效關系。這可能與其緩解膜迷路積水程度，降低內淋巴壓力，從而減輕對耳蝸毛細胞的機械刺激有關。此外，有研究表明，針灸可提高大腦皮層聽覺中樞興奮性，增強大腦皮層對聲音感受的代償力，從而實現對殘存聽力的充分利用[23]。也有資料表明，機體內的許多內分泌激素和神經遞質可以調節(jié)內耳功能[24，25]，因此針灸通過神經—內分泌—免疫調節(jié)途徑調節(jié)機體激素的分泌來促進內耳功能恢復的可能性也是存在的。而關于針刺、艾灸、電針如何減輕膜迷路積水，改善耳蝸聽功能，其具體機制值得深入探討。

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〔修回日期〕2014-10-21