同源導(dǎo)入近交系綠色熒光裸小鼠Foxn1nu.B6－CAG－EGFP/SU的建立

研究報(bào)告

同源導(dǎo)入近交系綠色熒光裸小鼠Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU的建立

沈艷華1，王麒龍2，代興亮2，陳金2，董軍2，蘭青2，黃強(qiáng)2

(1. 蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心， 江蘇 蘇州215123；2. 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 蘇州215123)

【摘要】目的建立一個(gè)能穩(wěn)定表達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorecence protein，EGFP)的裸小鼠近交新品系，供包括人腦膠質(zhì)瘤在內(nèi)的所有人類(lèi)腫瘤移植實(shí)驗(yàn)用。方法將雌性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)轉(zhuǎn)基因小鼠和雄性Foxn1nu裸小鼠，按同源導(dǎo)入方法進(jìn)行雜交和回交，用熒光手電筒和匹配的眼鏡、多功能活體成像儀、熒光顯微鏡對(duì)是否表達(dá)EGFP進(jìn)行鑒別，傳至F10后進(jìn)行遺傳學(xué)檢測(cè)。結(jié)果所建品系命名為 Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU (Soochow University)，14個(gè)遺傳生化位點(diǎn)中13個(gè)表型與BALB/c(Foxn1nu)吻合，唯Pep3(肽酶-3)的電泳為b型,而標(biāo)準(zhǔn)的BALB/c近交系為a型;外周血淋巴細(xì)胞占全部有核細(xì)胞15%，T淋巴細(xì)胞僅占0.3%，與親本的Foxn1nu一致。結(jié)論成功地建立了一個(gè)既與親本C57BL/6-TgN(CAG-EGFP)-樣穩(wěn)定表達(dá)EGFP，又與Foxn1nu裸小鼠(BALB/c背景)一樣具有T細(xì)胞缺乏的熒光裸小鼠新品系- Foxn1nu.B6-CAG-EGFP|SU ,Pep3為b型是有別于Foxn1nu裸小鼠的生化遺傳標(biāo)記位點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】綠色熒光蛋白；轉(zhuǎn)基因小鼠；裸小鼠；近交系

[基金項(xiàng)目]國(guó)家自然科學(xué)基金(81071766、81172400、81272799、81472739)；國(guó)家自然科學(xué)基金“膠質(zhì)瘤干細(xì)胞重構(gòu)微環(huán)境誘導(dǎo)宿主細(xì)胞癌變的相關(guān)機(jī)制研究”(81472739)。

[作者簡(jiǎn)介]沈艷華(1981-)女，助理實(shí)驗(yàn)師，碩士，E-mail: shenyanhua@suda.edu.cn。

[通訊作者]黃強(qiáng)，E-mail: hq1936@163.com。

【中圖分類(lèi)號(hào)】R332【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A

doi:10.3969.j.issn.1671.7856. 2015.001.010

Establishment of a new congenic inbred

mouse strain named Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU

SHEN Yan-hua1，WANG Qi-long2，DAI Xing-liang2，CHEN Jin-sheng2，DONG Jun2，LAN Qing2，HUANG Qiang2

( 1. Laboratory animal center of Soochow University, Jiangsu Suzhou 215123, China；

2. The Second Affiliated Hospital of Soochow University, Jiangsu Suzhou 215123,China)

Abstract【】ObjectiveTo establish a new congenic inbred mouse strain carrying and expressing EGFP and Foxn1nugene for cancer research including human glioma as well. Methods According to criterion of GB14923-2010, the male Foxn1nu nude mice backcross the female C57BL/6-Tg (CAG-EGFP) transgenic mice for 10 times, Then identify the phenotype using the methods and equipment as below: fluorescent flashlight and matching glasses; multifunction vivo imager; fluorescence microscopy. ResultsThe congenic inbred mouse strain named Foxn1nu. B6-CAG-EGFP/SU (Soochow University). All the 14 biochemical loci are homozygous and same with Balb/c mouse in addition to the Pep3 loci (“b” type instead of “a” type). Peripheral blood lymphocyte count shows the lymphocytes occupy 15% of nucleated cells; T lymphocytes occupy 0.3%, meet the requirement of inbred strain of EGFP nude mice. ConclusionsEstablished a new congenic inbred strain -Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU which both express EGFP stably, and own immunodeficiency with lack of T lymphocytes. The phenotype “b” of biochemical loci “Pep3” is the unique characteristic that distinguish SU to Foxn1nu.

