基于3xTg-擬阿爾茨海默病小鼠模型的藥理學研究進展

綜述與專論

基于3xTg-擬阿爾茨海默病小鼠模型的藥理學研究進展

祝艷秋，張?zhí)m

(首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院藥物研究室，北京腦重大疾病研究院，神經(jīng)變性病教育部重點實驗室，北京100053)

【摘要】阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是老年人最常見的癡呆類型，其主要的病理變化包括胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)沉積，老年斑(SP)形成；神經(jīng)元丟失、神經(jīng)元細胞內(nèi)出現(xiàn)神經(jīng)元纖維絲纏結(NFT)。3xTg-AD小鼠作為首個能同時產(chǎn)生淀粉樣斑塊和神經(jīng)元纖維纏結的動物模型被廣泛用于AD的研究，本文旨在針對3xTg-AD小鼠相關藥理學研究進展作一綜述，包括3xTg-AD小鼠基本描述和以3xTg-AD小鼠為研究對象的多種藥物研究的簡要介紹。

【關鍵詞】阿爾茨海默??；3xTg-AD小鼠；抗AD藥物；藥理學

[基金項目]國家自然科學基金(No. 81473373 )，北京市自然科學基金(No. 7132110)，北京市中醫(yī)管理局重點項目(No. KJTS2011-04)，北京市新世紀百千萬人才工程(No. 008-0014)，首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項項目(No. 首發(fā)2011-1001-05)，北京市教委新醫(yī)藥學科群(No. XK100270569)。

[作者簡介]祝艷秋(1990-)，女，碩士，研究方向：神經(jīng)藥理學，中藥藥理學；E-mail： jo9092@hotmail.com。

[通訊作者]張?zhí)m(1972-)，女，藥理學研究員，研究方向：神經(jīng)藥理學，中藥藥理學，抗衰老藥理學；E-mail： lanizhg@hotmail.com。

【中圖分類號】R33【文獻標識碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.002.015

Progress in pharmacology research on 3xTg-AD mice

ZHU Yan-qiu, ZHANG Lan

(Department of Pharmacology, Xuanwu Hospital, Capital Medical University; Beijing Institute for Brain Disorders;

Key Laboratory for Neurodegenerative Diseases of Ministry of Education, Beijing 100053, China)

Abstract【】Alzheimer’s disease (AD) is the most common type of dementia in elderly people. The main pathological changes include extracellular Aβ protein deposition, formation of senile plaques (SPs), neuronal loss and intracellular neurofibrillary tangles (NFTs). 3xTg-AD mice have been widely used in AD research as the first kind of animal model which can generate both amyloid plaques and neurofibrillary tangles. This paper aims at summarizing the pharmacological research related with 3xTg-AD mice, including basic introduction of 3xTg-AD mice and pharmacological studies of many kinds of drugs on the mice.

【Key words】Alzheimer’s disease; 3xTg-AD mice; Anti-AD drugs; Pharmacology

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)又稱為老年性癡呆，是老年人中最常見的神經(jīng)退行性病變。近期研究統(tǒng)計顯示，中國癡呆人數(shù)在2010年已經(jīng)達到919萬，其中阿爾茨海默病患者為568萬，發(fā)病率為每1000人年6.25例，發(fā)病人數(shù)已然躍居世界第一位[1]。AD的主要神經(jīng)病理變化包括胞外β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)沉積形成老年斑(senile plaque, SP)；微管相關蛋白tau異常過度磷酸化導致細胞內(nèi)形成神經(jīng)元纖維纏結(neurofibrillary tangle, NFT)； 淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)異常代謝過程提高sAPPβ和β-CTF等毒性多肽，最終導致突觸功能障礙、神經(jīng)元缺失[2]，以及線粒體功能障礙[3]。

動物模型在AD研究過程中扮演著十分重要的角色，不斷探索更優(yōu)秀的動物模型也是研究人員的主要任務，隨著3xTg-AD小鼠的誕生，對AD的研究更加深入，本文就3xTg-AD在藥理學研究中的應用進行綜述。

13xTg-AD小鼠

2003年，Oddo等[4]通過將APPSwe和tauP301L同時顯微注射進PS1M146V基因敲入小鼠的單細胞胚胎中，得到了攜帶APPSwe，tauP301L，PS1M146V基因的三重轉基因小鼠—3xTg-AD小鼠。相比其它AD小鼠模型，這種小鼠具有諸多優(yōu)點：利于闡明Aβ、神經(jīng)纖維纏結以及突觸功能紊亂三者之間的關系，并且適用于研究同時針對兩種病理變化的AD療法；作為純合子小鼠能得到基因型明確的后代，不需要大量的分析，且雜合子同樣發(fā)生神經(jīng)病理改變(較純合子晚)，基因表現(xiàn)型的外顯率為100%，雌雄均同等表達；相較于兩種轉基因小鼠雜交所得含有三種轉入基因的動物模型，它具有單一的基因背景，避免了生物學差異。