【Key words】Green fluorescent protein；Transgenic nude mice；Nude mouse；Inbred strain

綠色熒光蛋白 (green fluorescent protein，GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠(C57BL/6J-EGFP)具備綠色熒光的示蹤特性，是腫瘤研究中重要的工具小鼠,我國(guó)在2007年才有報(bào)告[1]。裸小鼠(Foxn1nu)由于先天性胸腺缺陷、T細(xì)胞免疫功能缺乏，是進(jìn)行人癌異種移植實(shí)驗(yàn)的良好宿主[2]。綠色熒光裸小鼠用于腫瘤移植實(shí)驗(yàn)，國(guó)際上主要見(jiàn)于美國(guó)加利福尼亞大學(xué)(University of California)的報(bào)告,但未明確所用綠色熒光裸小鼠的培育過(guò)程。在中國(guó)，閆寒等[3]2012年報(bào)告，對(duì)綠色裸小鼠用人癌移植實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其具有表達(dá)綠色熒光的同時(shí)還有免疫缺陷特征，但未對(duì)其遺傳性狀進(jìn)行檢測(cè)，不知是否達(dá)到近交系建系標(biāo)準(zhǔn)。張立波等[4]于2013年初步報(bào)告了綠色熒光裸小鼠的選育，按 GB/T14927.1-2001檢測(cè)13個(gè)生化位點(diǎn)表明，相關(guān)表型與BALB/c小鼠的遺傳概貌一致。本研究根據(jù)GB/T14927.1-2008對(duì)同源導(dǎo)入的第10代小鼠進(jìn)行了14個(gè)生化遺傳位點(diǎn)檢測(cè),非但達(dá)到了建立BALB/c背景的同源導(dǎo)入近交系的建系標(biāo)準(zhǔn),而且還以Pep3位點(diǎn)是b型而不是a型,有別于親本Foxn1nu裸小鼠的遺傳標(biāo)志,因而命名為Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU (Soochow University)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料和方法

1．1材料

雌性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)轉(zhuǎn)基因小鼠和雄性Foxn1nu小鼠均購(gòu)于南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所【SCXK(蘇)2010-0001】；獨(dú)立通風(fēng)籠架(蘇州馮氏)；生物安全柜(新加坡ESCO)；小動(dòng)物多模式活體成像儀(Kodak)；熒光電筒和眼鏡(Nightsea)，Ezup柱式動(dòng)物基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物有限公司)，PCR儀(AB公司)，流式細(xì)胞儀(BD公司)，Anti-Mouse CD19 PE-Cyanine7，Anti-Mouse CD3 APC(eBioscience)；小鼠60Co滅菌飼料和墊料購(gòu)于蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司(許可證號(hào)：蘇飼申(2009)05032)。

1.2繁育方法

種鼠飼養(yǎng)于本校實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心小鼠獨(dú)立送風(fēng)(IVC)系統(tǒng)內(nèi)【SYXK(蘇)2012-0045】。雌性C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)小鼠與雄性Foxn1nu小鼠雜交得F1子代均為有毛熒光小鼠，篩選其中的雌性小鼠，待其性成熟(>8周齡)后與親代雄性Foxn1nu交配(回交)得F2，產(chǎn)生F2子代性狀分離，篩選其中雌性有毛熒光鼠與親代雄性Foxn1nu回交，完成一個(gè)回交循環(huán)。此回交過(guò)程一共進(jìn)行10代，在F10子代中雌性有毛熒光鼠與雄性熒光裸小鼠雜交，篩選其中熒光亮度高的子代建立血緣擴(kuò)大群及生產(chǎn)群，作為近交系BALB/c背景熒光裸小鼠供相關(guān)實(shí)驗(yàn)用。