3xTg-AD小鼠的神經(jīng)病理學發(fā)生的區(qū)域-時程模式十分近似地模擬了AD，相關變化隨時程發(fā)展情況(見附表)：3～4月齡時在新皮質出現(xiàn)胞內(nèi)Aβ免疫反應；4月齡開始出現(xiàn)水迷宮測試中的長期記憶功能障礙而學習功能未受損[5]；6月齡時在海馬CA1錐體神經(jīng)元出現(xiàn)胞內(nèi)Aβ免疫反應，在額葉皮質出現(xiàn)胞外Aβ沉積(主要在4～5層)，并在此時出現(xiàn)興奮性突觸后電位降低，提示基底神經(jīng)元傳導功能損傷，長時程增強(LTP)和雙脈沖易化(PPF)損傷，表明短期記憶功能受損；氧化應激出現(xiàn)在Aβ斑塊和神經(jīng)纖維纏結之前，6月齡時過氧化氫產(chǎn)物明顯高于非轉基因小鼠，氧化應激水平顯著增高，9月齡時線粒體氧化磷酸化的關鍵酶COX和PDH均表現(xiàn)出活性明顯降低，且12月齡時線粒體呼吸效率顯著降低[6, 7]；12月齡時在其他皮質和海馬區(qū)出現(xiàn)明顯的胞外Aβ沉積[8]，此時tau蛋白在CA1錐體神經(jīng)元中出現(xiàn)明顯增多并隨后出現(xiàn)在皮質神經(jīng)元，12月齡時出現(xiàn)tau蛋白的構象變化[9]；15月齡時在后皮質區(qū)(枕葉、頂葉)出現(xiàn)明顯Aβ沉積，且tau蛋白出現(xiàn)高度磷酸化和構象改變，并開始出現(xiàn)PHF；在18月齡時出現(xiàn)明顯的PHF，神經(jīng)突周圍球狀結構明顯[4]。晝夜節(jié)律異常在AD病理變化前發(fā)生，并持續(xù)至病理變化發(fā)生后，白天活動增加夜晚減少，視交叉上核中含腸血管活性多肽和含后葉加壓素的細胞數(shù)顯著降低，提示視交叉上核神經(jīng)元晝夜節(jié)律紊亂[10]。

3xTg-AD小鼠是目前最接近家族型阿爾茨海默病的動物模型，它具有AD的主要神經(jīng)病理學特征—SP和NFT，腦中出現(xiàn)神經(jīng)元死亡、突觸丟失等AD的重要病理變化，且該轉基因動物模型由于認知障礙出現(xiàn)、病理發(fā)生較早，使得研究過程更加經(jīng)濟快速。隨著該模型的研究報道日益增多，更多的研究人員將了解并選擇這種動物模型。

表1　3xTg-AD小鼠隨時程發(fā)生的病理變化

23xTg-AD小鼠相關抗AD藥物研究

2.1抗Aβ的藥物

Aβ是由β淀粉樣前體蛋白(APP)經(jīng)過水解產(chǎn)生的39-43個氨基酸的羧基端肽段。大部分APP經(jīng)α-分泌酶切割，產(chǎn)生可溶性無毒片段，除此之外APP仍可受β-和γ-分泌酶切割產(chǎn)生Aβ1-40、Aβ1-42。Aβ1-42疏水性強易聚集，這種不可溶的Aβ片段是形成老年斑的的核心成分。以Aβ為靶點的藥物在APP的加工、聚集、清除三方面產(chǎn)生作用。3xTg-AD小鼠通過轉入APPSwe基因能夠表現(xiàn)出完整的Aβ病理特征，適用于以此為作用途徑的藥物研究。

2.1.1作用于APP加工途徑的藥物：目前大多數(shù)藥物研究傾向于通過影響APP加工途徑來抑制Aβ生成，利用3xTg-AD小鼠進行這方面的藥物研究也較多。Green等[11]利用3xTg-AD小鼠的APP機制發(fā)現(xiàn)了Azaindolizinone衍生物ST101可以在一個新的位點上誘導APP解聚，產(chǎn)生17kDa的羧基端片段。ST101能提高老年3xTg-AD小鼠記憶功能，誘導微管蛋白片段出現(xiàn)，體內(nèi)外試驗均能減少腦內(nèi)Aβ水平。同樣的，Baglietto-Vargas等[12]通過給予12月齡的3xTg-AD小鼠糖皮質激素受體拮抗劑米非司酮，發(fā)現(xiàn)也能通過誘導淀粉樣前體蛋白(APP)解聚為一種新的17kDa的片段從而顯著降低了3xTg-AD小鼠腦內(nèi)Aβ水平，并通過新背景/地點/物體測試以及Morris水迷宮實驗證實能夠緩解病理變化誘導的認知與記憶障礙。

利用該小鼠模型能夠表達多種APP水解酶的特點，有多種研究利用該模型探討藥物對各種水解酶的作用。通過給予選擇性5-氧合酶激活蛋白抑制劑MK591可以通過調節(jié)γ-分泌酶減少Aβ，具體表現(xiàn)為穩(wěn)定態(tài)的四種γ-分泌酶復合體(PS-1，NCT，Pen-2和APH-1)水平降低，最終降低腦內(nèi)Aβ1-40、Aβ1-42水平和Aβ沉積，改善認知缺陷、記憶障礙[13]。

有報道顯示M1型乙酰膽堿受體的激活能夠誘導α-分泌酶水解產(chǎn)物[14]，因此，Caccamo等[15]選用能夠表現(xiàn)明顯的APP水解途徑的3xTg-AD小鼠，并給予毒蕈堿選擇性M1受體激動劑AF267B，探討該藥的藥理學機制。發(fā)現(xiàn)AF267B可以增加ERK1/2和PKC活性，選擇性激活ADAM17，降低β分泌酶BACE1蛋白表達水平，從而調節(jié)APP加工途徑。

Peng等[16]同樣利用3xTg-AD小鼠該特點來研究左旋丁苯酞(L-NBP)能否能夠通過α-分泌酶途徑影響APP加工而非生成。并證實了左旋丁苯酞能夠刺激正常水解產(chǎn)物αAPPs釋放增多，增加PKCα的表達，減弱神經(jīng)膠質活性(使GFAP和CD5活性降低約30%)和氧化應激損傷(顯著降低MDA水平)。最終增強3xTg-AD小鼠學習能力和長期空間記憶，降低全腦內(nèi)Aβ水平，減少Aβ沉積。

2.1.2抑制Aβ聚集的藥物：3xTg-AD小鼠的一大病理特征即為以Aβ聚集為核心的老年斑，因此，眾多學者選擇3xTg-AD小鼠作為研究針對Aβ聚集藥物的。根據(jù)Aβ假說，Aβ免疫治療已經(jīng)成為一種成功清除腦內(nèi)Aβ從而預防其造成的神經(jīng)元損傷的治療手段[17]。Mamikonyan等[18]希望通過產(chǎn)生多種AD樣病變、更加接近AD的3xTg-AD小鼠來證實向海馬內(nèi)注射Aβ1-11抗體的被動免疫治療效果，發(fā)現(xiàn)該抗體抑制Aβ42低聚物生成，抑制Aβ42纖維化，誘導Aβ42纖維的前體成為非纖維狀的無毒物質。

雄性激素缺損能加速Aβ聚集，加重行為缺陷，并且有研究報道3xTg-AD小鼠腦內(nèi)類固醇水平隨著年齡的增加有所變化[19]。Rosario等[20]希望通過運用具備多種AD樣病理變化并存在激素增齡性變化的3xTg-AD小鼠進行探究神經(jīng)類固醇激素二氫睪酮(DHT)對于AD的藥理作用。發(fā)現(xiàn)DHT可以緩解切除性腺的小鼠腦內(nèi)Aβ聚集和行為缺陷。

研究顯示選擇性5-HT再攝取抑制劑(SSRIs)有望在AD中提高認知功能、緩解氧化應激[21]。Chadwick等[22]同樣選擇了相比較于其他動物模型更加全面模仿AD的3xTg-AD小鼠，研究了三環(huán)類抗抑郁藥阿米替林的藥理作用，發(fā)現(xiàn)它可以增強無毒Aβ單體的同時減少毒性Aβ二聚體，明顯改善老化產(chǎn)生的空間學習記憶能力障礙和認知損害。

美金剛是現(xiàn)如今為數(shù)不多的被用于臨床的抗AD藥物之一，它是一種NMDA受體拮抗劑，調節(jié)谷氨酸能系統(tǒng)[23]。同樣由于3xTg-AD小鼠更加接近AD的病理特征，Martinez-Coria等[24]選擇該模型探究美金剛針對AD病理的治療效果，發(fā)現(xiàn)它可以修復認知功能，降低不可溶Aβ、Aβ十二聚體、可溶性纖維前體低聚物以及纖維低聚物的水平，緩解Aβ誘導的海馬LTP受損從而預防突觸功能紊亂。