1.3鑒定

1.3.1表型孕鼠生產(chǎn)后，利用有無(wú)鼻毛的特征來(lái)辨認(rèn)新生仔鼠是否為裸小鼠、肛門(mén)與生殖器的距離辨別性別、熒光手電筒和眼鏡辨別是否發(fā)綠色熒光。

1.3.2基因型出生10 d前后剪尾(<0.5 cm)，在56℃熱水浴應(yīng)用蛋白酶K消化6 h，基因組DNA抽提試劑盒提取DNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)OD值，稀釋為100 ng/μL作為DNA模板；PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中PCR mix10 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA1 μL，94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，末次循環(huán)后72℃延伸7 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳，判讀結(jié)果。

1.3.3外周血淋巴細(xì)胞檢測(cè)心臟抽血，用流式細(xì)胞儀對(duì)Anti-Mouse CD19 PE-Cyanine7，Anti-Mouse CD3 APC進(jìn)行評(píng)估。

1.3.4微生物和遺傳學(xué)檢測(cè)按GB14922.1-2011、GB14922.2-2011和GB/T14927.1-2008標(biāo)準(zhǔn)分別進(jìn)行，其中遺傳生化位點(diǎn)委托中國(guó)食品藥品檢定研究院完成。

2結(jié)果

育成的Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU小鼠具有如下特性：①檢測(cè)的14個(gè)生化遺傳位點(diǎn)基因表型均為純合，有13個(gè)位點(diǎn)與BALB/c小鼠吻合，唯Pep3為b型，有別于Foxn1nu裸小鼠的生化遺傳標(biāo)記位點(diǎn)a型(表1)；②外周血常規(guī)檢測(cè)和流式細(xì)胞儀分型結(jié)果表明，T淋巴細(xì)胞明顯不足，符合T淋巴細(xì)胞缺乏的裸小鼠表型(表2，圖1)；③鼠尾組織RT-PCR、熒光手電配合眼鏡所見(jiàn)的幼體和成體鼠都能證明其高表達(dá)EGFP 和發(fā)強(qiáng)烈的綠色熒光(圖2,彩插6圖3)，兩種檢測(cè)方法的結(jié)果對(duì)鑒別是否表達(dá)EGFP或發(fā)綠色熒光是一致的，基于RT-PCR需要剪鼠尾組織，是一種創(chuàng)傷性檢測(cè)，已被熒光手電檢測(cè)替代而不作為常規(guī)檢測(cè)方法；④繁殖能力, Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU小鼠飼育在IVC內(nèi)，按SPF級(jí)別管理，定期抽哨兵鼠作微生物檢測(cè)進(jìn)行監(jiān)控。平均產(chǎn)仔數(shù)6～8只，離乳率100%，子代中裸鼠(Nu+/+)和有毛鼠(Nu+/-)比例基本為1∶1；毛發(fā)和外周血紅細(xì)胞以外的所有器官組織和細(xì)胞都發(fā)綠色熒光；6～8周齡成鼠體重22～30 g(彩插6圖4)。

培育的Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU小鼠能穩(wěn)定高表達(dá)親本C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)轉(zhuǎn)基因小鼠一樣的EGFP，同時(shí)又表現(xiàn)為親本Foxn1nu小鼠所特有的T淋巴細(xì)胞嚴(yán)重缺乏特征，適合做人類(lèi)腫瘤移植的小鼠。

表1　Foxn1 nu.B6- CAG- EGFP/SU生化位點(diǎn)

表2　Foxn1 nu.B6- CAG- EGFP/SU與BALB/c外周血血常規(guī)比較

注：Q1為B淋巴細(xì)胞群，前者比例為59.1%；后者比例為43.8%；Q4為T(mén)淋巴細(xì)胞，前者比例僅為0.3%；后者比例為43.2%。 圖1　Foxn1 nu.B6-CAG-EGFP/SU (A,B)與BALB/c(C,D)外周血淋巴細(xì)胞分選 Note：Q1：B lymphocytes(Foxn1 nu.B6-CAG-EGFP/SU 59.1% and BALB/c 43.8%)； Q4：T lymphocytes(Foxn1 nu.B6-CAG-EGFP/SU 0.3% and BALB/c 43.2%). Fig.1　The comparison of peripheral blood lymphocyte between Foxn1 nu.B6-CAG-EGFP/SU (A,B) and BALB/c(C,D)