由于3xTg-AD小鼠Aβ病理發(fā)生、聚集產(chǎn)生較早，多種藥物以此為模型探究藥物對于Aβ聚集的影響。體外實驗證明多種非甾體抗炎藥(如：布洛芬、酮洛芬、雙氯芬酸、阿司匹林)呈劑量依賴性地抑制Aβ纖維，并限制其延伸[25]。McKee等[26]對1和6月齡3xTg-AD小鼠用非甾體抗炎藥布洛芬進行給藥，發(fā)現(xiàn)海馬內(nèi)CA1區(qū)域6E10、NU-1陽性細胞減少，并能夠減少胞內(nèi)Aβ低聚物，緩解認知缺陷。

2.1.3促進Aβ降解的藥物：相較于抑制Aβ生成、聚集的藥物研究，利用3xTg-AD小鼠研究促進Aβ降解藥物則較少，3xTg-AD小鼠仍舊適用于該類藥物的研究。Medina等[27]發(fā)現(xiàn)長期在3xTg-AD飲食中添加甲基藍能夠提高腦內(nèi)胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶水解酶活性，從而增加Aβ降解，降低可溶性Aβ水平，提高學習和記憶功能。

2.2作用于tau的藥物

3xTg-AD由于轉入tauP301L基因能夠表現(xiàn)出明顯的tau病理變化。由于tau蛋白的異常過度磷酸化，使得tau蛋白與微管蛋白的結合能力下降，促進微管組裝功能減弱，進而tau蛋白從微管上脫落、相互聚集，形成具有神經(jīng)毒性的寡聚體，最終形成雙螺旋纖維絲、神經(jīng)元纖維纏結。因此，以tau蛋白為靶點的研究可以選用3xTg-AD小鼠作為工具來探索藥物的作用，主要分為三個方面：抑制tau蛋白磷酸化；抑制tau蛋白聚集；促進tau蛋白解聚。

2.2.1抑制tau蛋白磷酸化的藥物：3xTg-AD小鼠能夠表現(xiàn)出明顯的tau蛋白磷酸化水平升高，并且轉基因模型小鼠在調控tau蛋白磷酸化的各類激酶方面相較于對照小鼠有明顯的病理性變化，如糖原合成激酶-3(glycogen synthase kinase-3, GSK-3)、細胞周期依賴性蛋白激酶5(cyclin dependent kinase-5, CDK-5)等。目前根據(jù)這一特征選用該模型進行tau蛋白相關藥物研究的例子較多。

利用3xTg-AD小鼠能夠激活GSK3β活性產(chǎn)生tau蛋白磷酸化，可以進行以GSK3β為靶點的藥物研究。以3xTg-AD小鼠為模型，Gong等[28]發(fā)現(xiàn)黃酮醇類天然藥物桑色素可以降低該小鼠腦內(nèi)GSK3β活性，從而降低海馬神經(jīng)元內(nèi)tau蛋白的Ser396、Ser199/202位點高度磷酸化。

同樣以3xTg-AD小鼠為模型，Caccamo等[29]發(fā)現(xiàn)金屬離子鋰可以通過增高Ser21和Ser9位點的磷酸化降低GSK-3α和GSK-3β的活性，從而降低tau蛋白Thr181、Ser202/Thr205位點的磷酸化水平。

此外，為了進一步探究美金剛的藥理學機制，利用高度模仿AD復雜病理的3xTg-AD小鼠，能夠發(fā)現(xiàn)其通過提高GSK3β Ser9位點的磷酸化水平，從而降低總tau蛋白水平和tau蛋白磷酸化位點212/214、199/202和231的磷酸化水平，并降低總體的tau和過度磷酸化的tau的水平[24]。

2.2.2抑制tau蛋白聚集的藥物：3xTg-AD小鼠能夠表現(xiàn)出明顯的tau蛋白磷酸化、tau蛋白聚集，這為研究抑制tau蛋白聚集的藥物提供了便利條件。Baglietto-Vargas等[12]發(fā)現(xiàn)給予3xTg-AD小鼠糖皮質激素受體拮抗劑米非司酮后，該藥物除作用于Aβ外，亦能減少tau蛋白磷酸化和tau蛋白的聚集，伴隨p25的降低，并且它能夠提高3xTg-AD小鼠腦內(nèi)與學習能力損傷有關的CREB和p-CREB的水平。