注：M為標(biāo)志分子量,1號(hào)為陰性對(duì)照,2-5號(hào)為綠色熒光鼠， 上排為EGFP(～200bp)，下排為β-actin。 圖2　鼠尾組織EGFP的 RT-PCR電泳圖 Note:M:Marker；1: Negative control；2～5: EGFP mice； Upper row: EGFP gene；The lower row: β-actin. Fig.2　The RT-PCR results of mice tissue

3討論

同源導(dǎo)入近交系是通過(guò)雜交、自交和回交的方式形成一個(gè)與親本在一個(gè)很小的染色體片段上有所不同的新近交系，要求至少回交10代后的供體品系鼠基因只占受體品系鼠基因組總量的1%以下[5]。本文培育的同源導(dǎo)入近交系Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU的供體是C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)，繁育至F10時(shí)委托中國(guó)食品藥品檢定研究院隨機(jī)抽樣檢測(cè)，經(jīng)檢測(cè)，國(guó)家規(guī)定的14個(gè)生化位點(diǎn)的表型均為純合，其中有13個(gè)位點(diǎn)的基因表型與BALB/c背景完全一致，也與張立波等在2013年初的報(bào)告[4]吻合，然而在Pep3(肽酶-3)位點(diǎn)有b型與a型的區(qū)別(表1)。根據(jù)建立近交系小鼠的純合性(homozygosity)，同基因性(isogenicity)和個(gè)體性(individuality)要求來(lái)衡量這-結(jié)果,筆者認(rèn)為Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU在純合性方面屬于BALB/c來(lái)源,在同基因性方面,因Pep3 b型有別于BALB/c的a型，可把這一特征視作Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU的特異性基因，并作為一個(gè)新品系獨(dú)特的遺傳概貌。這一特征的來(lái)源有可能是導(dǎo)入CAG-EGFP基因產(chǎn)生的，由于Pep3所定位的基因位于小鼠1號(hào)染色體，新導(dǎo)入的EGFP基因是否也定位于此，有待今后驗(yàn)證。誠(chéng)然，這-假設(shè)還與C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)鼠育種是將EGFP基因?qū)氲降?4號(hào)染色體相矛盾，是否在本文同源導(dǎo)入時(shí)EGFP基因是隨機(jī)插入到1號(hào)染色體上了，也需要進(jìn)一步研究。

綠色熒光蛋白是從維多利亞發(fā)光水母中分離純化出來(lái)的一種能自主催化形成生色團(tuán)，并在紫外或藍(lán)光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光的蛋白[5]。經(jīng)過(guò)修飾的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白具有高度穩(wěn)定、熒光明亮、對(duì)活細(xì)胞無(wú)傷害等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已成為生物學(xué)各領(lǐng)域研究中應(yīng)用最廣泛的分子標(biāo)記工具之一[6]。自1997年Okabe等[7]采用慢病毒感染構(gòu)建出β-actin-EGFP轉(zhuǎn)基因小鼠以來(lái)，該小鼠在利用胚胎干細(xì)胞、骨髓間充質(zhì)細(xì)胞、類(lèi)胚胎干細(xì)胞等進(jìn)行的細(xì)胞移植研究中稱(chēng)其具有“無(wú)所不在”的示蹤價(jià)值[8-10]。隨后，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)除了心臟和骨骼肌幾乎都表達(dá)EGFP外，在大多數(shù)組織中EGFP “無(wú)所不在”的表達(dá)模式卻并不明顯，甚至在不同器官以及同一器官不同細(xì)胞之間都是廣泛多變的，其中腦就是EGFP陰性表達(dá)的器官之一[11-12]。這一不足，本文通過(guò)同源近交導(dǎo)入的EGFP基因，在選育過(guò)程中依靠熒光手電筒配合眼鏡方便地將發(fā)綠色熒光最強(qiáng)者納入育種，經(jīng)長(zhǎng)達(dá)3年余的篩選，終于得到包括腦在內(nèi)的全身各個(gè)臟器都表達(dá)EGFP的Foxn1nu.B6-CAG-EGFP/SU，被重點(diǎn)觀察的腦在熒光顯微鏡下，無(wú)論是組織還是細(xì)胞水平都有EGFP的表達(dá)，僅是表達(dá)強(qiáng)度有所不同而已,特別要指出的是富集神經(jīng)干細(xì)胞的海馬(彩插6圖4，6號(hào))和富有造血與免疫系統(tǒng)干祖細(xì)胞的骨髓(彩插6圖4，7號(hào))都是高表達(dá)EGFP細(xì)胞的發(fā)源地,將為與其相關(guān)的示蹤研究提供方便，本實(shí)驗(yàn)室利用該小鼠已完成了雙色熒光示蹤的人腦膠質(zhì)瘤血管來(lái)源、腫瘤微環(huán)境和間質(zhì)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等等系列研究[13-16]。