2.2.3促進tau蛋白解聚：3xTg-AD小鼠腦內(nèi)tau蛋白聚集顯著增加使得采用該模型研究促進tau蛋白解聚成為可能。以此為依據(jù)，選擇性5-氧合酶激活蛋白抑制劑MK591能夠顯著降低3xTg-AD小鼠tau蛋白Ser396位點的磷酸化水平，并發(fā)現(xiàn)給藥后不可溶tau蛋白聚體水平顯著降低，其機制可能是通過降低Cdk5激酶水平[13]。

通過選用此動物模型，Green等[30]發(fā)現(xiàn)水溶性維生素煙酰胺可以通過修復泛素-蛋白酶體系統(tǒng)，降低3xTg-AD小鼠特異性tau蛋白Thr231位點磷酸化，促進tau蛋白解聚，并且能夠增加乙?；摩?tubulin微管蛋白、MAP2c，使微管結構穩(wěn)定。

2.3其他

2.3.1作用于線粒體的藥物：近年來關于AD發(fā)病機制大部分研究都支持Aβ和tau蛋白理論，然而其它的一些因素同樣影響AD的病程，線粒體功能紊亂便位列其中。3xTg-AD小鼠在Aβ斑塊和神經(jīng)纖維纏結之前即出現(xiàn)氧化應激水平增加，提示出現(xiàn)線粒體損傷，因此，該動物模型同樣適用于研究以線粒體為靶點的藥物。因此，McManus等[31]選擇了3xTg-AD小鼠作為模型，檢測了新型線粒體靶向抗氧化劑MitoQ抑制腦內(nèi)AD樣病理變化的效果，結果顯示MitoQ能夠防止認知功能下降，緩解氧化應激，降低皮質細胞凋亡蛋白酶活性，抑制腦內(nèi)Aβ聚集、星形膠質細胞聚集、突觸丟失，緩解Aβ誘導的神經(jīng)元毒性并且抑制毒性物質產(chǎn)生和線粒體膜電位丟失。

Corona等[32]同樣選取3xTg-AD小鼠通過對其補充左旋肌肽后，檢測出線粒體復合物I/II/IV水平增加，且AD中與年齡相關的線粒體功能紊亂得到緩解，最終顯著減少海馬胞內(nèi)Aβ聚集。

2.3.2作用于突觸的藥物：研究證實3xTg-AD小鼠能夠表現(xiàn)出基底神經(jīng)元傳導損傷，LTP/PPF受損，所以可以用于探究作用于突觸的藥物。通過應用3xTg-AD小鼠作為動物模型，發(fā)現(xiàn)美金剛能夠減少細胞體樹突積聚，通過調節(jié)NMDA受體阻止Aβ誘導的對LTP的抑制作用[24]；選擇性5-氧合酶激活蛋白抑制劑MK591可以在3xTg-AD小鼠產(chǎn)生明顯神經(jīng)病理學變化之前緩解突觸功能紊亂，表現(xiàn)為逆轉LTP的明顯降低[13]；MitoQ亦能夠拮抗突觸素降低，減少3xTg-AD小鼠皮質內(nèi)突觸丟失[31]；抗抑郁藥阿米替林能夠提高3xTg-AD小鼠海馬中突觸前/后蛋白(如synapsinI，PSD95)的表達，提示阿米替林能夠緩解突觸損傷[22]。

2.3.3抑制神經(jīng)炎癥的藥物：神經(jīng)炎癥是AD的病理特征之一，由于3xTg-AD小鼠能高度模仿AD的病理變化，因此，仍舊有研究者使用該模型以探討作用于神經(jīng)炎癥的藥物的藥理學機制。Parachikova等[33]研究發(fā)現(xiàn)，廣譜四環(huán)類抗生素米諾環(huán)素能夠通過顯著降低多種神經(jīng)炎癥因子(如TNFα、IL6等)，降低不可溶Aβ和可溶性Aβ小纖維的水平，改善海馬、皮層、杏仁核相關的學習記憶缺陷。

3結論

3xTg-AD小鼠模型目前主要被應用于藥物的藥效學評價和藥理學研究。作為藥效學評價的動物模型，3xTg-AD小鼠在Aβ和tau蛋白方面病理表現(xiàn)完整，適合大部分抗AD藥物研究。此外，針對其它藥物作用靶點的藥理學研究(如線粒體、突觸損傷、炎癥)該模型也適用。AD發(fā)病機制復雜，多靶點藥物已逐漸成為研究主流，3xTg-AD小鼠能在同一模型中表現(xiàn)出多種病理變化，是研究多靶點藥物理想的動物模型，將逐漸受到研究者的重視。

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〔修回日期〕2014-11-22