參考文獻(xiàn)：

[1]馮娟，高苒，全雄志，等．紅色熒光和綠色熒光轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào), 2007，15(4):267-270.

[2]黃強(qiáng),徐庚達(dá),杜子威,等．NC系裸小鼠的飼育與應(yīng)用[J]. 上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué), 1987,7(3):153-155.

[3]閆寒，賀曉玉，秦超，等．綠色熒光裸鼠的建立和驗(yàn)證[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2012,12(6)：62-64.

[4]張立波，劉彪，田小蕓，等.綠色熒光裸小鼠的選育初報(bào)[J]. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2013,34(4)306-309.

[5]Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G,etal. Green fluorescent protein as a marker for gene expression [J]. Science, 1994，263(5148): 802-805.

[6]Stauber R, Horie K, Carney P,etal. Development and applications of enhanced green fluorescent protein mutants [J]. Biotechniques, 1998,24(3): 462-471.

[7]Yee KK, Li Y, Redding KM,etal. Lgr5‐EGFP Marks Taste Bud Stem/Progenitor Cells in Posterior Tongue [J]. Stem Cells, 2013,31(5): 992-1000.

[8]Maria Cambuli F, Rezza A, Nadjar J,etal. Brief report: Musashi1‐eGFP mice, a new tool for differential isolation of the intestinal stem cell populations[J]. Stem Cells, 2013, 31(10): 2273-2278.

[9]Okabe M, Ikawa M, Kominami K,etal. Green mice as a source of ubiquitous green cells [J]. FEBS Letters, 1997, 407(3): 313-319.

[10]Ikawa M ,Yamada S, Nakanishi T,etal. Green miceand their potential usage in biological research [J]. FEBS letters, 1998, 430(1): 83-87.

[11]Biankin SA, Collector MI, Biankin AV,etal. A histological survey of green fluorescent proteinexpression in ‘green’ mice [J]. Implications for stem cell research. Pathology, 2007, 39(2): 247-251.

[12]Ma D-F, Tezuka H, Kondo T,etal. Differential tissue expression of enhanced green fluorescent protein in‘green mice’ [J]. Histology and histopathology, 2010,25(6): 749-754.

[13]吳自成，黃強(qiáng)，邵義祥，等. 人腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞移植于表達(dá)綠色熒光蛋白裸小鼠的研究[J]. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2008, 88(33)：2317-2320.

[14]Dong J, Zhang QB, Huang Q,etal. Glioma stem cells invoived in tumor tissue remordeling in a xenograft model [J].J Neurosurg 2010, 113(2):249-60.

[15]Dong J, Zhao YD , Huang Q ,etal. Glioma Stem/Progenitor Cells Contribute to Neovascularization via Transdifferentiation [J]. Stem Cell Rev and Rep 2011 ,7(1):141-152.

[16]Dong J , Dai Xl, Lu ZH,etal. Incubation and application of transgenic green fluorescence Nude mice in visualization studies on glioma issue remodeling [J]. Chin Med J 2012,125(24):4349-4354.

〔修回日期〕2014-12-03